细说菌落总数检测及其控制方法

细说菌落总数检测及其控制方法

菌落(colony)是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。

菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(mL)或表面积(clni)内，、所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。

菌落总数的测定

测定食品中菌落总数时，是将食品检样做成几个不同的10倍递增稀释液，然后从各个稀释液中分别取出一定量在平皿内与营养琼脂相混合，经培养后，按一定要求计算出皿内琼脂平板上所生成的细菌集落数，并再根据检样的稀释倍数，计算出每g或

m L样品中所含细菌菌落的总数。

菌落总数测定中的一些要求和规定

为了正确地反映食品中各种需氧和兼性厌氧菌存在的情况，检验时必须遵循以下一些要求和规定：

(一)所用器皿及稀释液：

1．检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。

2．用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。

3．检样的稀释液虽可用生理盐水或磷酸盐缓冲液，但以用磷酸缓冲盐水为合适，因为磷酸盐缓冲液对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。如果对含盐量较高的食品(如，酱品等)进行稀释，则宜采用蒸馏水。

(二)检样稀释：

1．检样稀释时，应以无菌操作称取(或量取)有代表性的样品25g(或mL)剪碎放于含有225m L灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预

置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成l:10的稀释液。如，系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与

稀释液同置于灭菌均质器杯或拍击式均质袋中，使做成均匀的1:10稀释液。

2．根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述1:10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取

1:10稀释液1mL与9m L稀释液混和做成l:100的稀释液，然后

依次递增稀释，做成1:1000、1:10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换1支lm L灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。

3．从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。

4．在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液砸 2.5c m；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。

5．当用吸管将检样稀释液加至另一装有9m L空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。

(三)平板接种与培养：

1.将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lm L稀释液加入皿内(从皿侧加入，不要揭去皿盖)，最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应作2个平皿。

2.用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使融化，并保温于45±1℃恒温水浴中待用。倾注平皿时，每皿内倾入约15~20m L，最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。

3.为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。

4.检样与琼脂混和时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反的方向旋转，以使充分混匀。旋转中应加小心，不要使混和物溅到皿边的上方。为了保证混和均匀，而不溅及皿边的上方，可使用自动平皿旋转仪，直接将加有检样的平皿放在旋

转仪上(可同时放4只平皿)，加入琼脂后，开动电钮，在数十秒钟内即可自动左右旋转而使皿内的检样与琼脂混合均匀。

5.皿内琼脂凝固后，不要长久放置，然后始翻转培养，而应于琼脂凝固后，在数分钟内即应将平皿翻转予以培养，这样可避免菌落蔓延生长。必要时，可先将皿打开倒置(皿底向上)于温箱内经15~60分钟使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置于温箱内培养。这样可以阻止运动性强的变形杆菌属、假单胞菌属和芽胞杆菌属中一些菌株在琼脂表面扩展生长。

6.为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有l无受到来自空气的污染。

7.培养温度：

应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。培养时间为48±2小时。培养温度和时间之所以有这种不同的区分，乃是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。

(四)对照试验：

1.加入平皿内的检样稀释液(特别是10:1的稀释液)，有肘带有食品颗粒，在这种情况下，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与琼脂混和的平皿，不经培养，而于4℃环境中放置，以便在计数检样菌落时用作对照。

2.为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆，也可在已溶化而保温于45℃水浴内的琼脂中，按每100ml加l mL，0.5％氯化三苯四氮唑(2，3，5tri p he ny lt et ra zo liu m c hl or id e，T TC)水溶液之量加入适量的TT C。培养后，如是食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落，配好的T TC溶液，应先用来与不加TT C 的作对照，以观察其对计数是否有不利的作用(T TC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用)。T TC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。无色的T T C是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后，在细菌脱氢酶的作用下，TT C便接受氢而成为红色的三苯基甲艏(f orm a za n)，使菌落呈现红色。

(五)菌落计数：

1.从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情

况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。

2.计数菌落时，应选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定的标准。1个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数；如其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。如在一个稀释度的两个平板中，一个平板的菌落数在30～300之间，另一个大于300或小于30时，则以菌落数在30～300间的平板作为计数的标准。

3.注意事项：

(1)如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌

落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验室事故。此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据。

(2)如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细菌块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。

(3)如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可计作报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2cm2个，除2求出每cm2内平均菌落数乘以皿底面积63.6c cm2数，再乘其稀释倍数作报告。例如10-1～10-3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在lO-3稀释的平板上任数2个cm2内的菌落数是60个，皿底直径为9c m，则该检样每g(或m1)中“估计”菌落数为：

60/2*63.6*1000=1908000或 1.9*106。

63.6cm2数系按皿底直径为9c m时计算而得，即：(9/2)2×

3.14=63.6；如所用平皿的皿底直径不是9c m，则可按其直径的

实际c m数代人圆面积公式求出。

(4)菌落计数中，也可以选用菌落计数器则比较方便，灯光由侧面射向平板，菌落易于观察。由于仪器带有电子音响讯号，用特制金属探笔点数中，在发出音响之下始显示数字增加，不会发生差错。且灯光与平板之间夹有多用方格玻质规板(方格面积为1cm2)，也有助于对菌落密布的平板进行计数。