禽白血病病毒AB亚群抗体检测方法

禽白血病病毒（A亚群和B亚群）抗体检测酶联免疫吸附法

1. 目的范围

检测鸡血清中禽白血病病毒（A亚群和B亚群）抗体，为禽白血病综合防控提供依据和参考。适用于鸡血清中禽白血病病毒（A亚群和B亚群）抗体的检测。

2.依据

《禽白血病诊断技术》（GB/T 26436-2010）;

禽白血病病毒抗体检测试剂盒说明书（美国IDEXX公司）。

3.检测原理

将病毒抗原包被在96孔酶联免疫反应板上，加入被检样品后，如样品中含禽白血病病毒（A亚群和B亚群）的抗体，就会与病毒抗原结合形成抗原抗体复合物。加入洗板液后，洗掉没有反应结合的物质。在孔中加入可与鸡禽白血病病毒（A亚群和B亚群）的抗体结合的酶标二抗，通过洗板后，将没有结合的酶标二抗洗掉。加入底物后，通过孵育显色，显色强度与被检样品中禽白血病病毒抗体（A亚群和B亚群）含量正相关。

4.仪器设备

4.1 量程为100μL的单道移液器和300μL的八道或十二道移液器；

4.2 酶标仪；

4.3 自动或手动洗板系统；

4.4 稀释用96孔板；

4.5 一次性移液器吸头；

4.6 1000mL量筒；

4.7 吸水纸。

5.试剂和样品

5.1 试剂盒组成

5.1.1 酶标板：ALV抗原包被板5块（96孔/块）

5.1.2 酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的（羊抗）鸡抗体1瓶（50mL）

5.1.3 阳性对照：稀释的鸡抗ALV抗体，叠氮钠防腐1瓶（1.9mL）

5.1.4 阴性对照：稀释的鸡血清，不与ALV反应，叠氮钠防腐1瓶（1.9mL）

5.1.5 样品稀释缓冲液，叠氮钠防腐1瓶（235mL）

5.1.6 TMB底物溶液1瓶（60mL）

5.1.7 终止液1瓶（60mL）

5.2 纯水或超纯水

5.3 样品准备：检测前用样品稀释液将被检样品进行500倍稀释（如：1μL的样品用样品稀释液稀释到500μL）。

6.操作步骤

使用前所有试剂应恢复至室温（20~25℃），将其振摇混匀后再进行使用。

6.1 取出酶标板并标记好被检样品的位置。

6.2 加样：加100μL阴性、阳性对照（不需稀释）和稀释的被检样品到板的相应孔中，加盖室温孵育30min。

6.3 洗板：甩去各孔的液体，每孔加入约350μL的纯水或超纯水进行洗板。第一次加入纯水后浸泡2min，甩去各也的液体，再重复洗板4次（无需浸泡）。在吸水纸轻拍使之吸干。注意在加下一种液体前不要让板干燥或放的时间太长。

6.4 加酶标抗体：每孔加入100μL酶标羊抗鸡抗体，室温孵育30min。

6.5 洗板：重复步骤6.3.

6.6 加显色液：每孔加入100μL的TMB底物，室温下孵育15min。

6.7 加终止液：每孔加入100μL的终止液终止反应。

6.8 读数：测定并记录各孔在650nm下的吸光度值。

7 结果判定

7.1 试验结果同时符合下列条件，方为有效：

7.1.1 阳性对照OD值的平均值和阴性对照OD值的平均值的差值大于0.075。

7.1.2 阴性对照平均值小于或等于0.150。

7.2 判定：

阳性对照和样品的OD值应经阴性对照OD值校正。阳性对照：OD阳－OD阴，样品：OD样－OD阴；S/P=(OD样－OD阴)/（OD阳－OD阴）。

S/P比值小于或等于0.40，判为阴性。S/P比值大于0.40（抗体滴度大于844），判为阳性，表明已感染了禽白血病病毒（A亚群和B亚群）。

8 注意事项

8.1 试剂盒保存温度2~8℃，所有组分在使用前应平衡至室温（20~25℃），回温时间2h 以上。

8.2 吸取不同的血清样品要更换吸头。

8.3 加液时应使用移液器并经常校对其准确性，以减少检验误差。

8.4 待检血清样品数量较多时，应使用八道或十二道微量移液器，从稀释板转移到反应板中，以便缩短加样时间。

8.5 洗涤时各孔均需加满洗涤液，防止因洗涤不充分造成非特异性显色。

8.6 结果判定必须以酶标仪读数为准，加终止液反应后应在10min内测定其OD值。

8.7 如没有650nm

8.8 对所使用过的材料在遗弃之前需净化处理，可以浸泡在新配制的5%次氯酸钠（1h 以上）或在120℃高压灭菌至少1h。

8.9 不同批次的试剂不能混用，不要使用过期的试剂。

8.10 不要将TMB底物液暴露于强光或任何氧化剂条件下。

8.11 所有的试剂应避免接触皮肤和眼睛，如果碰到，应立即用自来水冲洗接触处。

8.12 试剂盒部分组分中含有叠氮钠防腐剂，在遗弃前，需要用大量的水冲淡，以防形成叠氮化铜或叠氮化铅（这两种物质在受压条件下易爆炸）。