常见细胞实验流程
实验前准备
●根据自己实验的情况提前预定超净台
●进入细胞室之前必须穿鞋套，戴手套
●将实验所需要的实验仪器放入超净台内紫外照射灭菌15-20min
高压灭菌操作
1.将所需灭菌的枪头，EP管等仪器放入枪头盒或饭盒中，并用报纸将枪头盒包
好。
2.将仪器放入灭菌锅之前，首先要检测一下锅内的水位是否超过锅底的圆圈，
若没有超过则需加水。
3.检测水位之后，将包好的器材放入锅内，盖上锅盖并拧紧螺丝。
4.插上电源，先将电压调至250V，目的在于排尽锅内的空气，（当排气阀有白
气冒出时，说明空气已排尽）空气排尽后，关闭排气阀。
5.关闭排气阀后指针上升，当指针竖直时，将电压调至125V，保持锅内压力的
稳定。
6.开始计时，灭菌30min。结束时关闭电源，等至指针慢慢降下即可。
7.拿出锅内的器材放入恒温烘箱中烘干，2天后即可拿出。
（组织内）蛋白质提取过程
1.对癌组织和癌旁正常组织进行称重，记录数值。
2.根据RIPA裂解液Ⅲ说明书（每100mg组织中加入1ml溶液A，1ul溶液B，
5ul溶液C）按照组织块得大小配好ABC混合液。
3.将组织块加入匀浆器中，并加入相应量得ABC混合液，冰上静置5-10min，
开始研磨。
4.将研磨好的组织液倒入事先准备好的EP管中，12000rpm/5min.
5.离心结束后，收集上清液，弃去沉淀，上清即为所要的蛋白。
蛋白质浓度测定
1、取96孔板冲洗干净后超声处理30min,之后用去离子水冲洗干净烘干即可
2、配制BCA标准蛋白液：
浓度原液体积去离子水体积
A管：2000ug /ul 30ul 0ul
B管：1500ug/ul 37.5ul 12.5ul
C管：1000ug/ul 25ul 25ul
D管：750ug/ul 18.75ul 31.25ul
E管：500ug/ul 12.5ul 37.5ul
F管：125ug/ul 3.125ul 46.875ul
G管：25ug/ul 0.625ul 49.375ul
H管：0 0ul 50ul
●取8个EP管，分别标上以上字母，并按上表加入相应的原液蛋白和
去离子水
●先向96孔板内加入200ul的绿色底物溶液（根据实验计算所需要用
孔的个数加入底物液）
●加完后，将配好的A,B,C,D,E,F,G,H标准液10ul按照96孔板上第1列
上的字母标记依次加入
●之后在其他的孔内加入10ul蛋白样品（每个样品应重复2次）
●加好样品后取保鲜膜将96孔板封闭好，以防止蛋白浓度发生变化，
之后将板放入保温箱中静置30min
●30min后将96孔板拿出放入测量仪器内（应按照仪器使用说明进行
操作）
●数据测完后另建文件夹，保存数据，之后插入尤盘拷取数据
●在获得的数据结果中，根据BCA的标准蛋白浓度梯度值和560nm下
对应的OD值计算可得出一个OD值与浓度相关的标准曲线：
y=ax+b（计算机上操作）
●将测得的蛋白样品的OD值带入公式，即可求出蛋白样品的浓度
●若实验有实验组和对照组，应将两组的蛋白浓度标准化，即是两组
的蛋白浓度相同（相同浓度下的两组实验才具可比性）
●将浓度标准化的样品蛋白与loading buffer 混匀至100ul（混合液中
loading buffer应为1X的，但实验室的一般为5X），稀释方法：取
20ul 5Xloading buffer +80ul 样品蛋白混匀即可
●在加样做western blot之前，蛋白样品需变性：
将与loading buffer混匀好的蛋白样品放入100度金属浴内高温变
性10min（EP管上要加帽以防止温度过高EP管盖会冲开）
（组织内）RNA提取过程
1.将组织放入匀浆器中，加入1ml的Trizol，冰上静置10min，进行研磨。
2.将匀浆好的上清转移至1.5ml EP管中，进行离心12000rpm/5min.
3.离心后收集上清液于新的EP管中，加入200ul氯仿，剧烈摇匀后静置
5min，然后12000rpm/5min.
4.离心后取上清于另一新的EP管中，取液时不要取到中间层的蛋白。之后
按1:1的比例加入异丙醇，摇匀后静置15min，进行离心12000rpm/10min。
5.离心后倒掉上清（可看到白色RNA沉淀），加入1ml 75%乙醇DEPC水溶
液温和震荡，悬浮沉淀，3000rpm/5min.
6.倒掉上清，在滤纸上空干。然后加入20ul DEPC水溶解沉淀，并吹打均
匀。（如果RNA量较多，可相应的加更多的DEPC水，40ul 甚至60ul）7.测定RNA浓度，取1ul RNA+99ul DEPC水于EP管中（相当于稀释100倍），
另取一EP管放100ul的DEPC 水用于定标。定标后倒掉，用去离子水冲洗比色皿，然后测定RNA OD值和浓度，记下数据。
8.RNA电泳（用于检测提取的RNA是否已降解）
●配胶(1%的胶)：取0.2g 琼脂糖+ 20ml TAE +1ul EB
●制胶时，应让液体沸腾3次，冷却后加入EB混匀（每20ml加1ulEB）,
胶制好后倒入板中凝固，并垂直地插入梳子，静置30min 后拔下梳
子（可提前用梳子划动下胶，使得胶更均匀）。
●取1ul的Loading buffer和样本RNA混匀，加样
正确的电泳结果应有3条带：28S 、18S、5S。28S亮度应为18S亮度的
2倍，5S条带越宽越代表RNA降解越多。如果加样孔内有残留代表蛋白污染，如果离加样孔很近的地方有条带代表DNA污染。
细胞冻存
●首先向培养瓶内加入胰酶（1ml）消化细胞
●显微镜下观察细胞形态，当细胞变圆脱落时，即可用适量培养基中止消
化，之后将细胞液吸入15ml的管内（动作要快，防止胰酶损害细胞）●将管内1/3的细胞液放回培养瓶继续培养（剩余的细胞液平均冻存两管）●离心剩余的细胞液，1200rpm,5min（用等量的PBS配平）
●离心后弃上清，得白色沉淀。可在试管台上轻轻来回划动试管，使得沉
淀松动更易于悬浮
●用配好的3ml冻存液悬浮沉淀，吹打混匀，使得细胞为单个细胞
●分别取1.5ml放入两冻存管内，在冻存管上做好标记：细胞类型，代数，
日期等
●标记好后4°冰箱放置30min（切勿超过30min），计时
●之后-20°冰箱中放置30min
●最后放入-80°冰箱内可保存半年。若半年后还没有使用则需要将细胞拿
出来复苏，长满后再冻存起来。
●冻存液的配制方法：
血清（20%）+DMSO（10%，超净台上锡纸包裹的）+培养基（70%）
例如配3ml冻存液：
血清=600ul；DMSO=300ul；培养基=2100ul
细胞复苏
●将实验所需要的仪器提前放入超净台内紫外灭菌15-20min
●在整个复苏过程中冻存的细胞都应保持在37°水浴中
●烧杯中放入37°水，将从冰箱内拿出的细胞用镊子夹住放入烧杯内摇晃
使细胞慢慢融化
●细胞融化后，用酒精浸湿的纸擦干冻存管
●之后在超净台内将细胞液吸取到放有适量（例10ml）PBS的15ml管内吹
打均匀（在取细胞之前提前在管内倒入PBS）
●1200rpm，5min离心，离心后弃上清得沉淀
●将得到的细胞沉淀用适量的培养基悬浮，并吹打均匀，使细胞单个存在●吹打均匀后，用吸管将细胞液吸入培养瓶中（大/小培养瓶根据自己的实
验而定）
●最后向培养瓶内加入适量的培养基
●显微镜下观察细胞情况
●最后将培养瓶盖子拧松，放入37°培养箱培养
Western Blotting
Western blot 实验过程中所需要配制的试剂:
● 1 X TBST: （用于洗膜）
100ml 10X TBS +900ml 去离子水+1ml Tween 20
●5%牛奶：
取5g牛奶溶于1000ml 1XTBST中混匀
●1X Running: （用于跑电泳）
10XRunning 100ml 溶于900ml 去离子水中
●1X transfer: （用于转膜）
10XTransfer 100ml +100ml无水甲醇+800ml去离子水
●一抗：
用5%牛奶将一抗稀释2000倍（稀释倍数根据自己实验而定），若抗体由
甘油保存，稀释一抗应取所计算体积的2倍。
●二抗：
用5%牛奶将二抗稀释10000倍（牛奶封闭性更好）
具体操作流程：
1.清洗玻璃板
●一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都要洗净，
之后先用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗干净，立在桌面上晾干。
2.配胶（区别于RNA 电泳胶）
●玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
●先按照10% Gel （10ml）比例配下层的分离胶，加入TEMED后立即摇匀
即可灌胶。
●灌胶时可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃缓慢放出，待胶面升到绿带中间线
高度即可，然后加入100ml异丙醇封闭
●静置等待胶凝固，（若试管内剩余的胶凝固代表玻璃板内的胶已经凝固
了）凝固后倒掉异丙醇，用去离子水冲洗干净，并用吸水纸将水吸干，
并避免刮破胶
●再按照5ml的比例配上层的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀后即可灌胶。
将配好的胶灌满剩余的空间，之后垂直缓慢地将梳子插入浓缩胶中，避免产生气泡
●胶凝固后即配胶结束
配胶注意事项：
●若配好的胶不立即使用，可以保存在4度冰箱内，但保存时间不宜过长
（用卫生纸包裹玻璃板，浸湿卫生纸，放入一次性塑料手套内即可，此
时不要拔下梳子）
●蛋白胶分为两层，上层为浓缩胶，下层为分离胶。
●按照10% Gel的方法进行配胶。注意：选择玻璃板时要看清玻璃板上的
大小标记，一般用10ml的。玻璃板一定要用去离子水洗干净，之后室温
晾干。
●浓缩胶和分离胶配制所用Tris-Hcl的PH值是不同的，分别为7.8和6.8
3.跑电泳与上样
●配制（1000ml）1XRunning 电泳缓冲液：（实验室现有的是10X）
取100ml 10 X Running 缓冲液溶于900ml 去离子水中即可得到1XRunning 缓冲液
●将配好的胶板放在电泳槽内，注意正负电极的准确连接，两手分别捏住
梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出
●倒入配好的电泳缓冲液，若使用的是两块胶，加入的电泳液液面应超过
“2Gel”字符线（电泳液也要灌满玻璃板）
●加蛋白上样量：测完蛋白含量后，计算含20-50ug蛋白（根据自己的实
验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。
●用10ul枪头进行加样，将枪头插入加样孔缓慢加入样品，加样过快的话
容易使样品冲出加样孔（注意同一实验和对照组所加的上样量应该相等，这样才具有可比性），同时加入2-3ul Marker作为条带分子量大小的对照
●加样完毕后，盖上电泳槽盖，连接电源，先调电压至120V，按start开
始跑电泳
●当样品被压成同一水平的线时，可以降低电压至100V或80V左右，电
泳至样品内的溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，关闭电源，进行转膜
4.转膜
●转膜前先用镊子捏住两张硝酸纤维素膜的一边浸泡在无水甲醇中
●配制1X transfer（转膜缓冲液）：
取10x transfer 100ml +100ml无水甲醇+100ml去离子水混匀即可
●将转膜液倒入搪瓷盘内，并放入转膜所需的夹子（夹子具有黑白两面）、两
块海绵垫（海面上带有滤纸）、小绿板和浸过的膜
●将夹子打开使黑的一面位于底部保持水平，在其上垫一张海绵垫，用小绿板
来回擀几次排除其内的气泡。
●要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，除去小玻璃板后，将浓缩
胶用小绿板轻轻刮取，要避免不要把分离胶刮破。
●小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用小绿板擀去
气泡。
●之后将另一海绵垫平铺在胶上，用手压住，并用小绿板赶走气泡，注意动作
要轻柔，避免胶与膜发生错位。
●气泡赶净后就可以合起夹子（整个过程都要在转膜液中进行）。
●另外一块胶按照形同的过程进行操作
●之后将夹子放入转移槽中，要使黑色的面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红
面。
●由于在转膜的过程中会产生热量，所以将整个转膜槽放入装有冰块的桶内进
行。
●插上电源，调电压至80V，转膜2h（转膜时电极方向注意是膜正胶负）
●转膜结束后，可看到膜上有明显的Marker条带，用丽春红染色液让膜显色，
之后可以看到膜上蛋白的条带
●将膜放入一平皿内于摇床上脱色，放入1xTBST洗三次，每次10min。
●若事先知道目的蛋白的分子量，可以用保鲜膜将膜包裹，之后将膜修剪
●脱色之后，用牛奶对膜过夜封闭或封闭1h（4度冰箱内的摇床上过夜）
●封闭后，用TBST洗3次，每次10min
●加一抗2h（若牛奶封闭1h,可以加一抗过夜）
●用1xTBST洗3次，每次10min
●加二抗，封闭1h
●用1xTBST洗3次，每次10min
5、曝光成像（曝光过程要在黑暗中进行，因为X-光片不能见光）
●最后一次冲洗膜时不要将TBST倒掉，以防止曝光过程中膜会变干
●取A和B两种显色液500ul分别于两个EP管中
●将曝光所需要的仪器：红外灯、保鲜膜、胶带、黑色板提前准备好，放在暗
房的桌上。
●用胶带将适宜大小的保鲜膜贴在黑色板上，先将膜放在塑料片上，混匀A,B
显色液后滴加到膜上，观察膜是否发出荧光（发出荧光代表膜上有目的蛋白）●当膜发出荧光时，将膜转移至黑板上的保鲜膜上，用膜盖好，在其上放一张
X-光片（根据膜的大小将光片裁剪成适宜的大小，以节约利用），压紧黑色板几分钟（根据膜发出的荧光强度定，荧光强的话一会即可，弱的话可多压几分钟）
●压好后，将X-光片迅速放入显影液中显影，显影时间一般为1～2min，待出
现明显条带后，即刻终止显影。
●显影结束后，马上把光片放入定影液中，以胶片透明为止
●最后将光片放入自来水中清除残留的定影液，之后室温下晾干。
注意：
●显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会
对结果产生影响。
●显色液A,B和X-光片都要避光
6、凝胶图像分析：将胶片进行扫描成像，保存图形。
细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
1、先用1ml胰酶消化细胞，当显微镜下细胞变圆时即可用培养基中止
2、取10ul细胞悬液于一1.5mlEP管内，之后加10ul蓝色显色液混匀
3、将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
4、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静
置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
5、计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：
（细胞悬液的细胞数）/mL＝（4个大格子细胞数/4)×2×104
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而 1mL＝1000mm3
细胞计数要点：
●要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
●取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每
次取样都要混匀，以求计数准确。
●数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照1个细胞
计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不
计左线。
●操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要
重新计数。
●初学者易犯的错误：计数前未将待测悬液吹打均匀。滴入细胞悬液时盖
玻片下出现气泡。滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
细胞培养（换液与传代）
细胞换液：
（当培养瓶内的培养基由红色变为黄色时应该换液）
●脚穿鞋套，手带手套方可进入细胞房
●将一次性吸管、试管、签字笔等实验所需的器材提前放入超净工作台内UV
照射灭菌10min左右
●同时将配制好的培养基（1640）放入37度水浴锅内
●照射结束后，关闭紫外线，打开吹风橱
●从37度常温培养箱内拿出，用酒精浸湿的卫生纸擦拭培养瓶口一周，之后
放入超净工作台内
●拧开培养瓶盖子，倒掉培养液，之后倒入适量的PBS冲洗并去除培养瓶内的
残留代谢物，之后倒掉
●用一次性吸管吸取适量培养基（培养基液面没过瓶底部一点即可，大约
4-5ml）加入培养瓶内，注意加培养基时不要对着培养瓶的底部吹打，防止将细胞吹落
●加完培养基后，拧紧盖子，放在显微镜下观察，之后再用酒精擦拭瓶口
●将培养瓶放入培养箱之前拧松瓶盖，之后放入培养箱内培养
●对于培养的细胞，一天看一次即可，不要经常性的挪动细胞从而影响细胞的
贴壁生长
●实验结束后应做好卫生清洁工作，用酒精擦拭干净工作台并打开紫外照射
细胞传代
（当培养瓶内的细胞长满而又进行冻存时需要将细胞传瓶）
●准备实验如前所述-----另外也将胰酶放入水浴锅内
●将培养瓶放如超净台内，倒掉培养基，加入适量的PBS冲洗一次
●加入1ml胰酶摇匀，在显微镜下观察细胞的形态，当细胞变圆时应立即用适
量培养基终止消化，之后可以用吸管吹打未脱落的细胞
●将细胞液用吸管吸至15ml管内，1000rpm离心5min
●弃上清，得沉淀
●将沉淀在板上来回的划动使沉淀松动，之后加入培养基悬浮沉淀更容易得到
单个的细胞
●将细胞悬液吹打均匀后，平均分至两个培养瓶内，并加入适量的培养基
●之后拧松培养瓶盖子，放入培养箱内培养
RT—PCR（逆转录，两步合成法）
第一步：cDNA链的合成
●取已提取好的total RNA/mRNA X ul至小EP管内，使得RNA的量保持在
50ng-5ug 或者5-500ng的范围内
Total RNA/mRNA: Xul
●之后根据说明书的步骤一次加入:
引物：
Anchored Oligo(dT)18 (0.5ug/ul): 1ul
Or Random Primer (N9)(0.1ug/ul): 1ul
Or 加入GSP: 2pmol
混合液：
2X TS Reaction Mix : 10ul
Trans Script TM RT/RI Enzyme Mix: 1ul
最后加入RNase-free Water定容至：20ul
注意：
1.如用Anchored Oligo(dT)18或gene 特异性引物（GSP），
42°孵育30min；如用Random Primer，25°孵育30min
2.85°加热5min,失活Trans Script TM RT/RI Enzyme
●以上所有试剂混合均匀后，将小EP管放入PCR仪内，先检测EP管是平管还
是圆管，并将PCR仪上的热盖调至相应位置（圆/平）
●之后在PCR仪上输入单元：2 ；单元节：1
●根据说明书输入实验反应条件：
单元1：42°孵育30min/ 25°孵育30min
单元2：85°加热5min,失活
●创建并命名自己的新文件夹，保存（下次做相同条件的实验时可直接选择文
件夹，不需要另外重新设置实验条件）
●点击Run，开始运行
第二步：PCR反应合成DNA
●取1//10—1/5体积（2-4ul）的第一步反转录cDNA产物至小EP 管内，作为
PCR反应的模板
●根据说明书一次加入：
Forward Primer (10um): 1ul
Reverse Primer (10um): 1ul
2X Tans Script TM Hi Fi PCR Super Mix: 25ul
最后加入ddH2O至50ul
●PCR仪上设置PCR循环，设置单元：3
单元1：94°2-5min , （单元节1）
单元2：94°30s （单元节1）
50-60°30s （单元节2）
72°1-2kb/min （单元节3）
单元3：72°5-10min （单元节1）
●点击Run，开始运行
注意：
1.小EP管壁上的液滴要离心至管底
2.退火温度要根据自己所设置的引物而定
3.检测EP管是平盖还是圆盖，以选择不同的设置
DNA电泳（检测PCR产物DNA含量及准确性）：
●配1%电泳胶
称取0.2g Agrose溶于20ml 1X TBA（于烧瓶内）
●将烧瓶放入微波炉内高温加热溶解琼脂糖
●当瓶内的液体清晰可见没有颗粒时即为完全溶解
●等待溶胶的自然冷却，冷却后加入1ulEB，混匀
●之后叫溶胶倒入电泳板内，垂直地插入梳子、
●静置，等待胶凝固
●凝固后，将胶放入电泳槽内，内有电泳buffer，垂直的拔出梳子
●取10-15ulDNA与1ul的DNA loading buffer混匀
●加上样
●连接电源，将电压调至90-120V
●根据EB 的位置判断电泳的进程
●电泳结束，关闭电源
获取DNA电泳图：
●电泳结束后，将凝胶放入仪器内，选择UV
●打开电脑即可获得电泳结果图，根据电泳条带的亮度判断PCR产物的含量
细胞划痕实验流程
一、准备实验材料：
●6孔板（其它的也可以，根据自己实验而定）
●直尺
●marker笔
●20微升枪头（灭菌）
●无血清培养基
●PBS、
二、紫外照射灭菌
将实验中所用到的实验器械以及直尺和marker笔等提前放入超净台内紫外照灭菌30min
三、实验流程
●先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm
一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。（每孔3条即可）
●在孔中加入约5 x 105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握细胞过夜
能铺满。
●第二天（或等细胞长满时）用枪头（小枪头）比着直尺，尽量垂至于背后的
横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜，划3条。
●之后，用PBS洗细胞3次（动作要轻柔，以免将长满的细胞冲掉），去除划
下的细胞，加入无血清培养基。
●将六孔板放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，不
同倍数下进行拍照。（每次拍照时所选取的角度要相同）
实验室常用菌株及特性
一、实验室常见菌株简介 Xl1-Blue菌株 基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F?[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。 特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。 用途：分子克隆和质粒提取。 BL21(DE3)菌株 基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。 特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达。 BL21(DE3)ply菌株 基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cm R)。 特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达 DH5α菌株 基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ– 特点：一种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC 载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 JM109菌株 基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F? traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。 特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑 筛选。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 DH10B菌株 基因型： F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ- The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B 。 host for pUC and other α-complementation vectors; pBR322
细胞迁移侵袭实验操作步骤
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
实验室常用细胞株
ATCC? Number: CRL-2865? Price: $329.00 Designations: T47D-KBluc Depositors: VS Wilson Biosafety Level: 1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties: adherent Organism: Hom o sapi ens (human) Morpholog y: epithelial Source: Organ: mammar y gland; breas t Tissue: duct Disease: ductal carcinoma Derived from metastatic site: pleural effusion Cell T y p e: epithelialtransfected with reporter plas mid Permits/F orms: In addition to the MTA menti oned above, other ATCC and/or regulatory per mits may be required for the transfer of this ATCC material. Any one purchasing ATCC material is ultimatel y r esponsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the s pecific requirements for shipment to your loc ation. Reverse Transcript: N Age: 54 years adult HeLa Mar kers: N
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
细胞实验操作流程
细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
实验室细胞株管理规定
细胞株管理规定 一、什么是细胞株？ 原代代培养物经第一次传代培养后的细胞，常被称为细胞系（cell line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系有一定差异的细胞系，常被称为该细胞系的亚系（subline）。 从一个经过鉴定的细胞系采用选择法或单细胞克隆进一步所得到的细胞群，常被称细胞株（cell strain）。由原细胞株进一步分离培养出的与原株性状不同的细胞群，又被称为亚株（substrain）。 二、细胞株管理规定 对已建立和经过鉴定的细胞株要进行严格管理，规定如下： 1.制度管理规定 A.细胞株应有专人负责保管，并由实验室负责人监督检查。更换保管人时应提 前做好工作交接，确保使用安全。 B.建立细胞株使用登记制度，记录细胞株的编号、名称、来源、冻存数量及日 期、取用数量及日期、剩余数量及保存方法。 C.细胞株长期保存应放置于液氮罐中，短时保存或过渡保存可置于-80℃冰箱 中。 D.保存的细胞株应定期复活、保种，即每半年对没有复苏过的细胞株进行维护， 复苏、培养和保存，并详细记录细胞株状态，如形态、生长速度、抗体分泌情况等。 E.细胞株不得外借，不得随便带出实验室。 F.细胞株的使用、保存、转移和销毁应符合相关部门的有关规定。 2．使用流程规定 A.如有新细胞株进入实验室，需告知实验室负责人并进行冻存保种； B.实验室人员需复苏细胞时，需提前向实验室负责人申请，经批准后方可复苏； C.设存取记录表，实验人员存取细胞时做好记录并把细胞复苏情况反馈至实验
室负责人，实验室负责人需监督实验人员做好细胞株使用记录情况； D.若复苏细胞人员复苏同一株细胞株两次均未成活，需通知负责人进行检查和 复苏，如贮存细胞确实出现问题，则及时清理。 三、细胞保存 A.冻存条件：90%FBS+10%DMSO，4℃冰箱预冷； B.冻存方法： 4 ℃（30-40min）→-20 ℃（1-2h）→-80 ℃（过夜/24 h以上，可短时保存 1-3个月）→液氮（永久保存； C.填写冻存记录表 四、细胞复苏 A.水浴锅37℃预热 B.从细胞冻存管理表中查找并记录所需细胞在液氮罐中的位置。 C.液氮罐中快速取出细胞，迅速放入水浴锅中融化，并持续晃动，避免因受热 不均产生冰晶，损伤细胞，融化时间为1～2min； D.将细胞悬液移至离心管中，加入10倍体积的细胞培养液，混匀； E.1200rpm/min，离心5min F.弃去上清液，加入新的培养液重悬，移至细胞培养瓶中，显微镜下观察细胞 形态，37℃培养箱培养。 G.次日，更换培养液继续培养，待其铺满培养瓶面积80%及以上，可尽心传代。 四、液氮罐的使用 A.开启液氮罐时，戴好防冻棉手套，防止冻伤； B.提前确定细胞保存位置，避免提篮在外停留时间过长； C.填写复苏记录表，负责人做好整理保藏记录，禁止短期内使用同一株细胞的 多管细胞，复苏后使用细胞的同时需补充细胞株库存，写明细胞名称、冻存时间、冻存人等细节。 五、附件 1.细胞冻存记录表 以50L液氮罐所配的6个提篮，每个提篮6层抽屉柜，每个抽屉柜5*5个冻存管。
肿瘤学研究常用实验技术及方法
精心整理 肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2. DHPLC 3. i. ii. 梯度中 iii. SDS- iv. 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 4.对多种蛋白质而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂，故适 合的电流为玻璃板微热。 5.胶转膜后应在膜上标记好正反面及电泳方向。 6.电转移时应注意勿将滤膜和胶的位置放反，而且滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。
4.组织培养/基因的克隆、转化与表达 i.请列举至少3种流式细胞仪的用途? 1.定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分 2.研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、 氧化还原状态、吞噬性等)。 3.定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分 临床中应用：1.白血病和淋巴瘤的免疫分型 1. 2. 3.细胞 磷酸酶（phosphatase） 激酶（Kinase） 连接酶（Ligase） 5.生物质谱简介 生物质谱在蛋白组学中的应用？ 1.ProteinsMWmeasurements； 2.ProteinIdentification；(ID) 3.Peptideandproteinprofiling； 4.ImagingMS； 5.ProteinPTMs；5.ProteinQuantification 6.《常用电泳技术基本原理及应用》课程复习题
体外培养细胞的种类和命名
体外培养细胞的种类和命名 体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。 （一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。 （二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。 由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。 （三）克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain） （四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。 （五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。 （六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体
流程图实验
1、NiSO 4·6H 2O 是一种绿色易溶于水的晶体，广泛用于化学镀镍、生产电池等，可由电镀废 渣（除含镍外，还含有：Cu 、Zn 、Fe 、Cr 等杂质）为原料获得。操作步骤如下： H NaOH 4 H 2O 6 (1)加Na 2S 的目的是除去铜、锌等杂质，请写出除去Cu 2+的离子方程式__________ __________ (2) 加6%的H 2O 2时，温度不能过高，其目的是： _____ ________ 。 (3) 除铁方法：用H 2O 2充分氧化后，再用NaOH 控制pH 值2～4范围内生成氢氧化铁沉淀。 在上述方法中，氧化剂可用NaClO 3代替，请写出用氯酸钠氧化Fe 2+的离子方程式为： ___________________________________________________________________________ (4)上述流程中滤液Ⅲ的主要成分是： 。 (5)操作Ⅰ包括以下过程：过滤，用 （填试剂化学式）溶解，蒸发浓缩，冷却结晶，洗涤获得产品。 （1）S 2－+Cu 2+= CuS ↓(3分) （2）减少过氧化氢的分解(3分) （3）6Fe 2++ClO 3－+6H +=6Fe 3++Cl －+3H 2O(3分) （4）Na 2SO 4 NiSO 4 (4分，漏选得1分，错选不给分) （5）H 2 SO 4(3分) 2、铬铁矿的主要成分可表示为FeO ·Cr 2O 3，还含有SiO 2、Al 2O 3等杂质，以铬铁矿为原料制备重铬酸钾（K 2Cr 2O 7）的过程如下图所示。 已知：① NaFeO 2遇水强烈水解．．．． 。 ②2CrO 42－ + 2H + Cr 2O 72－ + H 2O 请回答： （1）K 2Cr 2O 7中Cr 元素的化合价是 。 （2）煅烧铬铁矿生成Na 2CrO 4和NaFeO 2反应的化学方程式是 。 （3）滤渣1为红褐色的固体，滤渣1的成分是（填名称．． ） ，滤液1的成分除Na 2CrO 4、NaOH 外，还含有（填化学式．．． ） 。 （4）利用滤渣2，可制得两种氧化物，其中一种氧化物经电解冶炼可获得金属， 电解时阴极的电极反应式为： 。 （5）写出由滤液2转化为Na 2Cr 2O 7溶液应采取的措施是 。
细胞结构和功能的实验研究方法课件资料
细胞结构和功能的实验研究方法 在高中生物学的教学中，通过切实可行的实验研究方法，深入认识细胞结构和功能，是十分必要的。这主要包括使用显微镜观察和分级离心等技术的运用。 一、细胞形态结构的观察——显微镜观察法 显微镜是中学生物实验教学中的最常用的仪器。熟练地使用高倍显 微镜观察不同细胞的结构和功能，是高中生物课程标准要求的重要的实 验操作技能。 1 显微镜的结构和使用原则 1.1 显微镜结构和功能的熟悉 目镜长度与放大倍数成“反比”，即目镜越长，放大倍数越小；目镜 越短，放大倍数越大。 物镜长度与放大倍数成“正比”，即镜头越长，放大倍数越大。 焦距调好后，镜头与盖玻片的距离越远，物镜越短，放大倍数越小；反之，放大倍数越大。 显微镜的放大倍数为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。 显微镜下视野（是指在显微镜下一次所能观察到的被检玻片标本的范围）中所看到的物象为真实物象的倒立放大的虚象。 由于低倍物镜的通光量比高倍物镜的通光量大，所以低倍镜下的视野较明亮；而高倍物镜下，虽然放大倍数大，实际观察到的标本区域小，视野较暗 例1使用显微镜时，所选用的物镜倍数愈大，则下列哪一项叙述不正确？（C ） A．物镜前端愈接近玻片标本B．物镜前端的透镜片直径愈小 C．物镜的镜筒长度愈短D．物镜下视野的亮度愈小 1.2 显微镜的使用程序和原则： 1.2.1操作的基本程序：取镜——安放——对光——制片——观察 1.2.2把握好几个原则： ①用眼原则：左眼注视目镜，右眼睁开。这样，一可减轻左眼疲劳，二可方便绘图。 ②物镜选用原则：先低倍后高倍，由低倍到高倍。可用低倍物镜观察清楚的就勿需使用高倍物镜。 ③准焦螺旋使用原则：先粗后细，由粗到细。 1.2.3显微镜下视野出现异物几种情况的判断： 如移动装片异物不动，说明不在装片上；转动转换器，换上高倍镜，仍可观察到，说
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
细胞生物学实验步骤
冻存细胞的复苏 1、于液氮罐中取出冻存管。 2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。 3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。 4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。 5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。 组织块法培养骨骼肌细胞 1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。 2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。 3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。 5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 贴壁细胞的传代和冻存 1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。 2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。 3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待 见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。 4、加培养液终止消化。 5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。 6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。 7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。 8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。 9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃ 2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。 细胞计数
细胞株和细胞系的区别
细胞株和细胞系的区别 摘要“细胞株”和“细胞系”是动物细胞工程中常用的两个名词，但由于概念不清，使用混乱，为中学生物教学带来不必要的困惑。本文拟就这两个名词的历史渊源和现实应用进行讨论。 关键词细胞株细胞系 1 名词的由来： 细胞株（cell strain）最初为W.Earle（1940）所采用，他把自己建立的小鼠结缔组织L系称为“株”，1951年，George Gey把其建立的人体宫颈癌细胞Hela 系称为“株”。1954年，White另外使用了“系”来称呼A Carrel培养的鸡胚心脏的细胞群，细胞系（cell line）由此产生，之后这两个名词长期混用。即使在1979年国际组织培养协会专业术语委员会颁布“专业名词建议”和1984年在宁波召开的全国动物组织和细胞培养会议通过“动物细胞、组织和器官培养技术中的一些术语的译名和解释”之后，到目前为止国内对这两个名词的使用仍是混乱的，不仅在商品名中混用，在专业文献中亦十分严重。 2 名词使用的现实情况 2．1 中学教材定义在人教版高中生物（选修）全一册第70页中，细胞株被定义为经原代培养的组织细胞，培养到第10代左右，度过第一次死亡危机后的细胞群，这种细胞的遗传物质没有发生改变；细胞系则被定义为可以度过第二次死亡危机，传代培养到40~50代的细胞，这部分细胞的遗传物质发生了部分改变并且细胞带有癌变的特点，这种细胞在适宜条件下无限传代。 2．2 文献定义由新鲜组织制成的细胞培养物称原代细胞，这种细胞经首次传代成功后的细胞称做细胞系，可泛指一般可能传代的细胞，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineages of cells）所组成，这种细胞世系含有多种细胞类型。若用胰蛋白酶等将原代细胞消解分散后，再培养一代，称次代培养。如果不能继续传代或传代有限，可称为“有限细胞系（finite cell line）”或“已建立的细胞
分子生物学实验室常用仪器设备简介(精)
实验一分子生物学实验室常用仪器设备简介 实验室主要仪器，设备的简介及使用方法 微量移液器 微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。 微量移液器有多种规格，在移液器量程范围内能连续调节读数。移液器常见的四种规格分别是： 0.5～10μl(读数窗显示0.5～10.0,每转1档为0.1μl); 10～100μl(读数窗显示10.0～100, 每转1档为1μl); 20～200μl(读数窗显示20～200, 每转1档1μl); 100～1000μl(读数窗显示100～1000, 每转1档为5μl). 量液的操作步骤： 1．将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头） 2．将微量移液器按钮轻轻压至第一停点； 3．垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；4．缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少； 5．等一秒钟后将吸嘴提离液面 6．平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体； 7．提起微量移液器，然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。 量液操作注意问题： 1．未装吸嘴的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。 2．一定要在允许量程范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。 3．不要横放带有残余液体吸嘴的移液器。 4．不要用大量程的移液器移取小体积样品。 5. 移液器使用完后，将刻度调到最大刻度，收藏。 低温台式高速离心机 离心机的分类 低速：每分钟几千转 高速：每分钟1 ~ 3万转 超速：每分钟3万转以上 离心机的功能：分离，纯化 低速：细胞等大分子 高速：DNA，蛋白等 超速: 病毒，蛋白等，根据用途又可分为分析超速离心机和制备超速离心机。 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段 基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术 本实验室所用离心机为台式高速离心机（IBM），配有角式转头：24×1.5ml；极限转速20000rpm 台式高速离心机使用步骤 1、把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机是否放置平衡。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
常用细胞库
中国典型培养物保藏中心(也称武汉大学保藏中心)CCTCC https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/cctcc/ https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/ 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/ 要国产的，请查一查国内的细胞库 武汉细胞库 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/fzlbc/cell.doc 上海细胞库 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/xibao/catalogue.html 昆明细胞库 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/CELL.HTM 协和医科大学基础医学细胞中心 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/pumc/jiaoxue_hj/zhongdian_sys.htm 成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心细胞及载体服务 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/cell_catalog.asp 湖南远泰生物技术有限公司生物资源库 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/Source.asp 上海午立生物技术有限公司细胞株 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/cpjs-4.htm 中国医学科学院基础医学研究所细胞中心保藏细胞目录 https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/1652-1.doc 要进口的，请查美国和欧洲细胞库： ATCC（细胞株及胚胎干细胞库） 1）下载细胞库目录：https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/pdf/tcl.pdf 2）查询细胞株：https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/SearchCatalogs/CellBiology.cfm 2）胚胎干细胞库：https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/products/cells.cfm CABRI https://www.360docs.net/doc/7310049538.html,/HyperCat/cells/all.htm
细胞培养各种培养基简介
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清
实验室常用细胞表征及处理方法(实战版)
实验室常用细胞表征及处理方法 一、细胞培养 1.1细胞培养基配方 普通细胞所需要的培养基配方主要为：购买的培养基+10 %血清（小牛或者胎牛）+1%双抗。（常用的双抗及胰酶建议直接购买） 1.2细胞传代 1.2.1洗涤：将培养瓶内的旧培养液吸出，加入2~3ml PBS缓冲液洗涤2-3次，摇晃使其均匀铺满整个平面，清洗细胞，随后吸弃PBS液以除去残留的血清和死细胞。 1.2.2消化：加入适量（盖满细胞层表面即可，25cm2的培养瓶加入0.5-0.6mL 即可，75 cm2加入1.0mL）的0.25%胰蛋白酶液，轻轻摇晃，普通细胞一般需要60s左右，特别难以消化的细胞可以放在37℃孵箱孵育适当的时间，如Hela细胞大约需要30s-40s，翻转培养瓶。然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况,待细胞开始收缩成圆形、细胞间的连接明显消失，细胞间出现明显的空隙，即可终止消化（若细胞成片收缩，倒去消化液）。若存在细胞团，可以轻轻拍打培养瓶侧壁，尽量消化完全，不然传代后会出现较多的细胞团，再次消化会非常困难。 1.2.3终止消化：在培养瓶中加入1-3ml培养液（胰酶遇血清会终止其活性）以终止消化。用吸管反复吹打洗瓶壁上的细胞，边角部分特别注意多次吹打。可在倒置相差显微镜下观察细胞吹打的程度，（轻轻摇动培养瓶，观察细胞是否完全脱壁），最后形成单细胞悬浮液。 将单细胞悬液移入15ml离心管内,离心1000r×5min,弃去上清液,加入5ml 培养基进行吹打重悬（也可不用离心，直接把单细胞悬液分装于新的培养瓶里，补加适量培养基）。小培养瓶需5ml左右培养基，直径60mm培养皿5-7ml，以上均应视细胞的数目而定，细胞多，可适当加多些培养基）。 1.2.4.传代：取上述步骤所得单细胞悬液，进行细胞悬液计数，然后按所需密度接种到其它培养瓶中。标注上代数、日期及操作人。 注：本实验所需的PBS液、DMEM细胞培养液及0.25%胰蛋白酶液均需37℃预热处理。