分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法
细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：
1.提取细菌基因组DNA,
2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离
4.胶回收目的片段
5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树
试剂：
1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。
11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。
12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。
13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）
14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。
15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）
1.1细菌基因组DNA提取
基本步骤：
材料准备
破碎细胞或胞膜—内容物释放
核算分离、纯化
沉淀或吸附核酸，并去除杂质
核酸溶解在适量缓冲液或水中
基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪
细菌基因组DNA提取方法综述
细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。
1 快速微量提取法
取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37o C水浴1hr。
然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm
离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备
?用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.
?4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA
pH8.0）洗菌体2次。
?将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，
轻轻混匀后50℃放置3h-5h。
?用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。
?乙醇沉淀DNA。
?用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适
当1×TE或ddH2O中。
3．
◆细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
◆细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重
新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。
◆菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS
110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）。
◆抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，
室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。
◆沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10。
◆洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。
◆抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。
4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL
?Grow cells overnight in 500 ml broth medium.
?Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50
mM EDTA.
?Freeze cell suspension at -20C
?Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and
let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.
?Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place
in 50C water bath for 60 min.
?Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15
min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.
?Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by
inverting).
Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase.
Dissolve overnight by rocking at 4C.
?Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at
10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.
?Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by
inverting).
?Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA
?Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.
5．CTAB/NaCl裂解法
?接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培养基中，37℃、200r/min培养24h。
?取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去上清。
?加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。
?加入30μl 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混匀，于37℃温育1h。
?加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
?加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
?上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5
分钟,保留上清。
?加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5h）,12000r/min离
心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。
?用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。
?用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6μl (4μl样品+ 2μl loading
buffer) , 80 V , 电泳1.5小时。
2.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增
一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2.1 实验原理
2.1.1 PCR
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。
ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。
PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理
2.1.2 16SrDNA的核酸序列分析
16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA 的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。较之23SrDNA 等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。
2.1.3 PCR法的操作过程
Step 1: DNA热变性；Step 2: 引物退火；Step 3: 引物延伸
2.2 PCR反应标准体系
?DNA模板
?引物
?反应缓冲液
?dNTP
?ddH2O
?耐热聚合酶
2.2.1 PCR反应体系各组分的作用和使用量及反应条件
ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反应特异性。
dNTP:反应体系中达100μM～200μM。
Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。
引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。
Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。
变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。
复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应
特异性的决定因素。
延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。
2.2.2 材料设备及试剂
设备：eppendorf管、微量取液器、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、PCR 仪
试剂：16SrDNA引物、细菌基因组DNA、Taq Plus、dNTP、PCR、冲液、琼脂糖、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA/HindⅢ、染色液、加样缓冲液
2.2.3 操作步骤
PCR反应
依次混匀下列试剂
5μl 10×PCR反应缓冲液
1μl 4种dNTP
2μl 上游引物（引物１）
2μl 下游引物（引物２）
1μl 模板DNA
0.5μl Taq DNA聚合酶
38.5μl H2O
混匀后离心5秒。
扩增：用94℃变性3分钟， 94℃变性1分钟，61℃退火1分钟, 72℃延伸1分钟, 循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸5-10分钟，使反应产物扩增充分。电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物电泳结果。
3.用试剂盒做琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收目的片段
用TaKaRa DNA纯化试剂盒对PCR扩增产物纯化
4. 纯化后的目的片断送到测序公司测序
也可以直接将电泳检测后的PCR产物送到测序公司，让公司对产物进行纯化和测序
5 .BLAST比对获取相似片段。
将测序得到的16S rDNA序列在NCBI上进行blast比对，选择与比对序列相似度高的菌株。
6.构建系统进化树
将选择的序列与测序序列用DNAStar软件的MegAlign构建菌株系统进化树。
如果要测16S rDNA的全序列长度则需要对PCR产物做T-A克隆。
T-A克隆步骤：
PCR 连接转化鉴定
1.1 T-A克隆需要在PCR产物末端加A尾巴
有些PCR聚合酶可以在产物末端加A尾巴，但并不是所有的聚合酶会加A尾巴，所以在克隆之前最好搞清楚使用的酶到底是否加A，否则克隆出来的白班太少，又要讨论很久。具有3'到5'外切酶活性的高保真酶就不会产生A尾巴。
产物末端加A步骤：
用高保真酶扩增完之后，在反应管中加入0.7-1unit的Tap聚合酶。无需更换buffer 期中的dATP已经够用。
在72孵育8-10min。
立即进行纯化，沉淀、跑胶、或用纯化试剂盒。这一点相当重要，否则高保真聚合酶会将A尾巴或T载体上的T尾巴切掉。
1.2 将加A尾巴的PCR产物与T载体连接
常用的T载体有Invitrogen的T载体；Promege的pGEM-T和TaKaRa的pMD18-T。
1.3 将载体与目的片断的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中进行液体摇床培养，涂平板进行蓝白斑挑选。
1.4 对挑选的菌落提质粒，电泳检测大小，对正确的阳性克隆的质粒进行酶切目的片断回收。
目前对于T-A克隆技可以通过T-A克隆试剂盒来完成。
细菌16S rDNA鉴定是应注意的问题和常见问题
1 细胞裂解注意事项
1.1材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低
1.2选择适当的裂解处理方式
1.3高温温浴室定时轻柔震荡
2 核酸分离纯化
2.1采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系。
2.2采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。
2.3 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。
2.4针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。
3 核酸沉淀、溶解
3.1当沉淀的时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。
3.2沉淀是加入1/10体积的NaAc(PH5.2,3M)，有利于充分沉淀。
3.3沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等。
3.4晾干DNA，让乙醇充分挥发。
3.5若长期储存建议用TE缓冲液溶解，TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase，TE缓冲液PH8.0可以防止DNA发生酸解。
4 DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应
4.1 DNA中含有蛋白，多糖，多酚类杂质：应重新纯化DNA，去除杂质。
4.2 DNA在溶解前有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：应重新沉淀DNA，让酒精充分挥发。
4.3 DNA中残留有金属离子：应增加70%乙醇的洗涤次数（2-3次）。
5 DNA提取量少
5.1 实验材料不佳或量少：应尽量选择新鲜的材料。
5.2 破壁或裂解不充分：G+菌裂解前应先用生物酶或机械方式破壁；高温裂解时，时间适当延长
5.3 沉淀不完全：低温沉淀，延长沉淀时间；加辅助物促进沉淀。
5.4 洗涤DNA时丢失：洗涤时最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。
6 DNA降解
6.1 未很好的抑制内源核酸酶的活性：可增加裂解液中螯合剂的含量。
6.2 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。
6.3 外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。
6.4 反复冻融：将DNA分装，保存于缓冲液中，避免反复冻融。
7 反应体系对PCR扩增的影响
7.1 DNA模板：
纯度：蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应
完整性：模板降解会导致PCR扩增无产物
浓度：加量过多导致非特异性扩增增加
7.2 引物
特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体
完整性：避免反复冻融
浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少
7.3反应Buffer
pH值,盐离子浓度
稳定剂,增强剂
7.4Mg 2＋浓度
过高非特异性严重
过低无扩增产物
7.4dNTP Mixture
浓度适当
避免反复冻融
7.5ddH2O
pH值适当
避免污染
8 PCR常见问题与分析
8.1 无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无原因：
1.模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer对样品不合适
3.引物设计不当或者发生降解
4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策：
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更换Buffer或调整浓度
3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4.降低退火温度、延长延伸时间
8.2 非特异性扩增
现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
原因：
1.引物特异性差
2.模板或引物浓度过高
3.酶量过多
4.Mg2+浓度偏高
5.退火温度偏低
6.循环次数过多
对策：
1.重新设计引物
2.适当降低模板或引物浓度
3.适当减少酶量
4.降低镁离子浓度
5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.减少循环次数
细菌DNA特征序列鉴定法新增
细菌DNA特征序列鉴定法（新增） 细菌DNA特征序列鉴定法系以特征核酸序列作为目标检测物，用于药用原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品、包装材料和环境等药品全生命周期质量控制中细菌的鉴定。 本法通过对细菌16S rRNA基因特征序列的测定，实现细菌的生物学鉴定。细菌16S核糖体RNA基因（16S ribosomal RNA gene, 16S rRNA基因）全长约1500 bp，包含9个可变区（Variable region, V区）和10个恒定区（Constant region, C区），在结构与功能上具有高度保守性，是细菌分类和鉴定中得到广泛应用的DNA特征序列之一。 实验环境和仪器的一般要求 开展细菌鉴定试验的环境应具备分子生物学实验室的基本条件，并符合相应级别的生物安全要求。 所用仪器有电子天平、离心机、冰箱、恒温仪、紫外分光光度仪，聚合酶链式反应分析仪（Polymerase chain reaction analyzer，PCR仪）、电泳仪、凝胶成像仪、核酸测序仪等。 试剂及其制备方法 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸钠缓冲液（TE缓冲液，pH 8.0）称取三羟甲基氨基甲烷12.1 g，加适量纯化水搅拌溶解，并稀释至100 ml，用盐酸试液调节pH值至8.0，得到1 mol/L储备液；称取乙二胺四乙酸二钠18.6 g，加适量纯化水搅拌溶解，并稀释至100 ml，用氢氧化钠试液调节pH值至8.0，得到0.5 mol/L储备液。取三羟甲基氨基甲烷储备液10 ml，乙二胺四乙酸二钠储备液2 ml，加纯化水稀释至1000 ml，121℃灭菌15分钟。 PCR反应缓冲液（pH 8.3）称取三羟甲基氨基甲烷12.1 g，氯化钾37.3 g，氯化镁2.4 g，加适量纯化水搅拌溶解，并稀释至1000 ml，用盐酸试液调节pH 值至8.3，121℃灭菌15分钟。 电泳缓冲液（TAE缓冲液，pH 8.0）称取三羟甲基氨基甲烷 4.84 g，冰乙酸1.14 ml，乙二胺四乙酸二钠0.75 g，加适量纯化水搅拌溶解，并稀释至1000 ml，用氢氧化钠试液调节pH值至8.0。
几种真菌的分离与鉴定教学文案
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
16S_rDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避
细菌鉴定及药敏分析系统产品技术要求珠海迪尔生物
2. 性能指标 2.1 外观与结构 a）外观应端正、清洁，表面涂、镀层应无明显剥落、擦伤、露底及污垢； b）铭牌及标志应清晰、准确、牢固，所有紧固件不得松动；控制器件操作应灵活、可靠。 2.2 功能要求 2.2.1 系统功能要求 a) 细菌鉴定及药敏分析系统（以下称：“系统”）可以自动读取试剂板细菌生化鉴定和抗菌药物MIC半定量测定的阴、阳性结果； b) 应用程序经分析应可得出被鉴定菌株的名称和抗菌药物MIC结果； c) 应能生成检验报告单； d) 应能打印检验报告单。 2.2.2 软件临床功能纲要 2.2.2.1 检测功能 2.2.2.1.1标本资料录入 提供输入或选择的方式录入标本的姓名、类型及来源等资料。 2.2.2.1.2 出具细菌检测报告 在软件的指引下，用户可选择出具无菌报告或者有菌报告，出具有菌报告时，软件支持自动对试剂板进行检测并生成相应的判读结果，也支持手工录入细菌检测结果，用户可根据实际情况选择。 2.2.2.2 查询功能 根据不同的查询条件，用户可对历史报告单及其相关信息进行查询。 2.2.2.3 设置功能 软件提供各种类型的参数设置，用户可根据实际情况进行预设。 2.2.2.4 统计功能 根据不同的统计条件，用户可对历史数据进行统计分析。 2.2.2.5 WHONET功能 根据不同的WHONET数据要求，用户可将历史数据按要求导出。 2.3细菌鉴定及药敏分析系统性能要求
2.3.1准确性 2.3.1.1 细菌鉴定及药敏分析系统对质控菌株鉴定准确性的符合率应≥95%；2.3.1.2 细菌鉴定及药敏分析系统对质控菌株抗菌药物MIC半定量测定准确性 的符合性应≥95%。 2.3.2重复性 2.3.2.1 细菌鉴定及药敏分析系统对质控菌株鉴定重复性的符合率应≥95%；2.3.2.2 细菌鉴定及药敏分析系统对质控菌株抗菌药物MIC半定量测定重复性 的符合率应≥95%。 2.4 温育系统性能要求（适用96A，不适用于D2Mini/D2Plus） 温度准确度及波动 a) 细菌鉴定及药敏分析系统温度稳定后，准确度偏差应不超过±1.5℃； b) 细菌鉴定及药敏分析系统温度波动应不超过3.0℃。 2.5 环境试验要求 细菌鉴定及药敏分析系统应符合GB/T14710-2009中气候环境试验I组，机械环境试验I组及表2的要求。系统的运输试验、电源电压适应能力试验应分别符合GB/T14710-2009中第4章、第5章的要求。 2.6 安全要求 应符合GB4793.1-2007、GB4793.9-2013和YY 0648-2008的要求。 2.7电磁兼容性要求 应符合GB/T 18268.1-2010和GB/T 18268.26-2010的要求 2.8网络安全要求 2.8.1数据接口：应有通用的标准有线网络接口，使用标准TCP/IP协议； 2.8.2用户访问控制：用户应输入与用户名相匹配的密码才能登录使用系统； 用户类型：分为管理员，普通用户两种； 用户身份鉴别方法及权限：系统根据登录的用户名匹配权限； 管理员有检验操作、数据查询、系统管理权限； 普通用户有检验操作、数据查询权限。
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
16SrRNA在细菌鉴定与分类中的应用
结课论文 题目名称：16S rRNA 在细菌鉴定与分类中的 应用 学生姓名：刘* 学号：2016304110*** 专业：生物化学及分子生物学 结业课程：系统细菌学 中国·武汉 2016 年12 月
16S rRNA在细菌鉴定与分类中的应用 刘* 2016304110*** 华中农业大学生命科学学院，武汉 [摘要]：由于细菌种属间生理生化特征的相似，单凭传统的表型和化学鉴定方法已无法准确对其进行分类鉴定。随着包括PCR技术、测序技术等分子技术的不断进步，细菌的分类鉴定也由在最初的表型和化学鉴定演变到分子水平，使人们可以通过对细菌的DNA鉴定来达到区分种属的目的。细菌的16S 核糖体RNA(rRNA)以其在进化上的特征性序列，基因序列的保守性和存在的普遍性，应用16S rRNA作为分子指标已逐渐成为微生物检测和分类鉴定的一种强有力工具。本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。 关键词：16S rRNA；细菌分类鉴定；DNA测序；高级结构 传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状，采取的主要方法是对细菌进行纯培养，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴定。大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作，因此迫切需要建立一种简单、方便、易于操作的分类鉴定方法，使人们在一定程度上更加科学、精确、快速地找到微生物的分类地位，为微生物资源的开发利用奠定基础。 20世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。在PCR技术的产生发展基础上，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR指纹图、rRNA基因(rDNA)指纹图、16S核糖体核糖核酸(rRNA)序列分析等。这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。特别是16S rRNA基因序列分析技术的出现，使细菌进化与否可以通过试验研究来证实。目前，关于PCR扩增16S rRNA基因用于细菌分类和鉴定的研究越来越多，大多数细菌的16S rRNA基因均已被测序。本文就16S rRNA在细菌鉴定与分类研究中的进展做一综述。 1.16S rRNA基因 16S rRNA为原核生物的一种核糖体RNA。目前，细菌系统分类学研究中
细菌菌株的分子鉴定步骤
(1)小量提取细菌基因组总DNA a.挑LB平板上新鲜活化的单菌落于5mL LB培养基中，25℃震荡培养24 h； b.转移3mL菌液于5mL离心管中，4℃，12000r/min，离心5min，弃掉上清； c.将细菌沉淀物用0.5mol/L NaCl洗一次，尽量空干上清液； d.将沉淀重悬于1mL 50mmol/L Tris (pH 8.0)缓冲液中，然后加入0.2mL新鲜配置的溶菌酶溶液(10mg/mL in 0.25mol/L Tris，pH8.0)和0.8mL 0.25mol/L的EDTA溶液，混匀后于37℃处理1 h，再加入200μL 10%SDS溶液，混匀后放置于55℃处理5min； e.加入等体积的酚-氯仿(1:1)，盖好上下颠倒混匀3min，12000r/min，离心10min； f.转移上相至新的离心管中，重复上个步骤直到无白色变性蛋白层出现； g.取上清，加入3μL 10mg/mL的去DNase的RNase溶液，37℃水浴1h； h.重复步骤e； i.在上相中加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30min；. j.4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗两次，干燥后溶于100μL的TE中，-20℃保存备用。 (2) PCR扩增16S rDNA序列 a. 以上述细菌基因组总DNA为模板，.扩增所用引物为， 上游引物：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；（27F） 下游引物：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’。（1492R） b. PCR反应体系参见PCR扩增试剂盒说明书 c. PCR反应条件也主要参考说明书 94℃预变性5min，94℃ 45s，56.2℃ 45s，72℃ 90s，30个循环； 72℃ 10min，4℃保温。 d. PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 e. PCR产物测序。 (3)构建进化树 将菌株16S rRNA的序列与GenBank数据库中序列比对，构建系统发育树。
细菌鉴定方法
1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。
细菌自动鉴定及药敏系统的研究进展
细菌自动鉴定及药敏系统的研究进展(2) 录入时间:2011-2-23 9:13:34 来源：中华检验医学网 （四）Vitek Ⅱ： 在第一代Vitek的基础上发展而成。有4个架子，每个架子能容纳15片试验卡。司同时容纳60片试验卡，每片试验卡包含64个反应孔，采用快速荧光法测定细菌，2小时提供鉴定报告，鉴定敏感度高，分辨能力强。可在鉴定的同时进行药敏试验，结果可分级报告(先完成的药敏结果先报告)。该仪器具有高级专家系统，可根据药敏试验的表则结果提示有何种耐药机制的存在，对耐药机制推断准确性大于90％，MIC 平均药敏检测所需时间9.74小时，比传统方法缩短1天检测时间，能对药敏试验的结果进行“解释性”判读。该专家系统还能自动复核检验结果，如发现鉴定与药敏不符合的现象，即发出提示，要求进行复查。 （五）SENSITITRE MICROBIOLOGY SYSTEMS ARIS英国先德荧光快速微生物鉴定/药敏系统工作原理 1.概述： SENSITITRE MICROBIOLOGY SYSTEMS ARIS由英国Accu Med公司于20世纪70年代开始研制生产。1996年12月美国惠好公司正式成为SENSITITRE在中国的总代理。分为全自动SENSITITRE Aris和半自动Auto-Reader两种组合。可鉴定细菌180种。数据库含500种细菌资料。可对200种抗生素进行分析，在全世界有800家用户。1996年12月进入中国。国内5家用户。 2．原理： (1)鉴定原理： 通过检测荧光的增加间接地测定MIC值。SENSITITRE系统采用传统生化反应，8进位数码鉴定及荧光分析项结合。荧光分析是用荧光标记细菌表面特异酶的底物，经细菌水解底物产生荧光来判断结果。不同
细菌分子生物学鉴定
是的，要做PCR。 首先你要提出细菌的DNA。 方法如下： 1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP 管中，再加甘油（30-40%）进行保种。（-80摄氏度保藏2年） 2、提取DNA（CTAB法）： （1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。 （3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。 （4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl 溶液，混合后再65℃温育30min。 （6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。 （7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min 离心5min将上清液转移到新的EP管。（纯化作用） （8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。
（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。 （11）电泳检测 6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA 进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果） 7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。 8、连接转化：从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上，倒置培养12-16h。 9、克隆子挑选及PCR鉴定：从上一步的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h，以培养液为模板直接进行PCR 扩增鉴定（1000-2000bp）。将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。 10、测序：将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。 11、序列拼接：运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。 12、建树：对拼接得到的序列用Blast进行比对，最后将比对得到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树。
细菌鉴定及检测方法
细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的
菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA测序鉴定菌种 一．原理 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。二．技术路线 该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三．方法步骤 （一）细菌基因组DNA提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程： 取一环标本四区划线接种平板（如为粪便标本接种SS,MAC平板） 培养18-24小时后取一区菌落革兰染色，报告为革兰阳性球菌/革兰阴性球菌/革兰阳性杆菌/革兰阴性杆菌，注意区分细菌和真菌 一般情况下不会给你们做革兰阳性杆菌和革兰阴性球菌 革兰阳性球菌鉴定流程： 先做3%触酶试验：阳性的为葡萄球菌或微球菌，阴性为链球菌或肠球菌 葡萄球菌和微球菌的区别：葡萄糖OF试验，葡萄球菌为F型，微球菌为O型 所以如果做到一个触酶阳性的革兰阳性球菌都要做下葡萄糖OF试验，DNA酶试验，新生霉素试验，血浆凝固酶试验 链球菌和肠球菌的区别：链球菌高盐和胆汁七叶苷试剂均为阴性，而肠球菌都为阳性。 链球菌属内区别：本来可以通过溶血来区分一些的，但是由于实验室的平板αβ溶血比较难区分 所以如果做到一个触酶阴性的革兰阳性球菌都要做下高盐，胆汁七叶苷，杆菌肽，奥普托欣，CAMP 如果做到一个奥普托欣敏感的革兰阳性球菌再加做胆汁溶菌试验和菊糖试验（阳性为变红）可判定为肺炎链球菌 革兰阴性杆菌鉴定流程： 先做氧化酶试验： 氧化酶阴性的革兰阴性杆菌都要做下KIA，MIU，葡磷两支(做MR，VP)，苯丙，枸橼酸盐，硝还，蛋白胨水（做吲哚试验），赖氨酸，鸟氨酸，氨对 如果KIA结果为A/A或者K/A的应为肠杆菌科细菌，如上面向个反应还不能区分细菌到种根据教科书307页加做试验。 一般情况下只会给你们做大肠埃希菌，志贺菌属（四种），沙门菌属（甲副，乙副，伤寒），弗劳地枸橼酸杆菌，肺炎克雷伯，产酸克雷伯，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌，沙雷菌属，摩根菌属，普罗威登斯菌属。 如果KIA结果为K/K应怀疑为不动杆菌属或者嗜麦芽窄食单胞菌：这两个菌区分可通过麦芽糖和赖氨酸试验区分， 如为氧化酶阳性，要做葡萄糖的OF试验（用非发酵），硝还产气，精氨酸双水解酶，一般情况下只有两种菌给你们做一个是铜绿假单胞菌，一个是粪产碱杆菌， 真菌给你们做的一般情况只有白色念珠菌和新生隐球菌，通过墨汁负染，芽管试验，厚膜孢
菌种保藏中的细菌鉴定方法
万方数据
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菌种保藏中的细菌鉴定方法 作者：杜昕波， 赵耘， 李伟杰， DU Xin-bo， ZHAO Yun， LI Wei-jie 作者单位：中国兽医药品监察所,北京,100081 刊名： 中国兽药杂志 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF VETERINARY DRUG 年，卷(期)：2009，43(3) 引用次数：0次 参考文献(6条) 1.兽医微生物学 2005 2.医学微生物学实验技术 2006 3.程池.杨梅.李金霞.姚粟.胡海蓉Biolog微生物自动分析系统--细菌鉴定操作规程的研究[期刊论文]-食品与发酵工业 2006(5) 4.杜昕波.赵耘.李伟杰.康凯.陈敏.张媛利用BIOLOG系统对不同种类细菌鉴定的研究[期刊论文]-中国兽药杂志2008(9) 5.原核生物系统学 2007 6.常见细菌系统鉴定手册 2001 相似文献(8条) 1.学位论文杜蓉分枝杆菌分枝菌酸的反相高效液相色谱分型鉴定技术方法研究与应用2008 结核病具有高流行性和高传染性，至今仍是一个严重的公共卫生问题。WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一，据估计全球约有1/3的人感染结核菌，每秒有1个新增病例（WHO，2006年）。分枝杆菌在微生物分类中属于放线菌目、分枝杆菌科，临床主要致病的是结核分枝杆菌（MTB），此外还有非结核分枝杆菌（NTM），NTM所引起的结核样病变与结核临床表现相似，但治疗方案和抗药性根据不同种属有所不同。因此对分枝杆菌做出及时准确的分型鉴定、检测对控制结核病疫情具有十分重要的现实意义。 分枝菌酸（MA）是一类高分子量的含有α-支链、β-羟基脂肪酸的化合物，是所有分枝杆菌细胞壁脂质的主要组分，其脂肪酸上碳链的长度、不饱和状态、官能团及其含量与生物种型有关，且各生物种型之间MA呈现指纹特征。 本论文的目的是通过采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析比较样品中MA之间的差异，建立快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的HPLC标准方法，并构建分枝杆菌标准菌株的MA指纹谱库，为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。全文分为四章： 第一章前言，简要介绍了分枝杆菌分型鉴别及检测方法的研究现状和存在问题，尤其介绍了HPLC方法的应用。并在此基础上提出了本论文的研究目的和研究内容。 第二章建立了以甲醇和二氯甲烷为流动相的梯度洗脱RP-HPLC法。分枝杆菌经过接种、培养、皂化、酸化及衍生化后，采用RP-HPLC进行分析，建立了快速灵敏准确的分枝杆菌种间分型鉴定的RP-HPLC标准方法。 第三章采用第二章所建立的方法，构建了49种《伯杰细菌鉴定手册》中所载入的分枝杆菌标准菌株（来源于ATCC（美国标准菌种收藏中心））的MA指纹谱库。通过对各个谱图进行详细分析，依据峰的分布特点可将其分为单簇（14种）、双簇（23种）、三簇及多簇（12种）三类，而后根据相对保留时间和相对峰高比的比例进行种间水平鉴别。此法成功鉴别了41种分枝杆菌（其余8种难以采用此法准确鉴别），对于难以鉴别的部分菌种尝试采用GC法对其进行进一步分型鉴别。 第四章在完成第二、三章工作的基础上，使用所建立的方法亦测定了大量来源于DSMZ（德国菌种保藏中心）的分枝杆菌（包含未收录入《伯杰细菌鉴定手册》的菌种）的MA 指纹图谱，为分枝杆菌的分型鉴定提供了重要的技术方法和谱库数据补充。 2.期刊论文程池.杨梅.李金霞.姚粟.胡海蓉.Cheng Chi.Yang Mei.Li Jinxia.Yao Su.Hu Hairong Biolog微生物自动分析系统--细菌鉴定操作规程的研究-食品与发酵工业2006,32(5) Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统,以细菌对微平板上95种碳源的利用情况为基础从而进行微生物鉴定.目前我国已经累计引进100余台,但使用率较低.文中在总结实践经验的基础上,参阅最新Biolog系统操作手册4.2版和国家微生物资源平台技术规程的统一格式,研究制定了细菌鉴定的操作规程,以规范系统使用,获得准确鉴定结果,尽快提高我国Biolog系统的应用水平. 3.学位论文刘晗黄原胶寡糖酶法制备及水解酶分泌菌株的定性2006 寡糖及糖缀合物广泛的存在于生命体内，是重要的信息物质，参与多种生命活动。寡糖由于结合位置和结合类型的不同，种类繁多，有着多种重要的生物活性。黄原胶是人类研究最为透彻、商业化应用程度最高的由微生物分泌的胞外多糖，而关于其降解产物——黄原胶寡糖是否拥有某种生物学活性，至今少见报道。 首先，本文对一株从野外筛选到的分泌黄原胶酶的菌株进行了鉴定，根据该菌株形态特征、生理生化特征，对照《伯杰细菌鉴定手册》，初步确定它属于鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)。16SrRNA序列测定结果也支持这一结论。该菌已保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCCNO.1421)。 其次，通过对Sphingomonassp.XT-11发酵条件的研究，筛选出有利于产酶的各实验因子的适宜水平。结果表明，酶形成的适宜温度为30℃，培养基适宜起始pH值为7.0，培养基适宜底物浓度为1﹪，摇瓶发酵用250mL三角瓶装液30mL酶活力较高。适宜种龄为16～24h，接种量对发酵影响不大。 再次，对黄原胶寡糖在抗氧化、抑制皮肤浅部真菌、植物诱抗、抑制ACE方面的生物学活性进行了探索，发现粗酶液降解得到的粗黄原胶寡糖拥有较强的抗氧化能力，而对ACE则没有抑制作用；黄原胶寡糖还拥有了较强的抗皮肤浅部真菌活性以及一定的植物诱抗活性。 最后，对鞘氨醇单胞菌XT-11红细胞凝集活性进行了研究。发现该菌悬液能凝集2种血红细胞。菌悬液对兔红细胞的凝集可以被肝素所抑制。其凝集活性不依赖于Ca2+；在pH为6.0～10.0范围内较稳定；它的凝集活性在60℃时完全丧失。 4.期刊论文张海燕.贺江舟.龚明福.刘占文.张利莉.Zhang Haiyan.He Jiangzhou.Gong Mingfu.Liu Zhanwen. Zhang Lili利用菌落PCR-DGGE快速鉴定盐渍土壤菌种多样性-塔里木大学学报2007,19(4) 利用菌落PCR方法,结合DGGE的检测方法,对所保存的87份盐生菌的培养物进行了多样性检测,初步研究显示至少有31株不同的菌种,表明新疆盐生环境存在较为丰富的菌种资源,同时表明菌落PCR结合DGGE技术为细菌鉴定和菌种保藏过程中重复菌株的去除提供了一种快速可靠的手段. 5.学位论文陈接锋产聚β-羟基丁酸球衣菌分离筛选及发酵和提取的研究2003 球衣菌是活性污泥中的主要丝状菌,对污水中的有机物和有毒物质有很强的降解能力,而且胞内也能积累相当量的PHB,已逐渐受到重视,因此,该文详
16s_rdna菌种鉴定
16S rDNA方法鉴定细菌种属 一．目的 1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法； 2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。 二、原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。 在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。 1、16S rRNA普遍存在于原核生物中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。 2、在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。 3、16S rRNA的相对分子量大小适中，约1 540 个核苷酸，便于序列分析。 4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：
细菌鉴定学习
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】