实验四细菌的分离培养及培养性状的观察

实验四细菌的分离培养及培养性状的观察

在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污

1

2

连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培

养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见

图4-3。

（1）连续划线法

将菌

取出接

养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯

种后再接种斜面。

(2)分区划线法（四分区划线法）

取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法

划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，

2次平

.

至约

分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而

密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。

3.芽胞需氧菌分离培养法

如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而

而对

放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再

取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到纯培养。

6.琼脂斜面分离法

取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然

2管的

1～2

斜面或平板分离法可能无菌落长出，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出细菌后，再用

琼脂斜面或琼脂平板分离。

二、厌氧性细菌分离培养法

细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环

境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。

现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。

（一）生物学方法

培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片，或加热的肌肉、心脑等），因组织的

氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37℃恒温箱中培养2～3d，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。

（二）化学方法

利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，

或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。

1.焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。通常100cm 3空间用焦性没食子酸1g 及10％氢氧化钠或氢氧化钾10m1。具体方法

有下列几种：

取一℃恒温

（图

，立即

将试管口用橡皮塞塞紧，必要时周围用石蜡密封。37℃培养24～

48h 后观察。

（3）瑞氏厌氧培养法（图4-5）将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm 处，

图

置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH 溶液2ml ，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。

（4）史氏厌氧培养法用图4-6所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置NaOH 溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇动底部，使氢氧化

2.李伏夫（）氏法此法是利用连二亚硫酸钠

（Sodiumhyerosulphite ）和碳酸钠以吸收空气中的氧气,释放二

氧化碳造成厌氧环境。其反应式如下：

Na 2S 2O 4+Na 2CO 3+O 2→Na 2SO 4+Na 2SO 3+CO 2

图

取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如是液体培养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1～2个平皿的空间（视玻罐的体积而定），按玻罐的体积每1000cm 3

空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g ，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免所

～48h

固体

培养

基倾

入皿

内。待

图4-8李伏夫氏厌氧培养法图4-9Brewer 氏培养

琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触（图4-9）。此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的氧气被硫乙醇酸钠还原，美兰指示剂逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通，仍呈蓝色。将Brewer 氏培养皿于37℃恒温箱内24～48h后观察。

，驱

37℃培

养24～48h后观察。

4.高层琼脂柱法加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至50℃左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取

上述已接种的琼脂培养基，注入准备好的玻璃管内（长约15cm ，一端塞小胶塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高压灭菌备用），装至4／5左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置37℃恒温箱中培养。长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无菌玻棒将琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌接种环钓取独立菌落作厌氧纯

)

5～10 1.接种环移植法两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和新鲜空白琼脂斜

面各一管，使管口互相并齐，稍上斜，

管底握于手中，松动两管棉塞，以便接

种时容易拔出（图4-11）。右手食指和拇

图4-11斜面接种

时试管的拿法

指执接种环，烧灼接种环，以右手小指扭开一管的棉塞，无名指扭开第二管的棉塞。棉塞头向掌心内，将试管口通过酒精灯火焰灭菌，待冷却后将接种环插入菌种管中，钓取细菌少许取出接种环立即接种在新鲜空白琼脂斜面上，不要碰及管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲线或直线，向上至斜面顶端为止，管口

37℃温

可以

其操

的是用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基中。要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。

六、细菌培养性状的检查

（一）细菌在固体培养基上的生长表现

1.琼脂平皿上的生长表现细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别某种细菌。如葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落，

4-13，

1．4．圆形、

（1）大小菌落的大小，规定用毫米（mm）表示，一般不足lmm者为露滴状菌落；1～2mm者为小菌落；2～4mm者为中等大菌落；4～6mm或更大者称为大菌落或巨大菌落。

（2）形状菌落的外形有圆形、不规则形、根足形、葡萄叶形。

（3）边缘菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、

放射状等。

（4）表面性状观察其是否平滑、粗糙、皱襞状、旋涡状、荷

包蛋状，甚至有子菌落等。

（5）隆起度表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或

堤状者。

取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，置22℃温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相同，其形式如图4-17所示。

（三）细菌在液体培养基中的生长表现（如图4-18所示）将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况，主要观察其混浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜色等。

1.混浊度细菌接种在液体培养基中经适当培养后其表现性状

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