细胞培养合成培养基
细胞培养合成培养基
合成培养基就是根据天然培养基的成分,用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。它有一定的配方,就是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种,有的培养基仍在不断进行改良。早期组织培养就是利用天然培养基,目前合成培养基已经成为一种标准化的商品,从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基,并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。
一、基本组分
基本培养基包括四大类物质:无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。
●无机盐:CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都就是必须的。
●氨基酸:缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它们都就是细胞用以合成蛋白质的必需原料,不能由其她氨基酸或糖类转化合成。除此之外,还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用,对细胞的培养特别重要,能促进各种氨基酸进入细胞膜;它所含的氮就是核酸中嘌呤与嘧啶的来源,还就是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘与三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸与蛋白质,谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的就是:谷氨酰胺在溶液中很不稳定,故4℃下放置1周可分解50％,使用中最好单独配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培养液中。
●维生素:就是维持细胞生长的一种生物活性物质,在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶,对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(A、
D、E、K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素与B12。维生素C 也就是不可缺少的,对具有合成胶原能力的细胞更为重要。
●碳水化合物:就是细胞生命的能量来源,有的就是合成蛋白质与核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖与丙酮酸钠等。体外培养动物细胞时,几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含
的能源物质。
●葡萄糖与谷胺酰胺的合理使用:乳酸就是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明,体外培养条件下95％的葡萄糖转变为乳酸,这降低了营养物质的代谢效率,降低培养基pH值,增加渗透压。在氧气供给不足的情况下,NADH转运系统苹果酸－天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+,细胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与NADH反应生产乳酸与NAD+,从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释就是连接糖酵解与TCA循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶与丙酮酸羧化酶活性低下,直接导致糖酵解与TCA循环的失衡。因此体外培养条件下,葡萄糖主要经糖酵解降解,产生过量的乳酸。减少乳酸生产最常用的方法就是限制培养基中葡萄糖的含量,但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足,细胞生长抑制。该方法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达量等参数进行综合考虑方可应用。
在目前常用的培养基中,葡萄糖与谷胺酰胺就是体外培养动物细胞的主要能源,其能量代谢通路与体内完全不同,表现为葡萄糖主要经糖酵解途径为细胞提供能量,谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径,另一小部分通过完全氧化为细胞供能。因此,适当的调整细胞内的代谢途径,使之能促进细胞的快速生长与产物合成,同时减少代谢抑制物的生成就是行之有效的一种策略。
许多动物细胞如CHO、BHK与杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖与谷氨酰胺的消耗利用很快。然而对于细胞生长而言,二者的快速利用并非细胞必需;相反相当一部分转化为代谢废物乳酸与氨,以及一些非必需氨基酸如丙氨酸,脯氨酸。其中,乳酸与氨就是两种主要代谢废物,其积累可影响细胞生长以及产品质量。减少这两种代谢产物的积累,就是大规模细胞培养技术研究的重要方向。氨就是由谷氨酰胺与天冬酰胺产生的。限制培养基中谷氨酰胺的含量亦就是减少氨生成的常用方法。
●除了以上与细胞生长有关的物质以外,培养基中一般还要加入酚红(当溶液酸性时pH小于6、8呈黄色;当溶液碱性时pH大于8、4呈红色),一种pH指示剂。
●在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤与嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷与辅酶A。
二、常用细胞培养基
(1)、MEM细胞培养基系列
(2)、DMEM细胞培养基系列
(3)RPMI-1640细胞培养基系列
(4)、199细胞培养基系列
(5)、水解乳蛋白细胞培养基
(6)欧氏平衡盐
(7)F-10,F-12细胞培养基系列
(8)其它类型细胞培养基
三、干粉培养基的配制
配制培养基要注意以下问题:
●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分,常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些就是必须添加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些根据实验需要决定。
●配制就是要保证充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。
●配制所用的水应就是三蒸水,离子浓度很低。
●所用器皿应严格消毒。
●配制好的培养基应马上过滤,无菌保存于4度。
●液体培养基主要就是为了科研工作的方便而设计的培养基,它就是一种灭菌后保证无菌的溶液,必要时可制成无内毒素等的溶液,可节省科研人员的工作量。
配制方法
●在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5％的双蒸水。
●在室温(20℃到30℃)的水中加入干粉培养基,轻轻搅拌,不要加热。
●水洗包装袋的内部,转移全部的痕量干粉到容器内。
●加NaHCO3到培养基中。
●用双蒸水稀释到想要的体积,搅拌溶解。注意不要过分搅拌。
●通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值,由于pH值在过滤时会上升0、1到0、3,因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0、2到0、3。培养基在过滤前要保持密封。
无血清技术及其培养基
经历了天然培养基、合成培养基后,无血清培养基与无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本,简化分离纯化步骤,避免病毒污染造成的危害。
无血清培养基(serum free medium,SFM):就是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但就是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求,但对有些实验却不适合,如观察一种生长因子对某种细胞的作用,这时需要排除其她生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子;又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)的能力;或者要大规模的培养某种细胞,以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直就是生物科学工作者努力的目标。上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化的多种无血清培养基,可满足众多厂商的需求。
一、无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。
用于生物制药与疫苗生产的细胞在体外培养时,多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时,由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白,细胞往往以悬浮形式生长。
添加组分包括以下几大类物质:
(1)促贴壁物质:许多细胞必须贴壁才能生长,这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁与扩展因子,一般为细胞外基质,如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还就是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子,对许多细胞的繁殖与分化,起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化,这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。
(2)促生长因子及激素:针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也就是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质,有些激素就是
许多细胞必不可少的,如胰岛素。
(3)酶抑制剂:培养贴壁生长的细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂,以终止酶的消化作用,达到保护细胞的目的。最常用的就是大豆胰酶;抑制剂。
(4)结合蛋白与转运蛋白:常见如转铁蛋白与牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大,可增加培养基的粘度,保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。
(5)微量元素:硒就是最常见的。
二、使用方法:目前,血清仍就是动物细胞培养中最基本的的添加物,尤其就是在原代培养或者细胞生长状况不良时,常常会先使用有血清的培养液进行培养,待细胞生长旺盛以后,再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程,一般要逐步降低血清浓度,从10％减少到5％,3％,1％,直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态就是否发生变化,就是否有部分细胞死亡,存活细胞就是否还保持原有的功能与生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留,很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前,要留有种子细胞,种子细胞按常规培养于含血清的培养基中,以保证细胞的特性不发生变化。
为了使细胞适应无血清培养,关键的就是使所培养细胞:
●处于对数生长中期
●>90％活细胞率
●适应时以较高的起始细胞接种
有两种方法使细胞适应无血清培养基(SFM):
1、直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中。一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应,接种细胞密度应该:
2、5×105~
3、5×105细胞/ml。当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时,传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时,细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天,当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml,细胞活率在90％时,贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2、连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基(SFM)中,与直接适应相比较,连续适应趋向对于细胞更加温与一些。
●以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75％有血清培养基:25％SFM 混合培养基中,传代培养。
●当细胞密度>5×105细胞/ml时,以2×105到3×105细胞/ml细胞密度,在有血清培养基:SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
●以2×106到3×106细胞/ml细胞密度,25％有血清培养基与75％SFM中传代培养。
●当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml(接种后4到6天),在100％SFM培养基中传代培养。
●每隔3到5天,当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml,细胞活率在90％时,贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物,直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中,最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意,与有血清培养基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白质,因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清:许多细胞利用连续适应方法能很好的适应,用包含FBS的的培养基与包含有替代血清的培养基1∶1(v∶v)的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式,连续几代减少当前培养基的量:1∶2,1∶4,1∶16与100％替代培养基。每次适应改变血清比例时,传代细胞2到3次。
培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清,生长的延迟可能会发生,4允许进行2到3次的传代,使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的就是:配制无血清培养液必须使用高质量的水,如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中与毒素、保护细胞的大分子,既便水中的有毒物质含量甚微,也可能对细胞产生致死性损害。这就是无血清培养能否成功的关键因素之一。
三、使用无血清培养基的优点
●增加确定性
●性能更加一致
●容易进行纯化与下游加工
●细胞功能的精确评估
●增强生长与/或产量
●生理反应性的较好对照
●增强细胞内中介物的检测
无蛋白培养基与限定化学成分培养基
一、无蛋白培养基(protein free midium,PFM):即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白,如胰岛素,转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来瞧,不含动物蛋白的培养基又广泛的应用前景,许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体,如果再生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基,纯化过程就比较复杂,最终要达到一定的质量标
准也有一定的难度。无蛋白培养基就就是为了适应这发展趋势而出现的,许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。
二、限定化学成分培养基(chemical defined medium,CDM):就是指培养基中的素有成分都就是明确的,它同样不含有动物蛋白,同样也不就是添加了植物水解物,而就是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM问世,上海恒利安生物科技有限公司生产的水解乳蛋白培养基就属于CDM。
其她细胞培养用液
在细胞培养过程中,除了培养基外,还经常用到一些平衡盐溶液、消化液、pH调整液等。
一、平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS):主要就是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用就是维持细胞渗透压平衡,保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其她试剂等。最简单的BSS就是Ringer。D-Hank"s与Hank"s 的一个主要区别就是前者不含有Ca2+、Mg2+,因此D-Hank"s常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有较高的NaHCO3(2、2g/L),适合于5％CO2的培养条件,Hank"s平衡液仅含有0、35g/L NaHCO3,不能用于5％CO2的环境,若放入CO2培养相,溶液将迅速变酸,使用时应注意。
配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+,应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。
二、消化液:取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液,传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来,常用的消化液有胰酶(Trypsin)溶液与EDTA溶液,有时也用胶原酶(collagenase)溶液。
1、胰酶溶液:胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示,常见有1:125与1:250,即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0、1-0、25％浓度,配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液(如前面的D-Hank"s),因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH就是8-9,配制胰酶溶液应将液体调至pH8左右,充分溶解,过滤除菌。过滤后可以再调只pH7、5,也可不调。
使用细胞清洗液配制胰酶消化液:含0、5％胰酶的细胞清洗液(100ml细胞清洗液加0、5g胰酶),过滤除菌,分装于4度保存。2、EDTA溶液:EDTA溶液也常用来解离细胞,它的作用机制就是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞,还可以用EDTA与胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0、02％,配制时应加碱助溶,配制后可过滤除菌,也可高温消毒灭菌。
3、胶原酶溶液:胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用,胶原酶作用的对象就是胶原组织,因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0、1-0、3mg/L或200000U/L,作用的最佳pH为6、5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制,配制时可用PBS。
三、pH调整液:常用的有HEPES液与NaHCO3溶液。
1、NaHCO3溶液:NaHCO3就是培养基中必须添加的成分,一般情况下按说明书的要求准确添加,以保证培养基在5％CO2的环境下pH达到设计标准。如果就是封闭式培养,即不与5％CO2的环境发生交换达到平衡,所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5、6％或7、4％的NaHCO3溶液调节培养基,使之达到所要求的pH环境。
2、HEPES溶液:就是一种弱酸,中文名字就是羟乙基哌秦乙硫磺酸,对细胞无毒性,主要作用就是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下,观察细胞时培养基脱离了5％CO2的环境,CO2气体迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此时可以维持pH7、0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。
四、抗生素:常用的就是青链霉素,俗称“双抗溶液”。青霉素主要就是对革兰阳性菌有效,链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。通常使用青霉素终浓度0、007-0、008g/100ml,链霉素终浓度0、01g/100ml。一般配制成100倍浓缩液,可用PBS或培养基配制。
五、谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4℃下放置7天即可分解约50％,所以都就是在使用前添加。配制好的培养液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0、002mol/L。一般配制为100倍浓缩液,即浓度为200mmol/L(29、22g/L),配制时应加温30℃,完全溶解后过滤除菌,分装至小瓶,储存于－20℃。使用时,在每100ml 培养液中加入0、5~2ml谷氨酰胺浓缩液,终浓度为1~4mmol/L。
六、二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)
在细胞培养液中L-谷氨酰胺就是大部分细胞培养基的基本成分;而L-谷氨酰胺就是一种并不稳定的氨基酸,在中性的水溶液中会自发降解;需要频繁地补加L-谷氨酰胺。因而在培养操作过程中经常:
(1)频繁打开盖子,增加了破坏无菌状态的可能性;
(2)过多的追加L-谷氨酰胺,增加了培养基中氨的毒性水平。
上海恒利安生物科技有限公司已成功开发出用于细胞培养的二肽谷氨酰胺商业化产品。
二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不降解,可高压灭菌,释放毒性氨最少!
二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶(E、C、3、4、11、2)所水解,产生L-谷氨酰胺与L-丙氨酸;因此在大部分细胞系统中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同样有效地被利用。二肽谷氨酰胺就是最优替代物,它无需适应;既可用于贴壁细胞培养,也适合于悬浮细胞的培养。
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
动物细胞培养基本操作
实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程 一、Vero细胞复苏流程 1、准备 1.1工作地点检查： 检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。 1.2设施检查： 确认空调、传递窗工作状态完好。 1.3层流罩准备： 开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。 1.4操作工具和试剂检查： 检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液。 1.5复苏用水准备： （1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。 （2）百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。 1.6操作人员进入层流罩： 穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。 1.7溶液使用前处理： 辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。 2、配液 配方 辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。 3、种子支领 依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。 4、种子速溶 种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后，迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。 5、移种 操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。 6、培养 辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。 7、清场 将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间，层流罩内用75%酒精消毒，再用纯水清洁整个房间。 8、复苏后观察 第二天观察培养液颜色（PH）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。 9、换液 换液前准备与复苏前相同。观察培养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。 辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2）。拧紧瓶口，平放到恒温室培养。最后按规定清场
高中生物 动物细胞培养和核移植技术教案 新人教版选修3
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台， 酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个， 常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试 剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换
2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
细胞培养试剂及操作流程
实验规范化流程 一、细胞培养所需 1、10%FBS 1640培养液。 2、10%FBS DMEF/12培养液。 3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。 4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。 5、胰酶 6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为1640 7、真核抗生素： G418: 50mg/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml T47D 400ug/ml) 嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、 MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/ml MDA-MB-231 5ug/ml 潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液） 环丙沙星 左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ） 9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ） 10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ） 一、细胞培养相关技术 1、细胞复苏 准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程： （1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。 （2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。 （3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。 （4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。 2、细胞传代
细胞培养全过程
我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。细胞培养室实验操作规范 一、细胞培养室的环境 1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件： 1) 培养室应为独立、封闭的空间。培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入； 2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上； 3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒； 4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。 5) 定期清理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除； 6) 培养箱要定期清洁。隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份； 7) 注意监测CO2的气压，及时补充。 8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。 2. 实验器具的清洗、消毒灭菌： 1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗
——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。 *洗液：浓硫酸+重铬酸钾 2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干 3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。 4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。 二、细胞培养用水、用液： 1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿； 2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。可过滤灭菌或高压灭菌。采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。 3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例： 1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解； 2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时； 3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时； 4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.0 5) 过滤除菌。滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；
动物细胞培养技术 思考题
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
细胞培养的流程
细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？ 对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。 如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！ 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！ 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。 我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法） （一）仪器的清洗 总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液） 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。 今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！ 每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！ 您的这个帖子属于改范畴！ 感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！ 再次感谢！再多说点啊！ 呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗： 对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、
细胞培养标准流程
精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。
动物细胞培养常用方法
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度
细胞培养的一般过程
细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。 一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。 四、冻存及复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。 复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 培养细胞的细胞生物学 一、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞
动物细胞培养及应用发展史
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程-标准化文件发布号：（9556-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
细胞培养工作流程 一、Vero细胞复苏流程 1、准备 1.1工作地点检查： 检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。 1.2设施检查： 确认空调、传递窗工作状态完好。 1.3层流罩准备： 开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。 1.4操作工具和试剂检查： 检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液。 1.5复苏用水准备： （1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。 （2）百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。 1.6操作人员进入层流罩： 穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。 1.7溶液使用前处理： 辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。 2、配液
辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。 辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶 （T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。 3、种子支领 依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。 4、种子速溶 种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后，迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。 5、移种 操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。 6、培养 辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。 7、清场
常用的五种动物细胞培养方式
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
细胞培养标准流程
细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO 放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。 2 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 2、细胞转染
TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。 以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。 取 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。 (转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min） 无血清无双抗DMEM量＝全培体积的10％。如6孔板加4mL培养液培养，即转染体系为400ul无血清无双抗DMEM。 缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。 转染后6h后细胞换液，排除试剂的毒性影响。 24～48 h 后收集细胞用于后续实验。 Note：如果用这种方法转染效率一直不佳，可以在接种细胞前，把转染试剂配好，把转染试剂加到培养盘上，再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞，这种方法会导致细胞死亡，不贴壁。 HiPerFect转染试剂转染（用于siRNA的转染，说明书附后） For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA 以6 孔板为例，转染之前，以2mL全培接种×105细胞于6孔板每孔。 将细胞放置在培养箱中培养，直至转染。（前50%---染90%） 取 ml 离心管，加入100 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入 siRNA(20uM浓度，相当于μL)5uL,转染试剂12μL，轻轻混匀，室温 静置5-10 min。 siRNA：转染试剂：无血清无双抗DMEM 5uL：12ul：100ul。（比例待定） 将步骤3混合液缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。 24～48 h 后收集细胞用于后续实验。