叶绿体的分离与观察

实验四 叶绿体的分离与观察

实验目的

1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理与方法。
2.观察叶绿体的形态。
实验原理

差速离心是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的。沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒，可以用此法分离。样品离心时，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。将细胞充分破碎后，可用差速离心法分离细胞各组份。如用一定的介质进行组织匀浆，然后通过差速离心，先用较低的转速把比重较大的细胞核从细胞质组分及其它碎片的悬浮液中分开，再经过反复洗涤，就能得到纯净的细胞核。再用较高的转速把上清夜中的较小颗粒沉淀下来（如线粒体），从而使各种细胞结构得以分离。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。为了保护细胞组分的活性，全部操作过程应在0℃~4℃下进行，试剂应置冰箱预冷备用。如果在室温下进行分离要迅速。

实验用品
一、仪器
1．主要设备：普通离心机、组织捣碎机、普通光学显微镜。
2．500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，载玻片、盖玻片、刀片等。
二、材料：新鲜菠菜
三、试剂：0.35mol/L NaCl溶液
实验方法
一、叶绿体的分离与观察
1、选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于150mL 0.35mol/L氯化钠溶液中，装入组织捣碎机中。
2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3~5min。
3、将匀浆用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。
4、取滤液4mL在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。
5、将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
6、沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。
7、取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后在普通光学显微镜下观察。
二、菠菜叶手切片观察
用刀片将新鲜的嫩菠菜叶切一斜面置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖玻片后轻压，置显微镜下观察。

实验结果

一、叶绿体的分离与观察：在显微镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，内部含有较深的绿色小颗粒－基粒。
二、菠菜叶手切片观察
在显微镜下可以看到三种细胞：表皮细胞，保卫细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

作业
1、绘图表示观察结果。
2叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？