第六章微生物

第六章遗传与变异

遗传：微生物在一定条件下，亲代将它的形态结构、生理功能等特征传给子代，使子代在某些性状上与亲代相似，是维持物种稳定的基本保证。变异：微生物在生长繁殖的过程中，子代与亲代间存在着不同程度的差异，变异可不断形成变种和新种，导致微生物的进化。染色质的结构单位是核小体。遗传物质的结构（1）原核生物（细菌、放线菌）：核质（2）真核生物：染色体染色体：DNA+蛋白质真核生物染色体DNA组装不同层次的结构质粒：某些微生物在染色体上外的遗传物质，是微生物细胞内游离于细胞质或能整合入染色体的DNA 分子。特征：质粒一般是闭合、环状、双链DNA分子能自主复制不相容性所携带的基因非细胞生长所必需能从宿主细胞自发消除，但消除频率低。能从一个细菌转移到另一个细菌功能:与致病性、耐药性及次级代谢产物（如抗生素）的合成有关；与遗传物质的转移有关，作为基因工程的载体种类：致育因子（F因子）：抗性质粒（R质粒）： Col质粒：带有编码大肠杆菌素（colicins）的基因。转座因子跳跃基因，细胞中能改变自身位置的DNA。转座因子改变位置行为称为转座。转座因子的种类原核生物中的转座因子根据分子结构与遗传性质可分为3类。插入序列（IS因子），转座子（Tn）转座噬菌体，微生物的变异现象基因型：某一生物个体所含有的全部遗传因子（基因的总和）。表型：某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。变异类型：非遗传型：基因型没有改变，环境因素造成。遗传型：基因型改变，能稳定地遗传，为不可逆地变异。形态结构上的变异如：青霉素使正常细胞变多形鞭毛：H-O变异芽胞：炭疽杆菌42℃培养，失去芽孢菌落变异：如：S-R变异毒力上的改变：代谢上的变异⑴营养缺陷型的变异：酶活力改变，可作为研究遗传的一个良好机会⑵抗药性变异基因突变：DNA链上的一对或少数几对碱基发生置换、插入或缺失而引起的，为DNA分子微小的损伤，也称点突变。染色体畸变：某些理化因子(如X射线、亚硝酸等)除了引起点突变外，还会使大段的DNA发生易位、缺失、重复或倒立，涉及大范围的DNA损伤，常导致微生物的死亡。突变的主要特征⑴稳定的可遗传性⑵可逆性⑶稀少性（突变率低10－9－10－6）⑷独立性⑸自发性与诱变性

⑹不对应性突变类型⑴形态突变型⑵营养突变型⑶高产突变型⑷抗性突变型⑸致死突变型⑹毒力突变型基因突变的分子机制⑴自发突变的机制背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应微生物自身代

谢产物的诱变效应如：过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。对脉孢菌有诱变作用，加入过氧化氢酶可降低这种作用。互变异构效应如：DNA链中，TG常以酮式、AC常以氨基式存在。当T以烯醇式出现，与G互补配对；C以亚氨基形式出现，就和A配对，使基因发生突变，造成自发突变。碱基对发生自发突变的几率约为10-8～10-9。环状突出效应：DNA复制中，如果其中某一单链上偶而产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造

成自发突变。⑵诱发突变及其机理1）碱基对的置换2）移码突变3）染色体畸变1）碱基对置换碱基对置换：转换（嘧啶或嘌呤同类更换）、颠换（嘧啶或嘌呤异类更换）直接引起置换的诱变剂（亚硝酸类、烷化剂类）亚硝酸对含有氨基的碱基对直接作用而诱发碱基对转换。能使碱基中的氨基氧化脱氨，从而使腺嘌呤（A）变成次黄膘呤（H），胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U），由于H 和C 配对，U 与A 配对，因此当DNA 再次复制时，A:T 就转换为 G:C，而G:C 就转换为 A:T。 3）染色体畸变微生物能以多种方式去修复被紫外线损作后的DNA，主要方式有两种：光复活作用。暗修复作用。也称切除修复作用。第三节基因的转移和重组

基因重组：来自不同亲代细胞的DNA分子通过重新组合，成为带有双亲遗传信息的新DNA分子的过程。

基因转移：遗传物质从供体菌转移至受体菌。可通过接合、转化、转导、溶原转变及细胞融合实现。

原核微生物的基因重组

转化

受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换组合把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌的DNA片段称为转化因子。

只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，进行转化作用。

转化过程：

⑴从供体菌提取出转化因子双链DNA片段；

⑵双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合；

⑶在结合位点上，双链DNA中的一条单链逐步降解，同时另一条链逐步进入受体细胞。

⑷进入受体细胞的DNA单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的DNA单链所取代，于是形成了杂种DNA区段；

⑸受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一个恢复，一个形成一个转化子。

接合（c o n j u g a t i o n）

供体菌细胞和受体菌细胞通过性菌毛的作用直接接触，遗传物质自供体菌转移至受体菌，使受体菌获得供体菌的部分遗传性状。

获得供体菌部分遗传性状的受体菌称为接合子。

接合的结果：

F++F-→2F+

H f r+F-→H f r＋F-（多数情况下）

H f r+F-→H f r＋H f r（少数情况下）

F′+F-→2F′

转导（t r a n s d u c t i o n）

通过噬菌体噬菌体为媒介，将供体细菌细胞中DNA片段携带到受体细菌细胞中，从而使受体细菌获得供体细菌的某些遗传性状的现象，称为转导。

根据媒介噬菌体的不同，转导分普遍性转导和局限性转导两类。

普遍性转导：通过完全缺陷噬菌体将供体菌任何DNA片段转移至受体菌。

局限性转导：通过部分缺陷的温和噬菌体将供体菌少数特定基因转移至受体菌。

溶原性转变：由温和噬菌体感染，前噬菌体整合入宿主菌染色体而使其溶原化。

真核微生物的基因重组

有性杂交

准性生殖

微生物变异的实际应用

应用于疾病预防

应用于微生物制药

应用于疾病治疗

检查致癌物质的作用

其他方面：农业、食品、环保

第四节菌种选育和保藏

菌种选育

菌种选育：应用微生物遗传变异的理论，采用一定的手段，在已经变异的群体中选出符合人们需要的优良品种。

目的：提高单位产量，改进品种质量，创造新品种

常用的方法

自然选育

定义：利用菌种的自发突变，通过分离，筛选出优良菌株的过程。

缺点：自发突变率很低，故获得优良菌株的概率极低。

诱变育种

定义：人工地利用各种理化或生物的诱变剂处理菌种，促使微生物发生突变然后再通过筛选，获得具有优良性状的高产变种的过程。

优点：方法简单、投资少、收获大、所需时间短

缺点：缺乏定向性，必需伴有大量的筛选工作

过程

出发菌株的选择

⑴产孢子早而多，生产速度快，营养要求低

⑵选择发酵产量稳定、波动范围小的菌株，

⑶对诱变剂敏感

⑷多选一些

⑸选择纯种

诱变剂及诱变剂量

⑴诱变剂类型

物理：紫外线（常用）、激光、X射线、α射线、β射线、γ射线、快中子等；

化学：亚硝酸、NTG－“超诱变剂”。

生物：噬菌体

⑵剂量或浓度

较低剂量或浓度，出现较多地正变

筛选突变株

⑴初筛

定义：对突变株的生产性能作初步测定的工作

方法：利用和创造形态、生理与产量间的相关指标，如抑菌圈、透明圈

优点：快速简便，工作量小，结果直观性强

缺点：平板上的种种条件与摇瓶培养或发酵罐培养条件有很大差别，结果常不一致

⑵复筛

定义：对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作

方法：将微生物摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。

优点：测得的数据更具有实际意义

缺点：需较多的劳力、设备和时间，工作量大

杂交育种

两个不同基因型的菌株结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新基因型个体的育种方法。

常用方法：细胞融合、原生质体融合

优点：可以将不同菌株的优良性状集中在同一菌株中，扩大变异范围，改变产品的质量和产量，创造新的品种，定向的育种手段。

缺点：操作复杂，周期较长。

代谢控制育种

研究代谢产生的生物合成途径和代谢调节机制的基础上，通过人工诱发突变的技术获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而选择性地使有用的产物大量合成和积累，并在有控制的条件下培养、大量地生产这种有用产物。

基因工程

分离

切割

连接

转化

筛选

表达

菌种保藏

目的

（1）保证菌种的存活率；

（2）减少菌种变异，保持其优良性能；

（3）避免杂菌污染。

原理

用人工方法降低微生物的代谢强度，限制微生物的生长和繁殖，使其处于休眠状态。

操作要求

⑴挑选优良纯种，最好采用它们的休眠体如芽孢、孢子；

⑵有利于休眠的环境条件如低温、干燥、缺氧、缺乏营养物质、加保护剂等，以降低菌种代谢活动的速度，达到延长保存期的目的。

菌种保藏的方法

⑴斜面低温保藏法

⑵液体石蜡封存保藏法

⑶砂土管保藏法

⑷冷冻真空干燥保藏法

⑸液氮超低温保藏法

⑴斜面低温保藏法

原理：低温降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内保持不变。

操作方法：新鲜斜面长好的菌体或孢子，置于4℃冰箱中保存。

保存期：半年

注意点：不能在0℃以下保存；避免水分蒸发；棉塞受潮而长霉污染，可用橡皮塞代替棉塞。

⑵液体石蜡封存保藏法

原理：使菌种与空气隔绝

操作方法：斜面菌种上加入无菌液体石蜡，量高于斜面1cm，后直立于4℃冰箱中保存。

保存期：1年

注意点：不能保存以石蜡为碳源的菌种。

⑶砂土管保藏法

原理：人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。

操作方法:制备砂土管，将孢子或芽孢菌悬液混入砂土管中，真空干燥，置于有干燥器的容器内， 4℃冰箱中保存。

保存期：1-10年。

适用对象：产孢子的放线菌、霉菌、产芽孢的细菌，特别是产抗生素的菌株、放线菌（最好）。

⑷冷冻真空干燥保藏法

原理：菌体、孢子悬液在冻结状态下进行真空干燥，具有干燥、低温、缺氧三项保存条件，菌种处于休眠状态，可以保藏较长时间。

操作方法：成熟的斜面孢子或稳定期细胞用保护剂（脱脂牛奶或牛血清）制成悬液，装入安瓿，-70℃速冻，在冻结状态下于-30℃以下真空干燥，真空状态下封口，冰箱保藏。

保存期：可长期保藏

注意点：霉菌、菇类和藻类不适用

⑸液氮超低温保藏法

原理：微生物在-130℃以下，新陈代谢活动停止，可永久保存微生物菌种。液氮的温度可达

-196℃，可用于永久保存菌种。

操作方法：菌种置于10％甘油或二甲基亚砜保护剂中，密封，先降至0℃，再以1℃/min降温，直至-35℃，然后将安瓿管放入液氮罐或超低温冰箱中保存。

保存期：可长期保藏。

适用对象：可适用于所有的生活细胞

菌种保藏的管理程序

⑴定期进行质量检验

检验项目：

残存率（保藏一段时间后的活菌数/保藏前的活菌数）

纯度

生产能力

⑵菌种保藏信息项目

包括：内部保藏号、来源或相当的其他机构保藏号、微生物学名、存放日期、已知的产物与产率、病原性、分离培养基与方法、生长培养基、最适温度和pH值、在一定培养基上的培养特征、用途和保藏方法

菌种保藏机构

菌种保藏机构的任务是收集、保藏和供应各种菌种，并提供菌种的鉴定、专利菌种的寄存、咨询和人员培训等服务。

我国的菌种保藏机构是中国微生物菌种保藏管理委员会，下设七个菌种保藏管理中心，分别负责相应菌种的收集、保藏、管理、供应和交流。

菌种退化和复壮

⑴菌种退化的概念

当变异导致菌种的遗传性状发生改变，造成菌种不纯和生产能力下降，就称为菌种退化。

⑵菌种退化的原因

基因突变（突变的可逆性）

环境条件的影响（保藏环境）

传代次数的影响（次数越多，越容易退化）

⑶退化菌种的复壮

使退化的菌种恢复原有性状的措施

具体措施：

分离纯化：从退化的群体中找出尚未退化的个体

通过适当的宿主：很多微生物都可以接种在相应的动、植物或者昆虫宿主上复壮

控制传代次数

创造良好的培养条件

采用合适的保藏方法

⑷对菌种退化最好的措施是预防：即在菌种没有退化前，定期进行纯种分离和性能鉴定，以保藏性能稳定的优良菌种。