无脊椎动物免疫功能性物质概述

无脊椎动物免疫功能性物质概述

专业:动物学姓名：李波学号：S2*******

无脊椎动物免疫

脊椎动物在长期进化过程中形成了巧妙而又复杂的免疫系统，其免疫机制中既有先天性免疫(innate immunity)又有获得性免疫(acquired immunity)，而无脊椎动物缺乏真正的抗体，因此目前认为无脊椎动物仅具有先天性免疫功能，而且，无脊椎动物对病原体的防御是非特异性的。无脊椎动物的免疫反应主要通过物理屏障、吞噬作用、溶菌作用和凝集作用等清除病原菌的侵入和外来异物。因此，缺乏免疫球蛋白的无脊椎动物主要是通过吞噬细胞和非特异性免疫因子来发挥免疫功能的，即细胞免疫和体液免疫，且二者密切相关。

1．细胞免疫

无脊椎动物重要的机体防御机能主要由免疫细胞通过吞噬、包被以及形成结节来实现的，亦由固着性细胞产生的吞噬作用和胞饮作用来实现的。

病原或异物突破机体的防御屏障进入机体后被快速滤入具有滤过作用的组织和器官，在这些部位病原的清除和杀灭由血清和血细胞共同作用来完成，参与吞噬杀菌过程的主要是吞噬细胞，包括血淋巴中的血细胞和淋巴器官中的淋巴细胞。

当病原体穿透体表物理屏障进入到甲壳动物的血淋巴后，会引发一系列的细胞防御反应，主要包括吞噬作用（phagocytosis）、结节形成（nodule formation）、包囊作用（encapsulation）和凝集反应（aggregation）等。吞噬作用是免疫细胞摄取入侵颗粒，并利用胞内产生的活性氧将其杀死的过程。如果侵入体内的病原体数量太多或颗粒太大而不能被吞噬，大量的血细胞会协同作用来封锁病原体，这种现象分别被称作结节形成和包囊作用。血细胞还参与蛋白酶原、凝集酶原以及酚氧化酶原等的相关物质的合成与储存。

吞噬作用在动物界中普遍存在，低等的单细胞动物通过吞噬作用摄取食物，在高等的多细胞动物中，吞噬作用则是控制和清除外来物质侵扰的重要手段。目前已证实甲壳动物的血细胞的确能够吞噬入侵体内的细菌、真菌、洋红颗粒、松脂等，其吞噬过程包括：异物识别、粘连、凝集、摄入、清除等。对异物的识别可能是由该物质的表面性质和血细胞膜上的受体共同决定的。

包囊作用是针对单个细胞无法吞入的较大异物发生的反应。甲壳动物机体首先将外来物质隔离，若异物颗粒直接超过10μm（如某些真菌、寄生虫等），则不能通过单个细胞的吞噬作用摄入，而是在其周围包被数层成纤维细胞而形成包囊，构成包囊的细胞之间形成致密的纤维状连接，可以起到防止被包围的入侵物逃逸的作用。

甲壳动物的血细胞内含有细胞黏附蛋白，能够将细胞和外来异物结合形成紧密凝集状的结节，这些结节就是黏附了外来入侵物的血细胞的聚集体，并且通常在酚氧化酶的作用下发生黑化反应。研究表明，当把外来物注射到动物体内时，循环系统中血细胞数目会显著下降，血细胞发生凝集反应，严重时能阻塞鳃丝的维管结构。

2．体液免疫

无脊椎动物缺乏免疫球蛋白，体液免疫是靠血淋巴中的一些非特异性的酶或因子来进行的。

（1）酚氧化酶

酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）又称为酪氨酸酶，能够催化单酚羟化成二酚（如多巴），并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。这些黑色素协同具有细胞毒性的醌类中间产物沉积到入侵的病原体周围，起到隔离杀死病原体的作用，即所谓的黑化包被反应。目前，己从数种无脊椎动物中分离纯化出proPO和PO，并对此作了鉴定。依据物种的不同，它们的最适pH值、最适反应温度、抑制剂等性质有所不同。在甲壳动物中proPO一般为单体蛋白，分子量一般在70-80 kD左右，被激活后所产生的PO的分子量一

般约为60-70 kD。（1 kD=1/N g）

无脊椎动物的酚氧化酶大多为一种铜金属酶。目前分子生物学研究也发现，proPO及PO一般都有两个功能性的Cu2+结合位点，CuA和CuB。每个铜原子周围的氨基酸残基高度保守，而且CuA和CuB分别结合了三个组氨酸。CuB结构在各种动物中比较一致：两个组氨酸位于一个α-螺旋上，而另一个组氨酸则位于另一个α-螺旋上。CuA结构在不同物种间可能有所差异，在节肢动物中，CuA结构与CuB的结构相同；而在软体动物中，两个组氨酸分别位于两个α-螺旋上，而另一个组氨酸则位于其中一个α-螺旋之后的回环结构中。

在无脊椎动物中，PO一般以无活性的酶原形式——酚氧化酶（Prophenoloxidase,proPO）存在，无活性的proPO在丝氨酸蛋白酶作用下转变成具有活性的PO。血细胞以脱颗粒的方式释放proPO到血淋巴中，随后无活性的proPO被酚氧化酶原激活酶（prophenoloxidase activating enzyme/prophenoloxidase-activating proteinase,PPA/PAP）激活转变成有活性的酚氧化酶（PO）。在PO的催化下，酚被氧化成醌，再经一系列生化反应，最终形成黑色素。黑色素能够隔离病原体，避免它们与宿主接触，从而达到免疫效果，黑色素常常在节肢动物的体表形成黑色斑点，形成的色素沉着对机体起到保护作用。酚氧化酶原激活系统（prophenoloxidase-activatedsystem，proPO-AS）是由proPO、PO、丝氨酸蛋白酶、模式识别蛋白和蛋白酶抑制剂构成的一个复杂的级联反应系统，这一过程类似于高等动物中的补体激活途径（补体并非单一分子，而是存在于血清、组织液和细胞膜表面的的一组不耐热的经活化后具有酶活性的蛋白质，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，故被称为补体系统。补体广泛参与机体微生物防御反应以及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学作用的效应系统和效应放大系统）。

酚氧化酶在无脊椎动物非特性免疫中的功能

在较高等的无脊椎动物如节肢动物中，酚氧化酶（PO）具有多种功能，它不仅参与黑色素形成、角质的硬化和伤口愈合，而且在宿主的防御反应中还作为非自身识别系统发挥功能。PO是黑色素形成的关键酶，PO在伤口处催化产生黑色素沉淀以防止血淋巴丢失，并阻止入侵的微生物乘机进入，黑色素通过愈合伤口和封闭病原菌，在节肢动物的防御反应起重要作用。黑色素形成过程中伴随着活性氧的产生，同时也产生具细胞毒性的半醌和三氢酚。半醌有结合亲核物质的特性，醌具毒性的分子基础可能是它们结合到外来细胞的表面，通过形成黑色素包囊来隔离入侵的外来物，并通过醌和其它的中间产物(如醌甲基化物和半醌)产生氧的还原形式来摧毁这些入侵的外来物如病原菌或寄生虫。甲壳动物中有活性的PO参与宿主的防御反应—在识别异物、释放调理素(opsonin)、促进血细胞的吞噬和包囊反应以及促进颗粒血细胞和半颗粒血细胞释放颗粒、产生多种介导凝集因子及抗菌肽等免疫功能方面发挥着重要的作用。

（2）凝集素

动物的凝集素分子按照糖识别域肽链序列分有三类：C型凝集素，S型凝集素，P型凝集素以及一些目前尚未确切归类的凝集素。C-型凝集素因其活性需钙离子而得名，均位于细胞外；S-型凝集素因其活性的完全表达通常依赖巯基而命名；P-型因其主要配体为甘露糖-6-磷酸盐（mannose-6-phosphate）而命名。其中最主要的凝集素分子为C型凝集素和S型凝集素。

S型凝集素在细胞内和细胞外均有分布，在它们的空间结构中不存在二硫键，主要识别

半乳糖分子。C型凝集素是一个庞大的膜蛋白和细胞外蛋白的超家族。这个家族的共同特点都拥有一个二硫键丰富，且与钙离子结合的CRD结构域。绝大多数动物凝集素分子都是仅通过活性鉴定和糖基识别特异性加以归类的，而很少考虑其生物学活性和进化分类的。越来越多的证据表明C型凝集素在免疫系统中起了关键作用。

C-型凝集素的的结构特征

C-型凝集素是最早被发现的动物凝集素。早在19世纪，蛇毒凝集素的凝集效应就已经被发现。1906年发现的牛Conglutinin是属于Collectin家族成员。1988年，Drickamer建议将动物凝集素分成若干家族，结构上类似于唾液酸蛋白受体的钙离子依赖型凝集素被归于C-型凝集素家族。自此，C-型凝集素家族成员数量快速增长，大量C-型凝集素被从不同的动物中发现，而其中许多已被证实不具备凝集活性。狭义上的C-型凝集素是指一类钙离子依赖型的糖识别动物凝集素。在随后的生物化学和基因序列结构分析发现，此类蛋白的凝集活性均来自于一类统一的结构：糖识别结构域（Carbohydrate recognition domain，CRD）。所有的C-型凝集素均包含该结构域，而其他类型的凝集素则没有。对不同种类的C-型凝集素结构域研究发现，结构域上存在4类钙离子结合位点。如图所示，位点1，2，3出现于结构域顶部，而位点4则出现在结构域底部。钙离子结合位点的形成会受到如序列、结晶条件等多方面的影响。C-型凝集素具有结构异质性和异物结合位点的特异性，对热不稳定(56"C 15min即可失活)，其活性需Ca激活；

凝集素功能①当外来入侵物(细菌、病毒等)通过某种机制刺激血细胞合成并释放凝集素，使外来入侵物发生凝集并失去活性，然后血细胞对其进行吞噬；②免疫识别因子③在其它方面包括细胞的迁移，细胞间相互作用等扮演重要角色。

（3）血蓝蛋白

血蓝蛋白(hemocyanin，HC)是位于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，脱氧状态为无色，结合氧状态为蓝色。血蓝蛋白的主要生物学功能与机体内的输氧有关，它与血红蛋白(hemoglobins)和蚯蚓血红蛋白(hemerythreins)并称为动物界三种呼吸蛋白。血蓝蛋白最早是以一种类酚氧化酶的酶的形式出现的，然后出现了不同的血蓝蛋白亚基，最后变成两种功能截然不同的含铜蛋白。

血蓝蛋白可分为两大类，即节肢动物的血蓝蛋白和软体动物的血蓝蛋白。

节肢动物血蓝蛋白由分子量大约是72kDa的亚基组成。尽管观察到这些亚基有明显的异质性，但是所有节肢动物的Hc亚基可能都含有一个序列完全相同的三维结构（图1.10B）。每个亚基折叠成三个域（domain）。其中第二个域是α螺旋区，螯合一对Cu离子，可结合一个O2。每个铜离子受三个组氨酸残基的调节，并处于4个α螺旋的中央（图1.9 B）。在体内，节肢动物Hc由不同倍数的六聚体组成（1×6，2×6，4×6，6×6，8×6-mer），根据物种的不同而不同。节肢动物类型的Hc的四级结构如图1.10A所示。

软体动物的血蓝蛋白

软体动物HC的分布不如节肢动物的那样广泛，似乎仅限于腹足类和头足类。近来，德国Markl研究组在1.2 nm水平上用冷冻电镜术(cryoelectron microscopy)观察了鲍鱼Holiotis tuberculata的HC，获得了其20聚体组成的中凹的圆柱体四级结构（图1.11A）。用X光晶体衍射法已在头足类的章鱼中获得了软体动物HC的三维结构构象(图1.11B)。由图1.11A，软体动物HC的亚单位很大，相对分子质量可达350000～450000 Da，每个亚单位由7～8个在大小上约为50000 Da的相似的功能单位(FU)组成，分别命名为a～h。软体动物Hc的三维构象则由2个域组成，第1域为α螺旋区，螯合一对Cu离子，可结合一个O2分子，第2域为β折叠块，可能也含有Ca，此金属可能与四级结构的维持有关。

血蓝蛋白功能其主要功能是氧的载体,此外还具有调节渗透压、储存蛋白质、脱皮激素转运和产生抗真菌肽等。而且,在胰岛素、SDS和肌体内凝集因子、抗菌肽等生物防御因子的作用下,能转化为酚氧化酶。在节肢动物和软体动物中已有报道血蓝蛋白有酚氧化酶活性。

（4）抗菌肽

动物体中具有抗菌活性的多肽被定义为抗菌肽(anti—microbialpeptides)，是动物体先天反应中的重要部分，抗菌肽具有广谱的抗菌活力。

抗菌肽(anti一microbialpeptides)是具有抗菌活性短肽的总称。它是在诱导条件下，动物免疫防疫系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质。作为免疫防御系统的一个重要组成部分，原核生物、植物、动物(包括脊椎动物和无脊椎动物)都可以产生由基因编码、核糖体合成的抗菌肽。许多抗菌肽相继得以分离和纯化。这些抗菌肽的共同特征为:碱性多肽;N端多碱性氨基酸残基;C端均酞胺化;具有两性结构;分子量为4kDa左右。

抗菌肽是鱼、虾、贝等水生动物抗病防御系统的主要成分之一。

一般根据抗菌肽分子的氨基酸序列，二级结构以及其功能不同，可将抗菌肽分为三大类。第一类为环型抗菌肽，因其富含半胱氨酸形成分子内二硫桥，而呈发夹式口片层结构(hairpin—like~sheet)或者形成a螺旋与p片层结构的混合构造(apm0tif／Csap)。第二类也是最早发现的一类抗菌肽，具有a一螺旋结构的两亲线性多肽。第三类为富含脯氨酸或／和甘氨酸线性多肽，有时它们可占氨基酸组成的25％以上，富含脯氨酸抗菌肽一般呈二联体或者三联体。

目前普遍认为，抗菌肽可以与病原体的细胞膜作用，增加膜的渗透性，从而导致病原体的死亡。线形亲水脂的a一螺旋分子，主要通过阳离子与细胞膜上的阴离子相互作用，从而破坏细胞膜的完整性。富含半胱氨酸的分子，如防御素(Defensins)，则是在磷脂膜上通过形成离子通道增加细胞膜的通透性。另外的一些分子还可能进入细胞内，直接与DNA、RNA 作用，导致细胞死亡。

抗菌肽功能抗菌肽作用于细胞膜上形成孔道，使细胞内容物特别是钾离子大量渗出，正常细胞膜去极化导致细胞的死亡；诱导降解细胞壁的水解酶激活细胞致死的过程；扰乱细胞膜双层结构脂类分子的正常分布，而干扰细胞膜的功能；或损伤细胞内的重要的靶分子等。目前已知抗菌肽对100多种细菌以及某些真菌、原生动物、病毒等有杀灭或抑制作用。（5）溶菌酶

溶菌酶分为c型溶菌酶（HEWL)、g型溶菌酶（GEWL）、i型溶菌酶（TjL）三种。目前的结论是i型溶菌酶广泛分布并且只分布于无脊椎动物中。

尽管这三种类型的溶菌酶的一级序列之间的相似性非常低，它们的三维结构却展现了惊人的相似性(图1.8)。HEWL是第一个解出三级结构的溶菌酶。它包括两个结构域和中间一个很深的裂缝，裂缝包含了其活性位点。一个结构域主要是由β折叠组成，而另一个则包含了更多的螺旋结构。而与之类似的是，GWEL的三级结构也是由一个包含了活性位点的裂缝将一个较小的β折叠组成的结构和一个较大的“螺旋组成的结构域分开。而且，TjL的三级结构与HEWL相比也是惊人的相似。TjL包括6个α螺旋，一个β折叠和一个结合底物的裂缝。

溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁质酶(Muramidase),它是一种碱性蛋白,主要杀灭革兰阳性菌,能够水解构成细菌细胞壁成分的多糖胞壁质中的N2乙酰葡萄糖胺与N2乙酰胞壁酸之间的1,4糖苷键,从而使细菌的细胞壁破损,细胞崩解。在作用时可观察到溶菌现象,故因此而得名。溶菌酶广泛存在于各种动物的血细胞和血液中,在免疫活动中发挥着重要的作用。溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础,当吞噬细胞对异物颗粒进行吞噬和包囊后,细胞内的溶酶体会与异物进行融合,发生脱颗粒现象,外来入侵的微生物可以被其中的溶菌酶等直接杀死,随后再进一步将它们水解消化,并将水解消化后的残渣排出细胞外。

（6）蛋白酶抑制剂

目前已在甲壳动物的血淋巴中发现了多种蛋白酶抑制剂，其中比较重要的有两种即枯草杆菌蛋白酶抑制剂和a一巨球蛋白。

①枯草杆菌蛋白酶抑制剂枯草杆菌蛋白酶抑制剂是一种热稳定的(可抵抗80℃高温15min)、耐酸碱性(pH范围为1．0～儿．5)的蛋白质，分子量为23kD，等电点pI为4．7。纯化的枯草杆菌蛋白酶抑制剂能抑制枯草杆菌蛋白酶和链霉蛋白酶，以及某些寄生菌(如A．astaci)分泌的蛋白酶，而对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶无抑制作用。枯草杆菌蛋白酶抑制剂只能抑制病原菌分泌的蛋白酶，而对非病原菌分泌的蛋白酶以及本身的蛋白酶无影响。蛋白酶抑制剂，是作为表皮中抵抗微生物感染的有力屏障。

②a一巨球蛋白a一巨球蛋白是动物血浆中一种高分子量的蛋白酶抑制剂，单体分子量为180～185kD，其多肽链中的硫醇区具有高度保守性，在亲缘关系较远的生物如螫虾、马蹄蟹、人类等都几乎相同。甲壳动物血淋巴中的a一M具有同哺乳动物相同的特性和功能。a一M的主要作用是清除循环系统中的蛋白酶：由于受伤或细菌入侵而产生的蛋白酶对机体内正常的组织或器官是有害的，血浆中的a一M构象改变，使硫醇区的稳定性降低，与有害的蛋白酶非共偷结合形成蛋白酶复合物；在细胞的表面具有—M受体，能同蛋白酶

复合物发生特异性的结台，然后通过某种机制将蛋白酶复合物迅速从循环系统中清除。（7）溶血素

溶血素是一种非特异性的免疫防治因子，它存在于多种无脊椎动物血清中。其作用可能类似于脊椎动物的补体系统，可溶解破坏异物细胞，参与调理作用，而且还具有溶菌活性，可以溶解革兰氏阳性菌，并且可能与酚氧化酶原的激活系统有关。在无脊椎动物溶解系统中溶血素可以单独作为调理因子或通过蛋白水解酶发挥作用。

（8）细胞毒活性氧

血细胞在吞噬侵入体内的外来病原微生物时，会释放出一些毒性物质来杀死和消化病原微生物，这些毒性物质中有一类是细胞毒活性氧(R015)。这一现象最初是在哺乳动物的嗜中性白细胞和巨噬细胞中发现的，称为呼吸爆发。

（9）超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)

超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶,作为活性氧参与清除体内的自由基,在防御机体衰老及防止生物分子损伤等方面具有极为重要的作用。当微生物入侵被血细胞包裹后,机体产生一系列抗微生物物质,这些物质包括高活性氧种类如超氧离子(O2-),过氧化氢(H2O2),氢氧根离子(OH-)和单线态氧(O2)。尽管氧是需氧细胞的必需成分,但同时,呼吸爆破中产生的高活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)也能引起潜在的细胞毒问题。因而有效而快速地清除活性氧物质是机体行使正常功能和存活的关键。这就由抗氧化防御机制来执行,其中包括超氧化物歧化酶清除超氧离子。

（10）其它免疫因子

与免疫有关的其它免疫应答因子：如凝血因子、LPS结合蛋白、p一糖普结合蛋白(BGBP)、类Ig蛋白。迄今为止，人们在无脊椎动物中尽管还没发现抗体的存在，但许多功能各异的IgsF分子，陆续得以分离、纯化和鉴定。它们一般是细胞表面结合分子，主要参与细胞与细胞之间的相互作用。根据其功能的不同，无脊椎动物lgsF分子大致可以分为与免疫和细胞程序性死亡相关IgsF分子、分泌型IgSF分子、同嗜性粘附IgSF分子、异嗜性粘附IgSF分子、激酶IgSF分子和磷酸酶IgsF分子等六大类。