实验报告脂类的化学——苏丹三染色

一．实验目的

1.熟悉脂类的显示技术。

2.了解脂类在细胞中的分布。

二．实验原理

脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。

脂肪不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂类标本一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定液。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。

脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。

用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。

用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法：冰冻切片，明胶包埋冰冻切片，铺片法。

本实验中使用的脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。

苏丹染料是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪。当它与含有脂类的标本接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂结构中使其显色。

三．实验仪器及试剂

1.仪器

解剖盘，解剖剪，镊子，盖玻片，载玻片，显微镜，胶头滴管

2.试剂

苏丹Ш染液，甲醛钙溶液，70%乙醇溶液，蒸馏水

3.材料

小白鼠一只

四．实验步骤

1.断头法处死小鼠，置于解剖盘中。剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，

并在其下放置一载玻片，用剪将连同载玻片和其上粘着的肠系膜取下。滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定分钟。

2.将蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管吸取液体以冲净固定液。

3.用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。

4.用苏丹Ш染色30分钟。

5.吸干溢出的染液，擦净盖玻片表面及周边，显微镜观察。

五．实验结果

图1 小鼠肠系膜毛细血管及周围脂肪细胞

图2 小鼠单个脂肪细胞，细胞核呈“指环状”

六．讨论与结论

1.实验中出现的问题

在这次实验中，我们的小鼠肠系膜标本染色不深，很多地方甚至出现了没有染上的现象。虽然最终还是观察到了单个脂肪细胞的形状，但是由于染色太浅，观察到的结果不是十分理想。经过思考，我认为可能是我们在染色的时候没有及时向拨片上补充染液，中间只添加了一次染液，导致染色效果不好。也有可能是选取小鼠的肠系膜毛细血管处过厚，多层细胞堆积在一起。

2.注意事项

1)染色后，要用吸水纸吸去染液后再观察，这样只有脂肪细胞被染色，便于观察。

2)在制片时动作一定要轻，以免将小鼠的肠系膜破坏。

3)观察时要选取有毛细血管的肠系膜部分，因为血管周围一般有脂肪组织保护。

4)染色过程中要不断滴加苏丹三染液，防止装片干燥，影响实验结果。

5)不要用力按压盖玻片，以免压破脂肪细胞，影响观察。

七．拓展知识

1.石蜡切片制备：

石蜡切片的制作过程主要包括：取材、固定、脱水、透明、透蜡、封藏、透明、染色、贴片、切片、包埋。

2.糖类细胞化学

PAS法显示糖类

原理：过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合成红色，定位于胞浆上。

结果：PAS阳性为红色，细胞核蓝色。

3.核酸细胞化学

Feulgen反应法

原理：标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。

甲基绿-派洛宁法

原理：甲基绿—派洛宁（methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA 选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。

其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。

即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。

Giemsa染色法

原理：Giemsa染液由天青，伊红组成，染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。

嗜酸性颗粒碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果染成粉红色，称为嗜酸性物质；

细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合染成紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

结果：MGG染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。

苏木精-伊红（HE)染色

原理：DNA两条链上的磷酸基向外，带负电荷呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。

结果：细胞核呈蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。

4.蛋白质细胞化学

碱性蛋白与酸性蛋白显示

以酸性氨基酸成分为主的蛋白质为酸性蛋白；以碱性氨基酸为主的蛋白质为碱性蛋白。细胞核内有组蛋白（碱性蛋白）及少量酸性蛋白，细胞质中主要有酸性蛋白，标本经三氯醋酸处理抽提掉核酸后，用不同PH值的快绿染液分别染色，使细胞内的酸

性蛋白和碱性蛋白质显示出来。

酸性磷酸酶显示

当酸性磷酸酶与含有磷酸酶的作用底物一起保温时，能水解磷酸酯使其释放出磷酸基，磷酸基仅为与底物中存在的铅盐结合形成无色的磷酸铅沉淀物，当用黄色的硫化铵作用该沉淀时可形成黄棕色或棕黑色的硫化铅沉淀；进而使细胞中酸性磷酸酶显示出来。

过氧化物酶显示

细胞内的过氧化氢酶可以催化过氧化氢氧化联苯胺成蓝色或棕色产物，蓝色为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙，通过产物颜色间接显示出细胞内过氧化物酶的分布。

测定琥珀酸脱氢酶显示

琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种：

①硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法

②铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法

③TTC（氯化三苯四氮唑）法

④MTT法

⑤NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法