乳酸菌的培养检测方案

品质管理检测项目

细菌形态学分类

一乳酸杆菌

乳酸杆菌的基本属性：

乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。

无芽孢，革兰氏染色呈阳性。微好氧，厌氧发酵，最适温度30~40摄氏度，最适PH值为5.5~6.2，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%~10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。

（一）实验仪器和试剂：

实验仪器：

现有的仪器：

欠缺的仪器：

培养基和试剂：

①培养基：BCP培养基、MRS培养基和SL培养基

BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水lO00ml，pH7 0；

MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重量(g) 牛肉蛋

白粉10 ，鱼肉汁10 ，酵母浸出汁粉5 ，葡萄糖20 ，醋酸钠5 ，柠檬酸二铵 2 ，吐温80 0.1 ，硫酸镁0.58 ，硫酸锰0.28 ，蒸溜水1 000ml ，备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 。

乳酸杆菌选择性琼脂SL：酪蛋白水解物10g；酵母提取物5g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠（CH3COONa？3H2O）25g；MgSO4？7H2O 0.58g；琼脂15g；葡萄糖20g；吐温80 1.0ml；磷酸氢二钾6g；FeSO4？7H2O 0.03g；MnSO4？4H2O 0.15g。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在500ml的沸水中，溶解其他组分在500ml的水中，用冰醋酸调pH=5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。

乳酸杆菌在液体培养基中的生长状况

背景资料：

培养基有MRS培养基、RS MA培养基、番茄汁琼脂培养基。当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS培养基对其进行分离。一些常见的食品污染菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等在MRS培养基上生长较差或几乎不生长，从而减少了杂菌的污染，降低了分离难度。目前MRS培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基。常用于从乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。

番茄汁琼脂培养基，这是一种传统的用于分离乳酸杆菌的培养基，此种培养基由于含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较为费时费力，目前已逐渐被MRS 等培养基所代替。

某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质(例如肠道) 内进行乳酸杆菌的分离。APT( All Purpose Tween) 培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的Rogosa SL( Rogosa Sodium Lactate Modified ) 完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸杆菌的分离。Briggs琼脂培养基和s L( Sodium Lactate) 培养基常用于酸奶中乳酸杆菌分离。

（二）检测内容、流程、方式：

内容：1 通过对水体当中的的乳酸杆菌的筛选培养，最后计数得到相应水体当中的乳酸杆菌的数量。方法为：逐级稀释法。2 乳酸杆菌的定性

流程：

①采集：每个采集点各自采集10ml的池塘水，经过过滤杂质（固体），冷冻运送等环节送到实验室内部。

②稀释平板测数法

1、样品稀释液的制备

准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL 无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀释菌液。

用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10－7、10－8、10－9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10－4、10－5、10－6稀释度，测定放线菌数量时，采用10－3、10－

4、10－5稀释度，测定真菌数量时，采用10－2、10－3、10－4稀释度。

2、平板接种培养

平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。

⑴混合平板培养法

将无菌平板编上10－7、10－8、10－9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10－9稀释液各1mL放入编号10－9的3个平板中，同法吸取10－8稀释液各1mL放入编号1×10－8的3个平板中，再吸取1×10－7稀释液各1mL放入编号1×10－7的3个平板中，由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换。然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在30℃下培养。至菌落长出后即可计数。

⑵涂抹平板计数法

涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至菌落长出后即可计数。

⑶划线法（不采用，因为需要对乳酸菌和大肠杆菌进行筛选培养）：

用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线（图示）。划线可按以下两种方式进行，一种为交叉划线法，是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次“Z”字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180°，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。划线法实质上属于一种“由点到线”的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。

以上各种分离法，都应按无菌操作进行。所用的培养基若在倒平板前，按50μg/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用），效果会更好。

3、培养（16个小时即可）

将上述接种过土壤悬液的平板倒置，于28～30℃培养，至长出菌落为止（24～36h）。

4、挑菌纯化

在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。

5、计数

选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30～300的平板，分别按“稀释平板测数法”中的“混合平板测数法”和“涂抹平板测数法”中的公式计数。这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。

（四）数据的收集整理：数据库模板的建立

二大肠杆菌

（一）大肠杆菌的基本属性：

（二）仪器和试剂：

仪器：

试剂：

液态培养基：配制每升培养基,应该在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g ，NaCl 10g 。摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min。

固态培养基：LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。LB固体培养基倒板

1.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉。

2.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。

（1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板

（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50℃时加抗生素或其他必加成分，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。(抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度50μl/ml)新制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收，可在室温下放2-3天，或37℃放半小时，然后4℃保存备用。

（3）LB培养基中所用抗生素终浓度：氨苄青霉素-50μl/ml；氯霉素-20μl/ml；庆大霉素

-15μl/ml；卡那霉素-30μl/ml；春日霉素-1000μl/ml；壮观霉素-100μl/ml；链霉素-30μl/ml；四环素-12μl/ml。

（三）培养检测方法：

乳品中大肠杆菌检测国标GB/T4789.38-2008的具体步骤及达标的标准：

第一法大肠杆菌MPN 计数

操作步骤

6.1、样品的稀释

6.1.1、固体和半固体样品：以无菌操作取259 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r / min ～1000r/ min 均质1 min～2 min ，制成l:10 样品匀液，或置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。

6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。

6.1.3、样品匀液的pH 值应在6.5～

7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或1mol/L 盐酸（HCI）调节。

6.1.4、用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其棍合均匀，制成1:100 的样品匀液。

6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。

6.2、初发酵试验

每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3 管月桂基磺酸盐胰蛋白陈（LST ）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL ，则用双料LST 肉汤）。36℃±1℃培养24h±2h ，观察小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h～48h 内产气的LST 肉汤管数。如所有LST 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行复发酵试验。

6.3、复发酵试验用接种环分别从所有培养48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中取培养物1 环，移种于已提前预温至45 ℃的EC 肉汤管中，放人带盖的44.5℃ ±2 ℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h ，检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h ±2h 。记录在24h 和48h 内产气的EC 肉汤管数。如所有EC 肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN 结果；如有产气者，则进行EMB 平板分离培养。

6.4、伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB 平板，36 ℃ ±1 ℃培养18h～24h 。检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

6.5、营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5 个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36 ℃ ±1 ℃，培养18h～24h 。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。

6.6 、生化试验

6.6.1、靛基质试验：将培养物接种蛋白陈水，36 ℃±1℃培养24h±2h 后，加Kovacs 靛基质试剂0.2 mL～0.3 mL ，上层出现红色为靛基质阳性反应。

6.6.2 、MR -VP 试验：将培养物接种MR -VP 培养基，36 ℃ ±1 ℃培养48h±2h 。移取培养物1mL至13 mm×100mm 试管中，加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 ％氢氧化钾溶液0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h ，如出现伊红色，为VP 试验阳性。将MR 一VP 培养液的剩余部分再培养48h 后滴加5 滴甲基红指示剂。培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。

6.6.3、柠檬酸盐利用试验：将培养物接种Koser 氏柠檬酸盐肉汤，36℃±1 ℃培养96h±2h,记录有无细菌生长。

6.7、大肠杆菌MPN 计数的报告大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC 生化试验为＋＋- -或-＋- -。只要有 1 个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的

LST 肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据LST 肉汤阳性管数查MPN 表，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌MPN 值。

第二法大肠杆菌VRB - - MUG 平板计数法

8、样品稀释按6.1 进行。

9、检验选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1 mL 注人两个无菌平皿。另取1 mL 稀释液注人一个无菌平皿中，作空白对照。将45 ℃±0.5 ℃的VRB 琼脂10 mL～15 mL 倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL～4mL VRB-MUG 琼脂覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 ℃±1 ℃培养18h～24h 。选择菌落数为10～100 的平板，暗室中360 nm～366 nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用已知MUG 阳性菌株（如大肠杆菌ATCC 25922 ）和产气肠杆菌（如A TCC 13048 ）做阳性和阴性对照。

10、大肠杆菌平板计数的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU /mL ）表示。

第三法大肠杆菌PetrifilmTM 测试片计数法

12、样品稀释按6.1 进行。

13、检验

13.1、接种和培养

选取2 个～3 个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面，。揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1ml匀液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下，将压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使样品匀液均匀覆盖于圆形的培养膜表面，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20 片，36℃±1 ℃培养。肉、家禽和水产品，培养时间为24h±2h；其他食品，培养时间为48h±2h 。

13.2、判读

可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、PetrifilmTM 自动判读仪计数。蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也判定为大肠杆菌。圆形培养膜边缘及边缘以外的菌落不计数。当测试片出现大量气泡、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品匀液，重新检验。

14 大肠杆菌测试片计数的报告选择菌落数在15～150 之间的稀释度，两张测试片菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以CFU/g ( CFU/mL ）表示。

如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ，计数最低稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，以“小于1 乘以最低稀释倍数”报告；如果所有稀释度的菌落数都大于150 ，计数最高稀释度测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150 个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20 ，即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20 cm " ）。

（四）数据库模板的建立：

三一般细菌

（一）一般细菌的基本属性：

（二）仪器和试剂：

（三）培养检测方法：

（四）数据库模板的建立：四寄生虫