检验程序确认和验证

检验程序确认和验证（2）

测量区间定义? measuring interval

?又称工作区间 working interval

?在规定条件下，由具有一定测量不确定度的测量仪器或系统能测出的一组同类量的量值（VIM）。

–注1：在某些领域，也称“测量范围”。

–注2：测量区间下限不应与“检出限”相混淆。

线性、线性范围定义

?线性：linearity

?指待测标本中能直接按比例关系给出分析物浓度结果的能力。

注1：线性代表整个测量系统的反应。

注2：一个测量系统的线性由不同已知浓度的分析物测定得到。

?线性范围：linear range

?指测量系统所能覆盖的可接受线性范围，非线性误差小于设定标准。

分析测量范围定义analytical measurement range 患者标本未经任何处理（稀释、浓缩或其他预处理），由测量系统直接测得的可靠结果范围，在此范围内，一系列不同标本分析物测量值与实际浓度呈线性关系。

临床可报告范围定义clinical reportable range

是定量检测项目向临床能报告检测范围，患者标本可经稀释、浓缩或其他预处理。

区别

线性评价-CLSI文件

?EP6-A，Evaluation of the Linearity of Quantitative MeasurementProcedures，2003

?EP10-A3，Preliminary Evaluation of Quantitative Clinical Laboratory Measurement Procedures，2006

EP6-A方案和要求

1.设备熟悉阶段

–检验人员应熟悉检测系统的操作、正确的质控和校准、恰当的标本制备。

2.线性评估实验

–实验室验证厂商声明：5～7个浓度*重复2次。

–厂商建立新方法：9～11个浓度*重复2～4次。

–实验室改良已建立的方法：7～9个浓度*重复2～3次。

–时间：最好一天内完成。

EP6-A方案和要求

?样品准备：可接受的基质

1.病人混合标本：1份标本的分析物浓度应接近可报告范围上限，另1份标本的分析物浓度应接近检出限。

2.用推荐稀释液稀释病人混合标本：标本中分析物浓度应为高浓度，稀释液应按厂商推荐。

3.病人混合标本添加分析物：若没有干扰的话，含分析物的添加物无需高纯物质。

4.病人混合标本用低浓度经处理的材料稀释或经处理的混合材料稀释。

5.商品质控品/校准品/线性材料。

6.病人混合标本用生理盐水或其他稀释液稀释。

7.不稀释或过度稀释的商品质控品。

8.水溶液。

EP6-A方案和要求

?实验要求

–测量顺序：应随机。如存在明显携带污染或漂移，选择对后续标本影响最小的顺序进行。

–分析范围：应接近或等于最低和最高厂商声明的性能范围。

EP6-A方案和要求

?样品制备：足量混合血清。

–X1：低值混合血清。

–X2：3份X1+1份X5。

–X3：2份X1+2份X5。

–X4：1份X1+3份X5。

–X5：高值混合血清。

–更多水平： X4+X1 、X3+X2 、X2+X3 、X1+X4。

EP6-A方案和要求

?数据处理和分析：

1.初步数据检查

–有无极端明显差异或错误；

–X-Y图上有无离群值；

–每组数据有无漂移或趋势性变化。

2.离群值检查

–单个测定结果明显偏离其他检查结果；

–单个离群值可删除，不用增加数据；

–提示存在非线性或系统误差。

3.确定分析测量范围

–作一元一次（直线）、二次（抛物线）或三次（S形）多项回归分析。

阶别回归方程自由度

一次 Y=b0+b1X 2

二次 Y=b0+b1X+b2X2 3

三次 Y=b0+b1X+b2X2+b3X3 4

–一元一次：直线，是判断某种方法是否为线性的最适

方程。

–一元二次：抛物线，有增加趋势或减少趋势。

–一元三次：S形，呈非线性，b2和b3做t检验证明非线性。

4.非线性程度：计算线性偏差（DL）。

–用户定义线性程度要求或非线性允许误差范围，取决于偏移目标或测量误差。

5.考虑随机误差

–是否因随机变异导致非线性，用方差来估计，即S r。

线性评价：Westgard

混合物记录均值

1 2 3

X1（0％） 6 6 6 6

X2（25％） 138 138 138 138

X3（50％） 278 277 279 278

X4（75％） 410 411 411 411

X5（100％）545 546 543 545

混合物均值(Y) 理论值(X) 偏倚误差％ X1 6 0（X3均值×0） +6 N/A

X2 138 139（X3均值×） -1 ％

X3 278 278（X3均值） 0 0

X4 411 417（X3均值×） -6 ％

X5 545 556（X3均值×） -11 ％

验证：临床可报告范围?实验方法：尚无公认方法。

?实验结果与分析

–计算回收率：回收率=（实测值/预期值）*100%

–按厂商说明书要求判断结果。

举例（最高）

稀释倍数实测值预期值回收率

1:10

1:20

1:100

1:200

可报告范围上限：20*=133778

举例（最低）

稀释倍数实测值预期值回收率

1:10

1:40

1:50

1:100

1:200

可报告范围下限：5=

测量系统的灵敏度定义

? sensitivity of a measuring system

?简称灵敏度 sensitivity

?测量系统的示值变化除以相应被测量的量值变化所得的商。

?注1：测量系统的灵敏度可能与被测量的量值有关。?注2：所考虑的被测量值的变化必须大于测量系统的分辨力。

检出限定义 detection limit，limit of detection

?在给定测量程序获得的测得值，其声称的物质成分不存在的误判概率为β，声称物质成分存在的误判概率为α。

?注1：国际理论和应用化学联合会（IUPAC）推荐α和β的默认值为。

?注2：有时使用缩写词LOD。

?注3：不要用术语“灵敏度”表示“检出限”

定量检测限定义 limit of quantitation，LoQ 在规定可接受精密度和正确度条件下，能定量测出标本中分析物的最小量。

也称为确定低限、检测范围的低限。

空白限定义 limit of blank，LoB

?在规定可能条件下，空白标本被观察到的最大检测结果。

?注：①LoB不是实际检测到的浓度，是在实际浓度处的阳性信号，同样，LoB是在规定可能条件下，含有分析物等于LoD水平样品的预期最低值。②是检测下限、最小可检测浓度。

概率分布曲线

检出限评价-CLSI文件

? EP17-A，Protocols for Determinationof Limits of Detection and Limits ofQuantitation，2004确认：EP17-A方案和要求

?检测限（LoD）确认方案

–对某一检验项目，用空白标本和非常低浓度系列标本进行多次重复检测，得到各自结果。

–空白标本的检测结果：用于确定某个响应量的临界点，高于该临界点的值被认为含有分析物，即为阳性结果。

–该临界点结合低浓度标本的标准差：用于确定可能的超过预期最高空白值的分析物浓度。

EP17-A方案和要求

–空白限（LoB）：

?在规定水平Ⅰ类错误和Ⅱ类错误。

α＝β＝5％

?空白限（LoB）方法：

–空白值呈正态分布，空白限：

LoB＝μB+σB

μB：空白检测均值；σB：空白检测标准差。

–空白值呈非正态分布，空白限：

估计95%位数：P X＝N B(95/100)+，

LoB=Pct B100-α

如：ρ＝95，N B＝60，P X＝，LoB＝（X57+X58）/2

检出限（LoD）方法：

–一种为实际标本等于LoB；

–一种为实际标本浓度检测结果估计5％位点等于LoB。LoD＝μB+σB+σs

μs：低浓度标本检测均值；

σs：低浓度标本检测标准差。

空白限&检出限

?实验标本

–来源：天然标本。

?空白标本：应为去除组分的标本，如抗体沉淀、酶降解、活性炭吸附。

?低浓度标本：配成有分析物标本，最好一组几个不同个体标本。

–数量：最好对5个以上标本。

–测定次数：标本数量越多，重复测定次数越多，估计的LoD越小，结果越可靠。

? LoB测定步骤：

–建议至少60次测定，对1个或数个空白标本进行重复检测（NB）。

? LoD测定步骤

–建议至少60次测定，对多个低浓度标本进行重复检测，浓度范围从LoB到4×LoB之间，至少4～6个标本。举例

LoD=LoB+σs=+*=

? LoQ测定步骤：

–建议测定3～5个浓度标本，每个至少测定8次，共40个结果。

–计算标准差和差值均值，总误差=偏移+2*s。若小于规定目标，则LoQ=LoD。

–LoB≤LoD≤LoQ。

举例

WBC：允许误差范围为±15%。

验证：EP17-A方案和要求

? LoB、LoD测定步骤：

–使用厂商提供的LoB值（1份空白样品重复测定20次）和LoD值，不同天不同样品测定数据不少于20个；如有必要应验证LoB。

? LoQ测定步骤：

–建议测定3～5个浓度标本，每个至少测定5次，至少25个结果。

–每个标本的测定结果与总允许误差目标进行比较，符合要求即可。

定量结果报告图示

?定量结果的报告：

–结果≤LoB：报告为不能检出。

–LoB<结果

–LoD≤结果

–结果≥LoQ：可直接报告结果。

定性检验

?定义：

–是仅给出阳性或阴性实验结果的试验。真正定性是基于唯一医学判定值；某些定性检验源于二分类定量或顺序等级。

?分类：筛查试验（具有高敏感性以确保检出真阳性结果）；诊断试验、确认试验（具有高特异性以确保检出真阴性结果）。

48定性检验评价-CLSI文件

? EP12-A2，Protocols for Evaluation ofQualitative Test Performance，2008

确认：EP12-A2方案和要求?实验熟练阶段：

–人员应熟悉和经培训，能正确掌握标本处理和保存、试剂处理和保存、实验操作、结果解释和质控操作。?测定质控物：

–若使用厂商提供质控物时，应按厂商要求做质控。使用时应注意基质效应。在评价期间尽可能使用相同质控物。

?新定性检验方法的性能评价

1.重复性评价：评估检测方法精密度。

2.方法学比较：2种或多种方法检测同一标本后比较检验结果。

1.重复性评价

内容：

应提供标本浓度接近临界值结果，不宜用远低于或高于临界值浓度标本。

在临界值95%区间外，定性方法给出相同测定结果的能力（阴性或阳性）是评价方法性能的重要指标。

步骤：

1.确定被评价方法的临界值（Cutoff）。方法：

–按检测试剂或系统说明书；

–如未知临界值：将阳性样本进行系列稀释，以确定能获得50％阳性、50％阴性结果的稀释度，此时标本浓度为该法临界值。

2.确定临界值±20%的标本浓度范围是否在该方法临界值95%区间内。

?重复性实验步骤：

–用于评价的临床标本应按要求采取，必要时，应新鲜采取，并尽快完成检验。

–在临界值基础上准备：-20%浓度样品、+20%浓度样品。–对低、高浓度标本分别测定20次，记录阳、阴性结果数。

?当+20%或-20%浓度样品产生阳性或阴性结果数≥95%，说明临界值±20%浓度范围≥临界值95%区间，对被测物浓度在±20%浓度范围外标本，实验方法将给出稳定的结果。

?当阳性、阴性结果数<95%时，应另外准备不同浓度实验标本，重新进行评价。

2.方法学比较

?采用同一组样品，同时用≥2种（实验方法和比较方法）方法测定，并对测定结果进行比较。

?比较方法：

–另一种定性方法。

–金标准方法。

–定量方法。

–临床诊断结果。

“金标准”方法

?是对某疾病诊断最可靠方法。通常为：

–病原学检查；

–细胞学检查；

–活体组织检查；

–尸检；

–特殊影像检查；

–长期随访结果；

–临床专家共同制定公认最新诊断标准。

方法学比较?样品种类和数量

–新鲜临床标本：最好使用常规患者的新鲜标本，样品量应保证实验方法和比较方法测定的需要。

–样品中被测物应稳定。

–尽可能实验方法和比较方法同时完成测定。

–参考样品盘：为一组临床样品组成，常包含不同浓度被测物的临床样品，也可能包含干扰物质。

–测定结果与指定参考方法或临床诊断相联系，对评价定性实验非常有效。

–虽有优点，但不能反映患者实际分布情况和预测效果。

?样品种类和数量

–阴、阳性样品应分别至少需50例。

–在实际操作中，当阳性样品达到50例时，阴性样品可能已超过50例，但为了保证正确评价假阴性问题，必须保证有足够的样品量。

?步骤：

–应在10～20天内完成，保证：①足够样品量；②在常规条件下进行操作。

–全部样品应妥善保存，以备再次检测（如用比较方法再次测定、用另一种对比方法测定、用临床诊断信息解释实验问题）。

在已知样品临床诊断结果的情况

临床诊断合计

阳性阴性

实验方法阳性 A B A+B

阴性 C D C+D

合计 A+C B+D N

?诊断灵敏性=A/(A+C)×100%

–是真实情况为有病时，试验发现疾病的能力?诊断特异性=D/(B+D)×100%

–是真实情况为无病时，试验排除疾病的能力?诊断效率=(A+D)/N×100%

?阳性预测值=A/(A+B)×100%

?阴性预测值=D/(C+D)×100%

?相关样品患病率=(A+C)/N×100%

在未知样品临床诊断的情况

临床诊断合计

阳性阴性

实验阳性 a真阳性 b假阳性 a+b

方法阴性 c假阴性 d真阴性 c+D

合计 a+c b+d n

?阳性符合率=a/(a+c)×100%

?阴性符合率=d/(b+d)×100%

?总符合率=(a+d)/n×100%

灵敏性和特异性可信区间

?公式：

95%下限：100%（Q1-Q2）/Q3

95%上限：100%（Q1+Q2）/Q3

?灵敏度：

?特异度：举例：候选方法和诊断标准比较

幽门螺杆菌诊断标准

候选方

法

阳性阴性合计

阳性57 2 59

阴性4 39 43

合计61 41 102

灵敏度57/61*100 %

特异度39/41*100 %

患病率61/102*100 %

阳性预测值PPV 57/59*100 %

阴性预测值NPV 39/43*100 %

[举例]

比较方法的灵敏度可信区间Q1 2*57+ Q2 *√+4*4*57/61

Q3 2*61+ lower limit %

upper limit +/*100 %

比较方法的特异度可信区间Q1 2*39+ Q2 *√+4*2*39/41

Q3 2*41+ lower limit %

upper limit +/*100 %%

旧方法和诊断标准比较

幽门螺杆菌诊断标准

阳性阴性合计

阳性 54 7 61

旧方法阴性 7 34 41

合计 61 41 102

灵敏度 54/61*100 %

特异度 34/41*100 %

患病率 61/102*100 %

阳性预测值PPV 54/61*100 %

阴性预测值NPV 34/41*100 %

旧方法灵敏度可信区间

Q1 2*54+

Q2 *√+4*7*54/61

Q3 2*61+

lower limit %

upper limit +/*100 %

旧方法特异度可信区间

Q1 2*34+

Q2 *√+4*7*34/41

Q3 2*41+

lower limit %

upper limit +/*100 %

候选方法、旧方法和诊断标准三者间比较-McNemar法

例：幽门螺杆菌三种比较

诊断灵敏度比较

D 或(4-1)/61*100 %

Q1 (53+4)(1+3)(53+1)(4+3) 86184 Q2 (53*3)-(4*1) 155

Q3 Q2-n1/2

Q4 Q3/√Q1

Q5 *

Q6 *

D-√Q5 √

D+√Q6 +√

诊断特异度比较

D %

Q1 (2+0)(5+34)(2+5)(0+34) 18564 Q2 (2*34)-(0*5) 68

Q3 Q2-n1/2

Q4 Q3/√Q1

Q5 *

Q6 *

D-√Q5 √

D+√Q6 +√

生物参考区间

?生物参考区间或临床决定值

?实验室应规定生物参考区间或临床决定值，将此规定的依据文件化，并通知用户。

?当特定的生物参考区间或决定值不再适用服务的人群时，应进行适宜的改变并通知用户。

?如改变检验程序或检验前程序，实验室应评审相关的参考区间和临床决定值（适用时）。

生物参考区间定义 biological reference interval 参考值分布的95％中心区间。

注1：该名词取代不正确的用词，如“正常范围”。

注2：将参考区间定义为95％中心区间是约定俗成的。某些特定情况下，对参考区间另外取值或不对称取值可能更为适当。

参考范围定义

?所有参考抽样组的各个参考值的集合。

?注1：假定参考总体分布范围可通过参考抽样组参考范围和使用适当统计方法进行检验。

?注2：参考抽样组是能代表参考总体的足够数量的个体。

生物参考区间定义参考个体和总体定义

?参考个体：依临床对某检验项目的使用要求确定选择原则，以此选择检测参考值的个体。注：确定该个体的健康状态非常重要。

?参考总体：所有参考个体的总和。注：参考总体中的参考个体数量通常未知，因此它是一个假设的实体。建立参考区间：CLSI文件

? C28-A2，How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory，2000

C28-A2方案和要求

?建立参考区间实验步骤：

1.查阅文献，列出该项目生物变异和分析干扰因素，供选择参考个体时用。

2.建立选择、排除和分组标准，设计一个适当调查表，该调查表能在潜在参考个体中显示这些标准。

3.为参考区间研究的参与者编制知情同意书，参考个体完成调查表。

4.基于调查表和其它健康评价结果对潜在的参考个体分类。

5.依排除标准或其它指示缺乏良好健康状况

的评价，从参考样品组中排除不符合要求候选对象。

6.设定可信限，确定合适参考个体数。

7.采集前告诉受检者要求详细要求，做好采样前的各项准备工作。

8.正确收集和处理标本，方式须与为患者进行的实际常规操作一致。

9.在良好控制条件下，用事先指定方法对处理好样品进行检测，获得参考结果。

10.检查参考数据，绘制直方图，了解数据分布特性。

11.检查有无离群值，若有按事先约定原则，剔除不符合要求数据，再补上必需数据。 12.选择一种评估方法，估计参考区间。

? 参考抽样组最小数量：

–建议至少需要120个参考数据，若需分组，则每组也应有120个数据。 ? 离群值处理：

–用1/3规则判断：将疑似离群值和其相邻点的差值（D ）和数据全距（R ）相除，求D/R 比值。若比值≥1/3，为离群值，应删除。 ? 参考分组：

–两组间均值差异有无统计学意义，作Z 检验。三个或更多组别间均值差异有无统计学意义，推荐使用ANOVA 统计。

240名医学生按性别钙频数分布

年轻男性、女性120例分组钙的均值和标准差

验证：参考区间-Westgard ? 转移参考区间：

①相同分析系统参考区间转移；

②不同分析系统参考区间转移： ? 在同一实验室进行转移；

? 从一个实验室转移到另一个实验室。

转移：参考区间 ? 由方法比对计算： –计算回归方程。 –对比方法： ? X 下限和X 上限。 –实验方法： ? Y 下限=a+bX 下限。 ? Y 上限=a+bX 上限。

验证：参考区间 ? 验证参考区间：

①系统性评审：审查原始参考区间有关因素，主观评价转移的可接受性。

②用20个参考抽样组数据进行验证。

③确定95%的标本检测结果在该方法参考区间内。 ④若不符合，则增加至60个参考抽样组数据进行验证。

验证：参考区间 ? 验证参考区间： –参考抽样组20例。 –要求：≤1个结 果落在参考区间外。