医学微生物学实验指导

医学微生物学实验指导

皖南医学院微生物学和免疫学教研室

2006年5月

微生物学实验的目的与要求

医学微生物学的实验课是本课程学习中的重要环节。

医学微生物学实验课的目的：在于使学生加深和巩固对讲课内容的明白得和体会，并在系统学习理论的基础上，使学生学习并把握微生物学的差不多操作技术，培养独立摸索的能力，为今后的临床实践及科学研究工作打下良好的基础。

为了提高实验课的成效，应做到以下几点：

一、每次实验前作好预习，明确实验目的，内容，操作中注意点及其理论依据，幸免或减少错误发生。

二、在实验过程中，应持严肃认确实科学态度，并要注意合理地分配和利用时刻。

三、在微生物学的整个实验过程中，应严格加强“无菌观念”的培养和训练。

四、实验结果须真实记录，进行分析，得出结论。如实验结果与理论不符，应探讨缘故，训练科学思维的能力。实验完成后，要写出实验报告。

微生物学实验室规则

微生物学实验的对象大多是病原微生物，因此必须严格贯彻“无菌观念”，防止实验中自身感染和环境污染是微生物学实验室的最重要原则。

一、尽量不带个人一辈子活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。

二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。

三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及躯体其他暴露部位。

四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情形，应赶忙报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。

五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后赶忙投入已预备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。

六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。

七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。

实验一自然界与人体的微生物检查

实验目的：

了解微生物在空气、物体表面及正常机体表面的分布，增强消毒及无菌操作的观念。

实验材料：

一般琼脂平板、无菌棉棒、无菌生理盐水、蜡笔、酒精灯。

实验内容：

一、空气中微生物的检查：

取无菌一般琼脂平板一只，打开后暴露在空气中，30分钟后盖好，置37℃温箱孵育24小时，观看各种菌落的特点。

二、皮肤、粘膜及其它物品表面微生物的检查：

取一般琼脂平板一只，用蜡笔在皿底玻璃上划分四区，将标签纸贴于正中，分别注明皮肤、粘膜、硬币或钢笔等字样。然后反转，打开平板：

1、用手指在注明“皮肤”处琼脂上轻轻擦拭。

2、把沾取了无菌生理盐水的湿棉棒在管壁上挤干水，擦拭咽部或鼻腔粘膜，然后轻轻抹在“粘膜”处琼脂上。

3、分别取硬币或钢笔等物在相应区域内抹擦。

盖好平板，置37℃温箱内孵育24小时后，观看菌落的生长情形。

实验报告：

观看与记录结果。

实验二油镜的使用

实验目的：

熟悉显微镜的使用方法。

实验材料：

标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。

实验原理：

使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜专门小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观看不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的

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图1 油镜的原理示意图

实验方法：

1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，阻碍观看造成污染。

2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采纳直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调剂集光器和光圈以获得最适亮度。染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度专门强。

3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。

4、低倍镜找出标本的范畴，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观看并缓慢转动粗调剂器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调剂器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调剂器转动至物象完全清晰为止。

5、观看完毕，取下标本片，赶忙用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一洁净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。

6、显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形，集光器下降，反光镜推平，光圈关上，归还显微镜室。

实验三细菌的差不多形状和专门结构

实验目的：

把握细菌的差不多形状和专门结构。

材料及方法：

一、细菌的差不多形状（示教）

1、球菌：葡萄球菌，革兰氏染色阳性。

2、杆菌：大肠杆菌，革兰氏染色阴性。

3、弧菌：霍乱弧菌，革兰氏染色阴性。

二、细菌的专门结构（示教）

1、荚膜：肺炎球菌，成双排列，菌体四周不着色的透亮圈即是荚膜所在处。经荚膜染色后，菌体与背景出现紫色，荚膜为无色。

2、鞭毛：伤寒杆菌，菌体四周有周鞭毛。经鞭毛染色后，菌体和周鞭毛均呈紫色。

3、芽胞：破伤风杆菌，菌体细长，顶端可见一正圆形芽胞。经芽胞染色后，菌体为蓝色，芽胞为红色。

实验报告：

1、绘图说明各种形状细菌的大小、形状、排列方式，并注明染色性及放大倍数。

2、绘图说明细菌的专门结构，并注明染色性及放大倍数。

实验四基础培养基的制备

培养基是依照微生物生长繁育时对营养物质的需要而配制的营养制品，含有营养物质及适宜的酸碱度，经灭菌后使用。

常用的培养基按用途分为：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基及厌氧培养基。按物理性状分为固体、半固体和液体三种。

实验目的：

了解常用的液体、固体、半固体培养基的成分、制备方法和用途。

实验材料：

牛肉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、0.1mol/lNaOH溶液、酚红指示剂、蒸馏水等。

实验方法：

一、肉汤培养基

1、将鲜牛肉除去筋膜和脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎，以每500g碎牛肉加1000ml蒸馏水的比例混合后，置4℃冰箱过夜。

2、次日取出浸泡物倒入容器内煮沸半小时，使肉渣凝固，也可煮沸一小时不经冰箱过夜。

3、用纱布和脱脂棉过滤，除去肉渣，即成肉浸汁。加入1%蛋白胨及0.5%氯化钠，加热溶解并用蒸馏水补足蒸发失去的水分。

4、待冷至50℃左右时，调该溶液的pH至7.4~7.6。校正pH的方法为：①取三支与标准比色管（pH7.6）相同的空比色管，其中一管内盛放蒸馏水5ml；

另外两管各加入欲测的肉汤培养基5ml，其中一管内加0.02%酚红指示剂0.25ml （滴定管），摇匀。②按图2所示排列，举起比色架，对光观看。若滴定管色调较淡或为黄色，即表示培养基偏酸性，需滴加0.1mol/L NaOH矫正；若呈深红色，即表示偏碱性，应滴加0.1mol/L HCl矫正；使之与标准比色管色泽相同为止。通常未矫正前的肉汤均呈酸性。记下用去的NaOH（或HCl）溶液量，由此运算出矫正全量培养基时所需NaOH（或HCl）溶液量。

图2 pH比色架

5、酸碱度矫正后，加热煮沸10分钟，用滤纸过滤，补足水分，再调一次pH值。

6、分装肉汤于三角烧瓶或试管，瓶口、管口加棉塞并用纸包扎。

7、置高压灭菌器内103.43Kpa20分钟灭菌备用。

可用市售的牛肉膏代替牛肉，用量为0.3%，其余成分相同（如蛋白胨、氯化钠等）加热溶解，调剂pH至7.6左右，煮沸10分钟，补充失水、过滤、分装，灭菌后备用。

二、固体培养基

1、在上述制备的肉汤中加入2-3%的琼脂。琼脂为海藻中提取的一种多糖类物质，本身无营养作用，不能被细菌利用。因其加热到100℃后可溶化，冷却至40℃左右又可凝固，故可作为赋形剂。加热溶化，脱脂棉过滤，补足失水，分装三角烧瓶和试管。

2、置高压灭菌器内103.43Kpa灭菌20分钟，取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，待琼脂凝固即成琼脂斜面培养基（图3）。三角烧瓶内培养基冷至50-60℃时在超净台或无菌室内将其倾注于灭菌平皿内（15-20ml），凝固后即成琼脂平板。

图3 琼脂斜面培养基

另外，实际工作中现多使用合成营养琼脂干燥粉末制剂。其方法为：称取41克营养琼脂干燥粉末加入1000ml冷蒸馏水中混合放置10分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸使其完全溶解，分装于中试管中（约5~7ml）或三角烧瓶，103.43kPa （121℃）灭菌15分钟，即可备用。

三、半固体培养基

1、操作方法同固体培养基，但琼脂加入量较少，仅0.3-0.5%。

2、分装试管，灭菌后使试管直立，冷凝后即成半固体培养基。

实验五细菌的分离与培养

实验目的：

把握在各种培养基上的接种方法并观看生长现象。

实验材料：

菌种、一般琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。

实验内容：

一、平板划线接种法（分离培养法）

原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁育，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上猎取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。

用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。

操作方法（三区划线法）：

1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。

2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。

3、接种环上余外的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。

4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观看琼脂表面菌落分布情形，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特点（如大小、形状、透亮度、色素等）。

图4-1 平板分区划线法图4-2 培养后菌落分布情形

二、液体培养基接种法

用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。能够观看细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。

操作方法：

右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。

1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。

2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。

3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观看生长情形。

三、半固体穿刺接种法

用途：观看细菌动力，储存菌种。

方法：

1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，赶忙垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。

2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱孵育18-24小时，取出后对光观看穿刺线上细菌生长情形：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。

图5 液体（左）及半固体（右）培养基接种法

四、斜面培养基接种法

用途：常用于扩大纯种细菌及实验室储存菌种。

操作方法：

1、以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回作曲折划线。

2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37℃温箱孵育18-24小时，取出观看斜面上菌苔生长情形。

图6 斜面培养基接种法

实验报告：详细记录细菌在各种培养基中生长后的表现。

实验六病原性球菌的检查（一）

实验目的：

1．了解病原性球菌的检查程序。

2．把握细菌涂抹标本制备和革兰氏染色法。

3．把握病原性球菌的形状和分离培养法。

实验材料：

病原性球菌的形状、脓汁标本、革兰氏染色液、一般平板、血平板、玻片、接种环、酒精灯、光学显微镜、香柏油、吸水纸、擦镜纸、标记笔。

实验内容：

一、病原性球菌的检查程序

病原性球菌常引起化脓性疾病，分离用标本多采纳脓、痰液，但也可从分泌物、血液及穿刺液中取材。

1、标本采集

（1）脓液：用无菌棉拭挑取患部深处脓液或分泌物，放入无菌试管内。

（2）痰液：用消毒过的容器收集病人痰液，以无菌棉拭挑取浓稠痰块，放入无菌试管。

（3）咽部分泌物：嘱病人张开口，用压舌板轻压舌根部，以无菌棉拭从鼻咽部位擦拭取材，然后将其放入无菌试管。

（4）血液：高热、败血症患者作血液检样时，最好在发热时，抗菌药物治疗前采取，这时培养阳性率最高。取血3~5毫升，赶忙以无菌手续注入30~50毫升（使血与培养基之比约等于1∶10）的葡萄糖酚红肉汤增菌培养基中。

（5）脑脊液：对疑患流脑的患者作腰椎穿刺取脑脊液（CSF ），脑脊液取出后应盛于无菌容器内，赶忙送检。

（6）尿道、阴道分泌物：对淋病可疑患者，男性可从尿道取材，取材时应进入尿道1~2cm ，如刚排尿，应等待1小时左右。女性则可从宫颈口取分泌物，当插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转1~2分钟拿出，取材应赶忙送检，不可放置冰箱。

2、分离与鉴定

待检标本可直截了当作涂片染色检查鉴定，必要时可作分离培养及生化反应，致病性鉴定。常见致病性球菌的检查程序如下。

直截了当涂片、革兰氏染色、镜检（形状、排列、染色性）

观看菌落性状、溶血性、色素

脓、痰、分泌物 涂片、染色、镜检

穿刺液、脑脊液

血琼脂平板h

C 4824370 挑取可疑菌落— 纯分离— 致病性测定 ↑ 药敏试验血液、尿、胆汁→肉汤增菌培养37℃1~7天

↓

培养液混浊或溶血时，涂片、染色、镜检

二、涂片染色镜检

（一）涂抹标本制备

方法：

1、涂片：取洁净的载玻片一张，用蜡笔标记，接种环灭菌后，以接种环取浓汁标本1-2环，置于玻片的中央，涂成直径约1cm 的平均薄膜涂片。如用固体培养物，须先加生理盐水，再将细菌少许与生理盐水混匀。

2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将涂片膜面向上，小心间断地在弱火高处略烘，以助水分蒸发，但切勿紧靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后难以检测。

3、固定：涂片干燥后，手持玻片一端（涂膜面向上）在酒精灯上快速地来

回通过三次，共约2~3秒钟，注意温度不可太高，以玻片涂膜的反面触及皮肤觉烫而尚能忍耐为度。固定的目的一是杀死细菌；二是使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；三是使菌体蛋白变性易着色（见图14~2）

（二）革兰氏染色法

革半氏染色法（Gramstain）是丹麦细菌学家革兰（Christain Gram）于1884年发明的，至今已逾百年，但仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色法。其差不多过程是标本经固定后，先用结晶紫初染，再用革兰氏碘液媒染，然后用95%酒精脱色，最后用石炭酸复红稀释液复染。此法可将细菌染成两大类：不被酒精脱色仍保留紫色的为革兰氏阳性菌，被酒精脱色后复染成红色的为革兰氏阴性菌。

1、原理：革兰氏染色法的原理尚不完全清晰，要紧有三种学说：

等电学说：革兰氏阳性菌等电点（Ph2~3）比革兰氏阴性菌（Ph4~5）低，一样染色时染液的酸碱度在Ph7.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。

通透性学说：革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。革兰氏阴性细菌细胞壁疏松，肽聚糖层专门薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫-碘复合物容

易被乙醇溶解而脱出。

化学学说：革兰氏阳性菌细胞内含有某种专门化学成分，一样认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它和染料-媒染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色。

2、革兰氏染色液的配制：①结晶紫染液：结晶紫14.0g，溶于95%酒精100ml 中，制成结晶紫酒精饱和液。取出此饱和液20ml与1%草酸铵水溶液80ml混匀。

②碘液：先将碘化钾2.0溶于约2ml蒸馏水中，再加碘片1.0g，略加振摇，待碘片完全溶解后，再加蒸馏水至总量为300ml。

③稀释石炭酸复红染液：取碱性复红10.0g[或碱性复红（新）4.0g]溶于95%酒精100ml中，配成碱性复红酒精饱和液；取此饱和液10ml与5%石炭酸水溶液90ml混匀，配成石炭酸复红原液；取此原液10ml加入蒸馏水90ml中混匀，即成稀释石炭酸复红染液。

3方法：

①初染：在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴室温作用一分钟后，用细流水轻轻冲洗。

②媒染：滴加媒染剂碘液数滴，室温作用一分钟，用细流水冲洗。

③脱色：滴加95%酒精数滴，轻轻摇动玻片几秒钟，使平均脱色，然后斜持玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍淡紫色为止（约需30s），赶忙用细流水将酒精冲掉。

④复染：滴加稀释石炭酸复红液复染约30秒钟后用细流水冲洗。

⑤镜检：标本染色后，凉干，滴香柏油，用油镜观看，革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。

三、平板划线接种法（分离培养法）见细菌分离与培养。

实验报告：记录革兰氏染色结果；记录三区划线结果。

实验七病原性球菌检查（二）

实验目的

1把握病原性球菌培养物性状。

2把握血浆凝固酶试验原理方法。

3把握密集接种法，熟悉药物（如抗生素）抑菌杀菌原理并了解纸片法、试管法的试验方法及应用。

实验材料

1、菌种：金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌6~8小时肉汤培养物。

2、培养基：一般琼脂平板、肉汤培养基。

3、药品：青霉素溶液（50u/ml）、抗生素滤纸片。

4、器具：恒温箱、接种环、酒精灯、试管、无菌棉拭、无菌小镊子、无菌吸管、玻片、血浆。

实验内容

一、病原性球菌的培养物观看

肉眼观看葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌在血琼脂平板上的生长情形及脑膜炎球菌在巧克力（色）琼脂平板上的生长情形，比较菌落的形状特点。

（1）葡萄球菌：在血琼脂平板上培养18~24小时，形成圆表凸起，表面光滑、潮湿、边缘整齐，菌落不透亮。金黄色葡萄球菌金黄色，可产生透亮溶血环；表皮葡萄球菌白色、无溶血环，腐生葡萄球菌白色或柠檬色，无溶血环。

（2）链球菌：在血琼脂平板上培养18~24小时，形成灰白色、圆形凸起、半透亮或不透亮的细小菌落。甲型溶血性链球菌不完全溶血，在菌落周围形成草绿色溶血环，乙型溶血性链球菌完全溶血、形成透亮溶血环，丙型链球菌不发生形成圆形、光滑隆起透亮似露珠的菌落。在血琼脂平板上不发生溶血溶血、无溶血环。

（3）肺炎球菌：血琼脂平板上培养18~24小时，形成细小、灰白色、扁平、半透亮的菌落，周围有草绿色溶血环，其与甲型溶血性链球菌相似，培养2~3天后，因菌体发生自溶，菌落中央下陷呈“脐状”。

（4）脑膜炎球菌：在巧克力（色）琼脂平板上加5%CO237℃培养24小时，形成圆形光滑隆起透亮似露珠的菌落，无溶血环。

二、血浆凝固酶试验

1、原理

致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。

2、方法及结果

（1）玻片法：

①取洁净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，其中一格加2接种环的生理

盐水，另一格加1：2人血浆（或免血浆）1接种环。

②用接种环取上次培养物葡萄球菌之菌落少许在生理盐水内研磨成细菌悬液，然后取此悬液1环与血浆混匀。

③5分钟以内观看结果，若有凝块显现，即为阳性；若无凝块显现，则为阴性。

（2）试管法：

①按表24-1加入1：4血浆及葡萄球菌肉汤培养液。

②将各管置37℃水浴中，每隔30分钟观看一次结果。

③在3小时内，若第一管及第二管显现凝固，而第三管不显现凝固则为阳性。表24-1 血浆凝固酶试验（试管法）

试管血浆（1：4）待检葡萄球菌

肉汤培养物

金黄色葡萄球

菌肉汤培养物

肉汤结果

1 0.5ml 0.5ml ——

2 0.5ml —0.5ml—

3 0.5ml ——0.5ml

三、药物敏锐性试验

[实验原理]

治疗细菌感染的药物如磺胺类、异烟肼、抗生素等杀菌具有抑菌和杀菌作用，其作用机制要紧是干扰细菌的代谢，阻碍和阻碍细菌细胞壁的合成、膜的通透性及核酸和蛋白质的生物合成，不同的细菌种类或菌株，对同一药物的敏锐性不同，因此测定病原菌对抗菌类药物的敏锐性，关于合理用药和提高临床疗效具有重要意义。本实验通过两种方法测定细菌对抗生素的敏锐程序。

[内容与方法]

一、纸片法

1、密集接种法接种细菌：用无菌接种环挑取已培养好的金黄色葡萄球菌培养物少许，先在平板琼脂表面中央划一条线，垂直该线作平行密集划线，划满平板。再将平板转动90度，作平行密集划线，划满平板。

2、用无菌注射针头挑取抗生素（青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素等）滤纸片，贴在平板琼脂表面。滤纸片之间距离应差不多相等，一样每个平板贴四到五个滤纸片为宜。注意每次取滤纸片之前，针头须烧灼灭菌冷却。

3、将平板置37℃温箱培养24小时后取出观看滤纸片周围的抑菌圈（见图20~1），用尺子测量其直径并对比细菌对抗生素敏锐度判定表做出结果判定。

二、试管法

1、金黄色葡萄球菌菌液制备

取金黄色葡萄球菌6~8小时肉汤培养物0.1ml加于2ml肉汤培养基中，置37℃温箱培养6~8小时后备用。

2、方法

（1）取10支无菌小试管标号后，除第一管外其它每管加入肉汤培养基1ml。

（2）在第一、二管中各加入青霉素（50u/ml）溶液1ml，混匀。

（3）从第二管中吸取1ml加入第三管中，混匀，然后依此法加样稀释至第

九管，再从第九管中抽取1ml弃去。第十管不加青霉素作为对比管。

（4）于每管中加入金黄色葡萄球菌菌液各0.1ml，混匀。

（5）置37℃温箱培养24小时后观看结果，以培养基混浊程度来判定细菌对青霉素的敏锐程度，最高稀释度的抗菌药物仍能抑制细菌生长者为最低抑菌浓度（MIC）可用单位/ml表示之。

常用药敏试验纸片判定标准与其相应的MIC近似值

抗菌药物纸片抑菌圈直径（毫米）最低抑菌浓度（微克/毫升）含药量耐药中度敏锐敏锐耐药敏锐

青霉素葡萄球菌10单位≤20 21-28 ≥29 ≥0.2 ≤ 0.1 其它细菌10单位≤1112-21 ≥22≥32≤ 1.5

链霉素10 微克≤1112-14 ≥15≥15 ≤ 6

氯霉素30微克≤1213-17 ≥18≥25≤12.5

红霉素15 微克≤13 14-17 ≥18 ≥8 ≤ 2

庆大霉素10微克≤12 13-14 ≥15 ≥8 ≤ 4

卡那霉素30微克≤13 14-17 ≥18 ≥25 ≤ 6

四环素30微克≤14 15-18 ≥19 ≥12 ≤ 4

多粘菌素300单位≤8 9-11 ≥12 ≥50单位

磺胺300 微克≤12 13-16 ≥17 ≥350 ≤100

甲氧苯青霉素 5 微克≤9 10-13 ≥14 - ≤3

萘啶酸30 微克≤13 14-18 ≥19 ≥32 ≤12

实验报告：记录血浆凝固酶试验结果；记录药敏实验结果。

结合系列实验结果，对病原性球菌鉴定作出结论。

实验八肠道杆菌的鉴定（一）

肠道杆菌是一群寄居于人或动物的肠道内的细菌，多数为非致病菌或条件致病菌，少数为致病菌。其生物学性状相似，但生化反应、抗原构造有差异，据此可将它们分类、鉴定。

实验目的：

1．熟悉肠道杆菌未知标本分离和鉴定方法；

2．把握肥达式反应的原理及结果分析，熟悉其操作过程；

3．了解大肠杆菌、痢疾杆菌及伤寒杆菌革兰氏染色形状示教片

4．了解肠道杆菌常见的一些生化反应及其在鉴定上意义、

实验材料：

1. 大肠杆菌或痢疾杆菌或伤寒杆菌革兰氏染色形状示教片

2.大肠杆菌、痢疾杆菌（或伤寒杆菌）在SS培养基上的培养物（示教）；

3.大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒甲或乙等在双糖铁培养基上的培养物（示教）；

4.大肠杆菌与痢疾杆菌（或伤寒杆菌）的混合菌液（模拟粪便标本）；

5.痢疾杆菌及伤寒杆菌诊断血清，生理盐水，玻片；

6.诊断用肥达式菌液、肥达式平板、小试管、吸管、无菌滴管、伤寒患者血清（经56℃30分钟灭活）、水浴箱等；

7. 单糖发酵管、蛋白胨水培养基、醋酸铅培养基、葡萄球菌和绿脓杆菌在一般琼脂平板上的培养物。

实验内容：

1．肥达氏反应

①原理：人体感染伤寒杆菌或副伤寒杆菌后，能产生与这些细菌起特异性反应的抗体，这种抗体及其量能够用已知的抗原先测得。本实验用已知的伤寒杆菌H、0抗原和甲型、乙型副伤寒杆菌的H抗原与可疑病人血清做定量凝集试验，可测定患者血清中相应抗体的含量及其增减情形，以协助伤寒或副伤寒病的诊断。

②方法：

ⅰ）取一有20（5*4）孔的有机反应板2块，连续标号，每行分别标号1~10。

ⅱ）取中试管1支，加入3.9ml生理盐水，再换一支吸管，吸取患者血清0.1ml （经56℃30分钟灭活）放入中试管内，吸打混匀；（现在血清稀释度为1：40）。

ⅲ）吸取1：40的血清2ml，在每列的第一孔中各加入0.5ml。

ⅳ）在中试管余下2ml血清中，再加入2ml生理盐水，混匀（血清稀释度为1：80）。然后吸取此1：80的血清2ml，在每列第2管中各加入0.5ml。

ⅴ）按上述倍比稀释，并依次加入各管，直至每行第9管（见表7-1）。

H

O

PA

PB

1∶40 1∶80 1∶160 1∶320 1∶640 1∶1280 1∶2560 1∶5120 1∶10240 （-）

表7-1 肥达氏反应的加样示意图

ⅵ）另取吸管1支，吸取生理盐水向每行第10管中各加入0.5ml（对比管）ⅶ）按10、9、8…1列的顺序，分别对第1行各孔加入0抗原1滴；第2行各孔加入H抗原1滴；同样对第3行各孔加甲型副伤寒（PA）H抗原1滴；第4行各孔加乙型副伤寒（PB）H抗原1滴。由于抗原（菌液）的加入量少，可忽略不计。

ⅷ）将各孔混匀，置37℃水浴箱中2小时，取出置室温过夜，次日观看，判定并分析结果。

③结果观看（见图7-1）：

依照凝集反应的强弱，分别以“++++、+++、++、+”记录：

++++：液体清亮透亮，菌体全部被凝成块，沉于管底。

+++：液体较透亮，大部分菌体被凝集而沉于管底。

++：液体稍透亮，管底有少量凝集沉淀物。

+：液体较混浊，可见极少量凝集物。

-：液体混浊，细菌因重力下降于管底呈边缘光滑圆点（与对比管相似）。

管底现象

记录方式

图7-1 肥达氏反应的结果判定

血清效价（或滴度）：能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集）的血清最高稀释倍数，称为血清的效价。血清的效价代表着血清中抗体的含量，其效价愈高，所含抗体的量愈多。如血清最低稀释倍数（1∶40）仍无凝集，则视为阴性或效价低于1∶40；如血清的最高稀释倍数（1∶1280）仍完全凝集，则示血清效价高于1∶1280。

④结果分析：

ⅰ）第一应考虑当地正常人效价（正常效价）。一样以单份血清凝集效价：0效价应达1：80以上、H效价应在1：160以上，PA和PB应达1：40以上方有诊断价值；若病程中第2次血清效价比第1次高4倍以上亦有诊断价值。

ⅱ）由于H凝集素在血内保持时刻较久，0凝集素较短暂，因此曾接种过伤寒、副伤寒菌苗者，0凝集效价在诊断上较重要。

ⅲ）真正的伤寒病人，0凝集素常较H凝集素显现早、但坚持时刻较短；H 凝集素显现较晚、但效价较高且连续时刻较长。

ⅳ）回忆反应：过去曾接种过伤寒、副伤寒菌苗或患过伤寒、副伤寒病，近期又发生感染如流感、肝炎、结核病等，可非特异地产生较高的H凝集素和较低的0凝集素，此现象称为回忆反应。

ⅴ）若0效价高而H不高（对正常效价而言），则可能是感染早期或与伤寒杆菌0抗原有交叉反应的其他沙门菌感染。

ⅵ）确诊为伤寒的患者中，约有10%的患者该试验始终阴性或效价不高，故阴性结果不能排除伤寒的诊断。

ⅶ）采血时刻不同，肥达式反应的阳性率也不同。发病第1周约为50%；第2周80%；第4周90%以上。复原期效价最高，以后逐步下降，直至转阴。一样以双份血清（急性期和复原期）对比，效价有明显上升者作为新近感染的指征。

1.观看大肠杆菌（或痢疾杆菌/伤寒杆菌）革兰氏染色形状示教片

2.肠道致病菌的分离鉴定（一）

（1）介绍肠道致病菌的分离鉴定程序（图7-2）

（2）分离培养与鉴定具体方法

①取材：挑取黏液脓血样粪便置清洁容器内赶忙送检。若不能及时送检，应用甘油缓冲盐水储存。若无法猎取粪便时，用肛拭子检查（用无菌棉拭子经生理盐水潮湿后，插入肛门4~5cm处轻轻沿肛壁擦拭一圈后取出，放入含少量甘油缓冲盐水的无菌试管中送检。

②粪便标本或肛拭子可直截了当在SS琼脂平板上划线分离培养（常用三区划线法，详见实验五细菌的分离与培养）。

对血、骨髓、尿等标本可先做增菌培养，然后取增菌培养物在上述平板上划线分离，经37℃培养18~24小时。

2．SS平板分离培养（方法同前）

三区划线时注意：无菌操作; 划线角度准确，轻而快; 分区合理；接种环适时处理；培养基正确放置，作好标记.。

图7-2 肠道致病菌的分离鉴定程序

附. 有关培养基及试剂的配制：

（1）肉汤培养基：新奇肉浸液1000ml 、蛋白胨10mg 、氯化钠5g ，上述各成分混合后调PH7.2~7.4，分装于100ml 疫瓶中，每瓶50ml ，高压灭菌后备用。该培养基适合于各类细菌的增菌培养。

（2）SS 琼脂平板：牛肉膏5g 、蛋白胨5g 、乳糖10g 、胆盐8.5g 、枸橼酸钠8.5g 、硫代硫酸钠8.5g 、琼脂20g 、枸橼酸铁1g 、0.1%煌绿溶液0.33ml 、1%中性红溶液2.5ml 、蒸馏水1000ml 。除了煌绿、中性红以外，将其它各成分混合于蒸馏水中，加热溶化，调PH 至7.0，再加入煌绿和中性红，分装于三角烧瓶中，以68.95kPa 高压灭菌10分钟，待冷至50℃左右，倾注于无菌平板中，冷后备用。适合于粪便标本中肠道致病菌的分离。

实验报告：

1. 观看示教片并绘图。

2．记录肠道杆菌的分离鉴定程序。

3. 记录肥达氏反应的结果，并判定效价和作出分析。

实验九 肠道杆菌的鉴定（二）

实验内容：

1. 观看上次实验结果

在SS平板上的2~3区可看见散在的沿划线分布的大小不同、两种颜色的菌落。一种是较大的红色菌落，另一种是较小的半透亮的淡黄色或无色的菌落。较大的红色菌落是肠道致病菌，较小的半透亮的淡黄色或无色菌落是肠道致病菌。详见表8-1。

表8-1 大肠杆菌、痢疾杆菌和伤寒杆菌的生物学特点

注：㊣产酸产气，“+”产酸或阳性，“—”阴性

2．双糖铁培养基的接种

从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，可先做革兰氏染色镜检，然后再接种于双糖铁培养基中（为观看比较，同组四人应取大小或颜色不同的两个菌落分别接种于两支双糖铁，并作好标记）。

方法：（即实验五介绍的半固体接种法和斜面接种法的结合）

①用接种针以无菌操作技术挑取标本，赶忙垂直插入培养基中心至接近管底

处，再循原路退出到斜面上；

②接种针自斜面最低处向上划一直线（要求通过试管培养基的中心点），然

后再从斜面低处向上轻轻来回作曲折划线；

③接种完毕，盖好试管塞。贴上标签纸。

37℃培养18~24小时，取出观看结果并分析（参照表8-1）

附：双糖铁培养基：蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，葡萄糖1g，氯化钠5g，柠檬酸铁铵0.5g，硫代硫酸钠0.5g，琼脂12~15g，4g/L酚红水溶液6ml，蒸馏水1000ml。除糖类和酚红外，其他各成分均加热溶解，矫正