浅谈DNA芯片的基本原理及技术

浅谈DNA芯片的基本原理及技术

摘要本文主要从基本原理、分类，其技术原理，主要应用，发展前景和存在问题5个方面对DNA芯片的相关知识进行介绍，以了解DNA芯片的基本知识。

关键词DNA芯片基本原理技术发展前景

从人类基因组计划启动至今, 已完成了人类基因组全序列的测定, 并且已基本构建了人类基因组序列框架图。目前人们正在由研究基因的结构及染色体定位的结构基因组学, 向研究基因表达调控及其在生物体中作用的功能基因组学转变。长期以来, 人们只能有限地研究一个基因或mRNA, 对于较大基因组和巨大的基因组序列数据库则需要新的有效的手段来处理, 常用的凝胶电泳无法达到这个要求, DNA芯片就这样应运而生。DNA芯片技术是多种学科、多种技术融合而成的, 在基因组研究、基因序列分析、发现新基因、基因表达研究、基因诊断等领域有较大的应用价值。

1 DNA芯片的基本原理

1991年底, 美国加州旧金山Affymatrix公司结合照相平板印刷、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、寡核苷酸DNA合成、荧光标记探针杂交及其它分子生物学技术创造了世界上第一块DNA 芯片。

DNA芯片利用核酸杂交原理来检测未知分子, 将寡核苷酸或寡核苷酸片段按照一定的顺序排列在固相支持物上组成密集的分子阵列, 再用标记的目的材料DNA 或cDNA 进行杂交, 通过检测标记信号的分布谱型得到分子杂交情况, 并经计算机分析处理, 得到大量的序列或表达信息。DNA芯片所用的固相支持物有硅片、尼龙膜、载玻片等, 通常把以硅片为支持物的方法称为芯片。以其他材料为支持物的方法称微阵列。

2 DNA芯片的分类

DNA芯片产生的基础是分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合。根据DNA芯片制作过程中主要技术

的区别，可以将DNA芯片分为以下四类：

2.1 光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微矩阵

Affymetrix公司采用了照相平版印刷技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片，生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的DNA芯片可以达到1×106/cm2的微探针排列密度，能够在一片1厘米多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。

原位合成法主要为光引导聚合技术，它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平版印刷技术与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽列阵提供了一条快捷的途径。

2.2 微电子芯片

Nanogen开发了多位点电控阵列并含独立可寻址检测区域的微电子DNA芯片，其基础全部为硅、锗与基础的半导体材料，在其上构建25~400个微铂电极位点，各位点可有计算机独立或组合控制。无论在芯片制造或成品芯片检测，均可通过相似微电极的电场变化来使核酸结合，引入“电子严谨度”参数使芯片检测通过靶、探针序列特征和使用者要求来控制杂交过程中的严格性。这种微电子芯片具有以下优点：

（1）电场运转过程中能够选择性的转运带电荷的DNA分子，通过每个微电极位点的电场正负、强弱变化，能准确有效地随意调控芯片表面的核酸，既可将核酸结合在微电极位点上，也可以使核酸转运起来。

（2）通过电场变化能加快DNA杂交速率，通过导入正电场后，可以大大加快待测核酸同已知探针的结合速率，减少了核酸反应时间，同普通的“被动”杂交反应的几小时相比，这种主动杂交反应仅仅几秒钟就可完成。另外电场变化又可以有效地去除未结合的游离分子，减少未结合荧光信号的干扰。

（3）通过电子严谨度可有效地控制杂交过程中的错配度，杂交错配的程度，对不同的要求上要给以不同的电场就可以符合不同的电子严谨度，这对核酸杂交严格度可以非常灵活的控制，可以非常准确的进行SNP检测。

2.3 微量点样技术

目前大部分生产DNA芯片的公司都采用这种方法，采用了先进更加微量的点样技术，可以点更加微量的探针。这种方法生产的芯片上探针不受探针分子大小种类的限制，能够灵活机动的根据使用者的要求制作出符合目的的芯片。

对于微量点样技术生产的DNA芯片来说从一起组成上可以分为点样仪器、杂交装置、检测仪器和分析仪器。点样器一般采用空心或实心点样针，点样方式有非接触喷点和接触点样两种方式。目前有两种非接触喷点技术用于DNA点样，一种是用压电晶体将液体从孔子喷出的压电技术，喷点大小一般为50-500pL，另一种为注射器螺丝管技术，这种技术是通过高分辨率注射器泵和微螺丝管阀门有机结合起来精确控制滴液的。

检测仪器也是一个重要的限制条件，如果检测仪器的分辨率不高，那么即使点样仪器制造出密度很高的芯片也没有用，对高密度的芯片通常使用激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD，二者各有利弊，须根据要求综合测量。

显色和分析测定方法主要为荧光法，激光共聚焦显微扫描技术和高性能的冷却CCD，以便于对高密度的探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5—35倍，所以对荧光信号强度进行精确测定是实现检测特异性的基础。

分析仪器从硬件上来说只是一部高性能的计算机，但其中最重要的分析软件。如果只是进行简单的检测和科学实验，待测样品所要分析的基因很少很简单，采用直观的观察就可以得出结论。但对于大量的基因分析或是临床检验人员就需要有全面智能化的分析软件辅助。

2.4 其他技术

主要是美国的Orchidbio公司，NIH公司，Caliper公司等。Orchidbio研制了一种毛细管微流泵芯片在边长2英寸的芯片上集成了144个微室，分别由流入孔、反应室、循环管和废液流出孔组成，这种芯片可以用于基因诊断分析以及合成化学。

3. DNA芯片的技术原理

3.1 DNA 芯片的制备

(1) 支持物的处理DNA 合成芯片常采用硅片和普通玻璃片等刚性支持

物。在合成寡核苷酸前, 必须先使支持物表面衍生出羟基或氨基等活性基团, 使之与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来。显微打印的DNA 微集阵列常选用聚丙烯膜和尼龙膜等薄膜型支持物, 该支持物上通常要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等,使其带上正电荷以吸附带负电的DNA 探针。

（2) 探针的制备制备探针常用的方法主要有以下几种。

①显微光蚀刻技术显微光蚀刻技术是寡核苷酸原位合成中的一种, 由美国Affymetrix公司开发, 它所采用的技术原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成时,选择合适的光栏( light mask) 保护不需聚合的部位, 然后利用紫外光或可见光等照射使羟基端脱保护, 使活性基团游离出来, 再将一个5'端保护的核苷酸单体( 如dAMP) 连接上去, 更换光栏, 在支持物其余部位分别加上dGMP、dCMP、dTMP,完成第一循环, 这个过程反复进行直至合成完毕。该方法的优点是合成速度快, 能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列, 在合成循环中探针数目呈指数增长。例如, 一个完整的八核苷酸只需4*8= 32 步, 8 h内可合成48( 65 536) 个探针。该方法的缺点是合成反应率不高, 不到0.195; 探针长度一般只有2~ 8 mer; 杂交信号比较模糊, 信噪比降低。

②原位喷印合成法芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似, 不过芯片喷印头和墨盒有多个,墨盒中装的是4 种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动, 并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片特定位置, 然后冲洗、去保护, 进行寡核苷酸合成的下一循环。合成的探针可达40~

50 mer, 每步产率可达0. 99。

③点样法点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/ 喷印针的打印/ 喷印头; 一个减震底座, 上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片; 温度和湿度控制装置、针洗涤装置。

④电定位法美国Nanogen 公司和法国CIS Biointernat ional 实验室采用此法。这种芯片为带有阳电荷的硅芯片, 芯片经过氧化, 制成1 mm*1 mm 的阵列, 每个阵列含多个微电极, 在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池, 将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上, 在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。

3. 2 DNA 芯片的操作

DNA 芯片操作的基本过程为将分离纯化的生物样品DNA 或mRNA 先进行扩增、标记, 然后与芯片上探针阵列杂交, 通过对杂交信号的检测与分析, 即可获得待测样品的遗传信息。

( 1) 样品的制备包括扩增和标记两个步骤。

①样品的扩增目前, 由于DNA 芯片灵敏度所限, 待测的生物样品( DNA 或mRNA) 在标记和分析前要进行适当程度的扩增, 而且要求对样品中靶序列进行高效而特异的扩增。许多公司正设法解决这一问题[ 8] , 如Mosaic Technologies 公司引入固相PCR 方法, 引物特异性强, 无交叉污染并省去了液相处理的繁锁; Lynx Therapeut ics公司引入的大规模并行固相克隆法, 可在一个样品中同时对数以万计的DNA 片断进行克隆, 且无需单独处理和分离每个克隆。

②样品的标记样品的标记除可用生物素、放射性同位素等标记外, 目前采用最普遍的是荧光标记法, 而且荧光素种类繁多, 可以满足不同来源样品的平行分析。常用荧光色素Cy- 3、Cy- 4或生物素标记dNT P, 后者可用链霉亲和素偶联的荧光素或藻红蛋白等引导进一步检测。

( 2) 样品杂交样品经扩增、标记等处理后,放入DNA芯片自动孵育装置( fluidics stat ion) 中,由其自动控制反应的时间、温度及缓冲液的配比等反应条件, 然后进行杂交, 这一过程仅需数秒钟。杂交条件的选择与研究目的有关。如果芯片仅用于检测基因表达, 只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡核苷酸即可, 杂交时间长, 严谨性较低, 样品浓度高, 温度低; 如果用于突变监测,要鉴别出单碱基错配, 需要更高的杂交严谨性和更短的时间, 样品浓度低, 温度高。DNA 芯片将大量探针集成在芯片上, 一次可对大量的样品信息进行检测分析, 且时间短。如美国Nanogen 公司采用控制电场的方式, 使样品杂交的时间缩至1 min 以内。

( 3) 检测分析样品杂交完成后, 漂洗除去未杂交分子, 然后进行/ 读片0, 即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜对DNA 芯片表面的每个位点进行检测。由于样品与探针严格配对的正常Watson- Crick 配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性, 所产生的荧光强度最强, 而错配碱基双链分子的热

力学稳定性低, 荧光信号不及前者的1/ 35~ 1/ 5, 不能杂交则检测不到荧光信号。并且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系, 通过计算机对信号强度的定量分析和处理, 并与探针阵列的位点进行比较, 就可得到待测样品的遗传信息。

荧光检测法的重复性较好, 比较常用, 另外还有一种检测方式为光纤DNA 生物传感器微阵列。这种方法分析快, 可能取代荧光法。

4. DNA芯片的主要应用

4.1 应用于基因测序和突变检测

DNA芯片用于测序是基于杂交测序法（SBH）发展而来的，Dubiley等人在此基础上发展处邻堆杂交测序（CSH），他们把合成好的10 mer寡核苷酸固定在一个0.1mm*0.1mm*0.2mm（或1mm*1mm*0.2mm）表面覆盖有聚丙烯酰胺凝胶的微片上，微片由疏水玻璃分割成200pL或20nL的微室，通过该芯片抽提单链DNA，之后与5mer的5条引物杂交，通过多步的杂交与洗脱程序后，通过计算机分析芯片上的杂交模式便可获得目的DNA的序列。该技术增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，从而增加了测序的准确性，可对较长的DNA片段进行测序，另外也适用于对不同基因组同源区序列的比较以及含有内部重复序列DNA片段的序列分析。

4.2 应用于基因表达及调控的研究

生物体（组织）在不同的时间条件下有不同功能基因表达，通过从该样品中提取mRNA与含有代表该生物体（组织）中有功能基因的芯片进行杂交，就可获得该样品中功能基因的表达情况。

4.3 DNA芯片技术在临床上的应用

主要是在致病微生物的快速诊断以及癌症的诊断治疗方面的应用。Anthony 等人建立了一个4h以内便可检测和识别出致病微生物的方法。同时由于利用DNA芯片对某一细胞的基因表达情况进行一个全面的了解，所以DNA芯片技术还可进一步应用于癌症的精确诊断和治疗，可利用它对治疗方案进行评估和新药药效评价，此外还能对癌症的发生、发展和转归进行预测。

此外，DNA芯片技术目前已经广泛应用于新基因的识别，药物安全性评价，

细胞凋亡，等位基因的多态性分析等诸多研究方面。

5 DNA芯片的发展前景及存在问题

5.1DNA芯片的发展现状

美国是生物芯片技术研究最为领先的国家,Affymet rix 公司是DNA芯片技术的开拓者, 其产品有诊断用的DNA芯片, 如HIV、PRT、p53 和细胞色素p450 等, 以及基因组研究用的DNA 芯片, 如人类、酵母和小鼠的基因表达分析用的DNA芯片等。第一代DNA芯片已进入应用化、产业化阶段, 第二代DNA 芯片将从根本上解决生物信息检测的自动化、集成化、微量化, 它代表DNA芯片的发展方向。

我国在这一领域刚刚起步, 生物领域专家组于1999 年5 月中旬分别在南京和上海召开/ 生物芯片技术研讨会, 已将生物芯片技术作为重点课题予以启动。我国的第一块生物芯片cDNA 于1999 年6 月由中国科学院上海细胞生物学研究所开发成功。在第一代芯片研制开发方面, 已取得一系列科研成果, 如陕西超群公司的SP )GC200 型芯片, 可用于乙肝及新生儿疾病的检测; 在第二代生物芯片的研制上, 清华大学生物芯片中心已成功研制出电磁式生物芯片, 与发达国家基本保持了同步。

5.2 DNA 芯片技术存在的问题及前景

近年来, DNA芯片技术进展十分迅速, 但仍然面临一些亟待解决的关键问题, 如降低DNA芯片技术昂贵的成本, 提高DNA芯片的特异性,增加信号检测的灵敏度, 进一步提高DNA芯片检测和分析的重复性, 基因扩增、核酸标记及检测仪器的研制和开发等, 这些问题都是国内外DNA芯片技术研究的焦点, 也是DNA芯片向商业化发展的关键问题。

尽管目前还面临一些困难, 但DNA芯片的应用是多方面的, 不仅可用于基因诊断和药物开发方面的研究, 还应用于DNA测序、基因筛选及几乎所有的应用核酸杂交的领域, 而且在农业、工业及环境监测方面具有极大的潜力。随着科学的发展, 当前面临的问题将不断得到解决, DNA 芯片技术将为生命科学的21 世纪的到来敲响钟声,甚至带来一次生命科学研究领域的革命。

参考文献：

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