支原体检测-贴壁细胞培养法
支原体检测
(DNA荧光染色法-贴壁细胞爬片法)
实验原理：利用荧光试剂二苯甲酰胺(Hoechst33258),结合到细胞和支原体DNA,A-T富含区域的特点，在紫外激发束（波长为330～380nm）激发下产生黄绿色荧光的原理，利用荧光显微镜检测细胞中是否存在支原体污染。
实验基本材料准备：
（1）实验仪器：荧光显微镜（莱卡激发波长330～380nm紫外光UV-2A滤光片）；
（2）实验耗材：盖玻片（12×12mm）；载玻片（76×26mm）；甲醇；冰乙酸；荧光染料Hoechst33258；封片液；吸管；六孔板；细胞培养液（MEM完全培养基和五抗生素MEM培养基）；1xPBS；细胞消化液（0.25%胰蛋白酶液）
（3）待检细胞：将待检细胞传1～2代，每次培养3～5d，作为待检样品
（4）盖玻片准备：盖玻片处理同载玻片，擦净后干燥用无菌去离子水2～8℃保存待用。（5）载玻片准备：玻片置于自来水中加洗涤剂煮20min，然后用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗3次，放入去离子水中2～8℃待用
实验试剂试液配制：
(1)固定液配制:甲醇:冰乙酸（3:1）混匀，现配现用；
(2)二苯甲酰胺荧光染料
(3)封片液；
(4)1×PBS
细胞样品制备及实验步骤
（1）待检细胞处理：
①将长成致密单层的细胞用0.25%的胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，800～
1000r/min离心5min，弃上清胰蛋白酶混合液，所沉淀的细胞用1×PBS洗1
次，离心条件相同；用细胞生长液按实验要求稀释至 1×105/ml，加入3ml/
孔至6孔板中（6孔板中事先加入盖玻片），在5%CO2，37℃孵箱中培养3～5
天；
（2）固定：用枪头吸出六孔板中的培养液，用1×PBS清洗六孔板5ml，吸出，加入新配制的固定液5ml，放置5min，吸出；再加新固定液到六孔板中放置10min，用枪头吸出；
（3）清洗细胞：加入5ml蒸馏水至六孔板，3min，清洗三次；
（4）染色：每孔加入33258荧光染料工作液2ml，室温避光放置30min。用吸管吸弃荧光染料工作液，将细胞面用5ml蒸馏水洗3次，在空气中干燥。
（5）封片：取一个干净的载玻片，滴加封片液一滴，从培养孔中取出盖玻片，将细胞面向下盖在载玻片上面（注意不能产生气泡），制成封片。
（6）结果观察：打开汞灯10min后，用UV激发光（300～380）的滤光镜，用荧光显微镜在400倍镜下观察细胞。
阴性结果：细胞清晰，仅见细胞核呈黄绿色荧光。
阳性结果：除胞核呈黄绿色荧光外，在细胞膜上呈现大小不等、不规则黄绿色荧光小点，可根据出现阳性荧光的细胞数多少，判定污染程度。
实验关键点：
①固定液：甲酸：冰乙酸=3：1现用现配
②载玻片和盖玻片：洗涤干净
③细胞处理：消化细胞要均匀，培养细胞每天观察，控制细胞数量，均匀生长在盖玻片上
④清洗细胞：贴壁缓缓加入洗液，避免吹掉固定好的细胞
⑤染色：避光染色
⑥封片：气泡要排空
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台， 酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个， 常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试 剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养
解脲支原体检查方法
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 解脲支原体检查方法 导语：解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会 解脲支原体很有可能会出现感染的现象，而这个是男性体内的一种激素，如果通过检查发现这个解脲支原体有什么异常现象的话，在报告结果中是会表现出来的，而解脲支原体的检查方法有是有很多的，一般在做这个检查的时候都是很多男性出现了尿多尿急尿频繁的现象，所以才到医院做检查，那么解脲支原体检查方法有哪些？ 解脲支原体的检查方法主要有三种，第一种检查方法就是血液检查，主要是通过抽血化验。第二种检查方法就是通过口腔的涂片的培养来进行检查。第三种检查方式就是PCR的技术检测，这种检查方式可以检查出igm的抗体情况，然后再判断感染的情况。这种疾病的治疗可以使用四环素，比如米诺环素、多西环素等等，但是建议最好两种到三种的抗生素结合一起使用，治疗效果更好。 支原体是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细胞，也不同于病毒，种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支脲解支原体属含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。 男性支原体检查方法有哪些？男性支原体检查方法如下： 1、血常规：周围血白细胞计数一般正常嗜酸性粒细胞增多。 2、血清学检全：采用补体结合试验着恢复期血清抗体效价比急性预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
OPTIMEM进行贴壁细胞培养的实验方法
O P T I-M E M进行贴壁细胞培养的实验方法 日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击：194次 ?MEM细胞培养基 无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。 贴壁细胞的脂质体转染 一、实验材料 1、宿主细胞CHO(贴壁细胞) 2、脂质体LIPOFECTAMINE2000(invitrogen公司) 3、6孔细胞培养版 4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO) 5、转染级质粒 二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧! 1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。 2、溶液1：240ul无血清培养基+10ullipofectamine2000perwell(总体积250ul)(温育5min)
3、溶液2：Xul无血清培养基+4ug质粒perwell(总体积250ul) 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。 8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。 三、个人经验： 我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。 1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。 2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。 3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS 洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高)。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程 一、Vero细胞复苏流程 1、准备 工作地点检查： 检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。 设施检查： 确认空调、传递窗工作状态完好。 层流罩准备： 开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。 操作工具和试剂检查： 检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、%NaHCO3溶液。 复苏用水准备： （1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1℃含%新洁尔灭溶液。 （2）百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备±1℃含%新洁尔灭溶液。 操作人员进入层流罩：
穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。 溶液使用前处理： 辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。 2、配液 配方 辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。 辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：～ ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
两种梅毒检测方法对比
第２０卷第１２期航空航天医药２００９年１２月２９ 两种梅毒检测方法对比 于晓明，胡雪峰，迟丽娜 （中航工业哈尔滨二四二医院，黑龙江哈尔滨１５００６６） 摘要目的：比较甲苯胺红不加热血清试验（ＴＲＵＳＴ）、螺旋体明胶颗粒凝集试验（１１ＰＰＡ）两种梅毒血清学试验的检测结果。方法：将２００８～２００９年性病门诊１３８例确诊梅毒患者血清同时用甲苯胺红不加热血清试验 ７ｍｕｓＴ试验、螺旋体明胶颗粒凝集试验７ｒＰＰＡ试验检测，比较两种梅毒检测实验方法的灵敏度和特异性。结果：１３８份血清中，９８份血清ＴＲＵＳＴ阳性，１７份经抗梅毒治疗血清ＴＲｕｓＴ阴性，ＴＰＰＡ试验１３２份血清为阳性。结论：ＴＲＵｓＴ试验可作为梅毒的人群筛查、疗效、复发或再感染的检测指标，嗍试验是检测梅毒螺旋体抗体的特异性方法，主要作为梅毒的确证试验。两种不同方法同时进行梅毒检测，将减少漏诊、误诊率，为梅毒的确诊提 供参考依据，并且在判定梅毒的发展、痊愈及药物疗效方面都具有十分重要的意义。 关键词梅毒；甲苯胺红不加热血清试验（ＴＲＵＳＴ）；螺旋体明胶颗粒凝集试验（ＴＰＰＡ） 中图分类号：Ｒ４４６．１１文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９３３４（２００９）１２—００２９—０２ ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓＥｘａｍｉｎｇＴｒｅｐｏｎｅｍａ／ＹＵＸ／ａｏ—ｍｉｎｇ，ＨＵＸｕｅ一乃ｎｇ，ＣＨＩ 厶一／／Ｈａｒｂｉｎ２４２ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＡＶＩＣ，Ｈａｒｂｉｎ１５００６６，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ０ｂｊＬ吣ｔｉｖｅ：ｔｏｓｅｌｅｃｔｔｈｅｂｅｓｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｕｉｔｉｎｇｆｏｒｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｓｂｙａｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅｖａｌｉｄｉｔｙｏｆ ＴＲＵＳＴａｎｄＴＰＰＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴＲＵＳＴＷａｓｕｓｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｓｙｐｈｉｈｓｆｒｏｍｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｓ。ａｎｄＴＰＰＡＷａｇｕｓｅｄｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙＴＲＵＳＴ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．ｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅａｎｄｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒａｔｅｏｆＴＲＵＳＴｗｅｒｅ３９．０２％，３．０３％，ａｎｄ６０．９８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１１１ｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅａｎｄｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒａｔｅｏｆＥＵＳＡｗｅｒｅ ９８．７３％。２０．５９％ａｎｄ１．２２％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＴｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＴＲＵＳＴａｎｄＥＬＩＳＡｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｃｈｏｉｃｅｔｏ∞ｒｅｅｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｓｙｐｈｉｌｉｓｆｒｏｍｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｓ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒｔｌｌｉｓｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｂｌｏｏｄｓａｆｅｔｙ． ＫｅｙｗｏｒｄｓＴｒｅｐｏｎｅｍａ：ＴＲＵＳＴ；ＴＰＰＡ ｌ材料与方法 １．１一般资料１３８例患者均为性病门诊确诊者，其中男８３例，占印．１４％，女５５例，占３９．８６％。Ｉ期梅毒６８例，Ⅱ期梅毒５１例，Ⅲ期梅毒１９例。年龄１８～７２岁，平均３２岁。 １．２试剂ＴＲＵＳＴ试剂为上海荣盛生物技术有限公司提供。ＴＰＰＡ试剂为日本富士瑞必欧株式会社提供。试剂均在有效期内使用。 １．３方法ＴＲＵＳＴ试验：室温下，生理盐水稀释至ｌ：３２，每孔滴加心磷脂抗原，１００次／ｍｉｎ振荡器上水平振荡８ｍｉｎ，观察凝集结果，确定其阳性滴度。ＴＰＰＡ试验：室温下，在Ｕ型板上用稀释液将血清稀释，分别加入致敏和未致敏的明胶颗粒，孵育２ｈ观察结果。 ２结果 结果判定：ＴＲＵＳＴ过筛试验在漆圈中出现肉眼可见红色凝集块为阳性；若红色颗粒均匀分布未见凝集为阴性。ＴＰＨＡ确证试验（凝集）＋＋＋＋：红细胞形成膜状覆盖整个孔底，边缘形成皱褶；（凝集）＋＋＋：形成膜状覆盖部分孔底；（凝集）＋＋：形成膜状，边缘成圆环；（凝集）＋：成薄膜状，周围边有粗大圆环；（可凝）±：成纽扣状，中心稍薄；（不凝集）一：成光滑扣状结果表１。表ｌ１３８例梅毒患者的ＴＲＵＳＴ和ＴＰＰＡ试验结果（例％） 从表１两种方法检测为阳性的１３８份样本中。ＴＲＵＳＴ法检出１１１份，占８０％（１１１３８）；ＴＰＰＡ法检出１３３份，占９６．４％（１３３／１３８）；抗ＴＰＰＡ法阳性检出率明显高于ＴＲＵＳＴ法。 ３讨论 从表１中可看出６８例Ｉ期梅毒血清，ＴＰＰＡ阳性６４例，阳性率９４．１％，与顾伟鸣悼１报道的９６．３％结果相近，ＴＰＰＡ对Ｉ期梅毒的敏感度为９４．１％，对Ｉ期梅毒的敏感度高于ＴＲＵＳＴ。ＴＲＵＳＴ具有操作简便、报结果快、价格便宜等优点，可作为梅毒的人群筛查、疗效、复发或再感染的检测指标，当梅毒患者经抗梅毒治疗后，血清滴度下降，可作为疗效观察的指标。ＴＲＵＳＴ试验所用的抗原是从牛心提取的心磷脂和从鸡蛋黄提取的卵磷脂及胆固醇组成，中，结果清晰易读，稳定性好：缺点是许多因素影响结果，高脂皿症和抗心磷脂抗体阳性的血清均可干扰出现假阳性结果，而且该试验在非淋菌性尿道炎患者中存在生物学假阳
细胞培养的过程注意事项
细胞的培养过程及注意事项 根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。 一、原代培养 （一）过程 原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。 1、组织块培养法 (1)基本操作过程 1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS 或Hanks液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。 2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上； 3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞； 4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置； 5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。 2、注意事项 1）、组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。 2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。 3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。
贴壁细胞传代-消化过程图示.
贴壁细胞传代-消化过程图示 贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。 对于贴壁不太紧的细胞如293，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为（以下操作均按无菌操作的要求进行）： o将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去； o加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润； o一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化； o视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。 这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考。 所用细胞为CHO贴壁细胞，培养基为含10％小牛血清的DMEM-F12，倒置显微镜10X40, 数码相机300万像素。
取细胞冻存管一支，于40°C水中速融；25ml细胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培养基10ml，将冻存管中细胞全部洗入瓶中，置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中静置培养。4小时后倒去全部培养基以去除冻存液，更换10ml 培养基，同上静置培养。 经24小时培养后，生长情况为： 经48小时培养后，细胞已长成致密单层：
1医学检验毕业论文 (三种肺炎支原体检测法的临床应用分析)
毕业论文 题目：三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 地市: 学校: 准考证号: 考生姓名: 王莹 指导老师: 二〇一八年八月十四日
三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 摘要 目的探讨肺炎支原体（MP）咽拭子快速液体培养法、咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清MP被动凝集法（MP-Ab）等方法在儿童MP感染诊断治疗过程中的敏感性方法采用3MP检测法对362例临床拟诊呼吸道（非细菌性）感染的患儿的咽拭子和血清标本进行配对研究，每患儿取咽拭子做快速培养和PCR，同时取血清做MP-Ab检测，对3种方法的检测结果与临床诊断治疗病例进行回顾性分析。结果回顾临床病例诊断MP感染患儿152例。MP快速培养法检出阳性78例，阳性率为51.3%，病程为（4.5±2.6）天；PCR法检测出阳性103例，阳性率为67.8%，病程为（6.2±3.5）天；MP-Ab法检测出阳性127例，阳性率83.5%，病程（8.1±4.5）天。结论 3种MP检测法的敏感性与病程有相关性，临床医生应根据患儿病程选取检测方法，以提高阳性检出率和敏感性。 关键词肺炎支原体，快速培养法，咽拭子聚合酶链反应，血清抗体，配对研究
目录 前言 (4) 第一章文献综述 (5) §1.1 肺炎支原体的定义 (5) §1.2 肺炎支原体的发病机制 (5) §1.3 肺炎支原体的分类 (5) §1.4 肺炎支原体的临床表现 (5) §1.5 肺炎支原体的临床诊断 (5) §1.6 肺炎支原体的实验室检查 (6) 第二章材料和方法 (7) §2.1 样本 (7) §2.2方法概述 (7) §2.3临床诊断MP感染的诊断标准 (7) §2.4实验方法 (7) §2.5统计学方法 .................................................................... .. (8) 第三章结果 (9) 第四章讨论 (10) 结论 (11) 参考文献 (11) 附录 (12) 错误！未定义书签。
两种血沉检测方法的比较分析
两种血沉检测方法的比较分析 发表时间：2012-02-01T09:20:22.603Z 来源：《中外健康文摘》2011年第38期供稿作者：杨占甲[导读] 统计学处理将所得数值导入2003版的EXCEL，并对其进行Student-t检验和相关性分析。 杨占甲（河南省郑州人民医院河南郑州450000） 【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）38-0080-01 【摘要】目的采用传统的魏氏法和倾斜管法两种方法来测定红细胞的沉降率，并对两种血沉检测方法进行比较分析。方法随机采集100例血液标本，对这100例血液标本同时采用倾斜管法和魏氏法两种方法进行红细胞沉降率的测定，并对两种血沉检测方法进行统计比较和分析。结果对两种血沉检测方法进行比较分析，两种方法测定的红细胞沉降率差异并不显著（P>0.05），没有统计学意义，相关性很好。结论采用倾斜管法对红细胞的沉降率进行测定是一种简单、便捷的方法，可以在特点的条件下使用，具有推广价值。【关键词】魏氏法倾斜管法红细胞沉降率相关性分析 红细胞沉降率是指在一定条件下，红细胞沉降速度的指标，简称为血沉，英文表示为ESR。一个健康人红细胞沉降率通常在一个比较狭窄的范围内上下波动，不会有大幅度的升降变化，而在很多病例情况的干涉下，红细胞沉降率会表现出明显的增快。血沉检查时非特异性试验的一种，但即使如此，将血沉结果与临床资料相互对照显示，血沉检查在临床上很可以有很多应用，可以辅助判断患者机体是否有炎症，患者病变是否有活动性等等，可以为临床检查提供参数具有很重要的参考价值，临床上也常常采用血沉检测的方法来作为试验诊断的方式。在进行红细胞血沉率的测定时，一定要及时进行，只有这样才不会影响记过，所以可以理解，在医院中，采集患者血液样本进行血沉测定时，并不是有专业的医务人员在实验室进行检测和诊断，而是当护士对患者抽血后，立刻将血液移到无菌处置室来进行血沉测定的，但是不可避免的是，护士可能同时有很多工作需要去处理，便不能保证在准确的时间1h读取血沉值，可能晚些甚至将其以往，有鉴于此，本文介绍另一种测量血沉的方法：倾斜管法，并在此将倾斜管法和魏氏法进行血沉比较分析。魏氏法是国际血液学标准化委员会推荐的常规方法，将倾斜管法与魏氏法进行比较分析更具有说服力。 1 资料与方法 1.1一般资料在2006年～2011年诊科病房的患有不同性质疾病的患者中，随机抽取100例患者的血液标本，其中男53例，女47例，年龄53～81岁，平均年龄67岁。 1.2方法清晨，在患者空腹的情况下从患者身上抽取血液，抽取患者的3.2ml的血液，并将其与3.8%枸橼酸钠溶液混合，枸橼酸钠溶液的体积控制在0.8ml，与此同时向其中注入两支魏氏血沉管至“0”刻度，结束后，将其分别放置在两个魏氏血沉架上，在放置时，两支试管放置的方式不同，其中一个按照常规方法放置，即垂直放置，1h后要低于血浆段的高度进行读取并记录，另一个要放置在特定的自制的等腰直角三角形架子上，保持倾斜45°角，并于10min后将血沉值读取。 1.3统计学处理将所得数值导入2003版的EXCEL，并对其进行Student-t检验和相关性分析。 2 结果 经过1h后采用魏氏法测得的血沉值平均为33.12±32.556mm/h，而经过10min后采用倾斜管法测得的血沉值平均为33.39±32.509mm/h，用统计学方法对两组数据进行Student-t检验，结果表明两种方法检测结果没有统计学意义（t=0.59，P=0.52>0.05），对两组结果进行相关性分析，分析结果显示两种方法的检测结果呈正相关，相关系数为r=0.97，数据显示两者相关性较好。 3 讨论 测量红细胞沉降率在临床上应用很广泛，将血沉结果与临床资料相互对照显示，血沉检查在临床上很可以有很多应用，可以辅助判断患者机体是否有炎症，患者病变是否有活动性等等，可以为临床检查提供参数具有很重要的参考价值，临床上也常常采用血沉检测的方法来作为试验诊断的方式。魏氏法是最经典最传统最常规最可靠的检测血沉的方法，魏氏法也是国际血液学标准化委员会推荐的常规方法，但是在实际应用中，魏氏法的过程比较复杂，需要手工操作，而且对观察记录的时间也有比较严格的要求，人们近年来一直在寻求一种更简便、更省事的测量血沉方法，比较熟悉的是采用自动电子血沉仪，这种电子血沉仪虽然更加便捷，且检测的时间也不长，但所得的检测结果受到很多外界因素的影响，但是仪器的成本比较高，并不是所有的医院都可以普及。倾斜管法对仪器并没有新的要求，而且检测的时间短，仅需10min便可，且检测结果可以直接读出来而并不需要进行换算，从两种血沉检测方法的比较分析中，倾斜管法与魏氏法几乎没有差别，相关性较好，对于血沉增高患者结果更加明显，所以倾斜管法适用于血沉增高患者或者需要经常复查血沉的患者，可以对其进行动态检测。 参考文献 [1]陆金春，李春德，黄宇烽.临床检验报告速查手册[M].上海：上海第二军医大学出版社,2009. [2]卢雁英，赖桂凤，郑丹丹．血液标本采集对检验结果的影响[J].包头医学院学报,2011(3):14-15. [3]马翠萍，魏以壁.二级医院检验科生物安全管理现状及对策[J]．医学理论与实践,2011(10):132-133. [4]李恵,高洪国,张元梅．两种红细胞沉降率检测方法的比较[J].齐齐哈尔医学院学报,2011(7):67-68.
细胞培养的流程
细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？ 对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。 如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！ 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！ 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。 我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法） （一）仪器的清洗 总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液） 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。 今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！ 每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！ 您的这个帖子属于改范畴！ 感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！ 再次感谢！再多说点啊！ 呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗： 对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、
细胞培养试剂及操作流程
实验规范化流程 一、细胞培养所需 1、10%FBS 1640培养液。 2、10%FBS DMEF/12培养液。 3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。 4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。 5、胰酶 6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为1640 7、真核抗生素： G418: 50mg/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml T47D 400ug/ml) 嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、 MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/ml MDA-MB-231 5ug/ml 潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液） 环丙沙星 左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ） 9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ） 10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ） 一、细胞培养相关技术 1、细胞复苏 准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程： （1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。 （2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。 （3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。 （4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。 2、细胞传代
检测方法比较
激光散射速率法：激光散射技术是指用激光作光源，在入射光方向以外，借检测 散射光强度、频移及其角度依赖等而得到粒子重量、尺寸、分布及聚集态结构等信息的方法的统称，有着广阔的用途。就检测纳米材料而言，主要涉及频移及其角度依赖性的检测，这种散射技术又称动态光散射、准弹性光散射及光子相关光谱，分别以测定参数的性质、能量转移的大小及测定方法的原理而得名。 散射比浊法：散射比浊法是根据待验样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点的。在该方法中检测通道的单色光源与光探测器呈90°直角，当向样品中加入凝血激活剂后，随样品中纤维蛋白凝块的形成过程，样品的散射光强度逐步增加。当样品完全凝固以后，散射光的强度不再变化，通常是把凝固的起始点作为0%，凝固终点作为100%，把50%作为凝固时间。光探测器接收这一光学的变化，将其转化为电信号，经过放大再被传送到监测器上进行处理，描出凝固曲线 透射比浊测定法:是测定入射光强度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接测定散射的光强。这一点与分光光度测定法极为类似。用这种方法时，多用聚乙二醇（PEG）作为反应增强剂。这种非离子型聚合物可以降低抗原抗体复合物的溶解度。 免疫层析法:是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。 目的: 评估透射免疫比浊法和速率散射比浊法检测C反应蛋白(CRP)的灵敏度和特异性.方法: 用免疫透射比浊法和速率散射比浊法同时检测了80例各种患者血清中CRP浓度. 结果: 两种方法在8～20 mg/L 、20～40 mg/L、40～80 mg/L、80～160 mg/L、160～300 mg/L范围内测定C 反应蛋白的相关系数是0.990、0.996、0.995、0.992、0.997,说明两种方法的相关性是良好的,而在低值1～8 mg/L的测定中两方法的相关系数为0.928.结论: 速率散射免疫比浊法在低值和高值测定中可以得到较为准确的CRP检测结果.
支原体检查
附录XIIB支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法 第一法培养法 推荐培养基及其处方 （1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （3）支原体半流体培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。 （4）支原体琼脂培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法）（1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。 （2）操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基
内。每个稀释度接种3支试管，置36℃ 士1℃ 培养7～14天，观察培养基变色结果。 ( 3 )结果判定以接种后培养基管数的2 / 3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 )应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。 检查法（1）供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃ ；超过24小时应置一20℃ 以下贮存。 ( 2 )检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃ 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2 )，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml的支原体半流体培养墓（已冷至36℃ 士1℃ ）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃ 士1℃ 培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃ 士l℃ 培养21天，每隔3天观察1次． ( 3 )结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。 第二法指示细胞培养法（DNA染色法） 将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。 试剂（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加人100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank 's平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，-20℃ 避光保存。 （2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank ' s溶液100ml中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml，混匀。 （3）固定液醋酸:甲醉（体积比1:3）混合溶液。 （4）封片液量取0.1mol / L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol / L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。 培养墓及指示细胞（1） DMEM完全培养基。 ( 2 ) DMEM无抗生素培养基。
贴壁细胞培养实验讲义
贴壁细胞培养技术课讲义 一、克隆形成及克隆形成抑制试验 克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。 常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。 平板克隆形成实验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 1.准备所需试剂及物品： ①含10%及15 %新生牛血清的RPMI-1640培养液（15 ml/组，8组） ②PBS ③0.25%胰酶 ④5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司）， 100 μg/ mL（每1mL生理盐水含100ug药物5-FU），（EP管分装，1ml/管x 8）使用前稀释至所需浓度。 ⑤甲醇：冰醋酸（3:1） ⑥细胞染色液（吉姆萨、甲基绿、刘氏染液选一即可） ⑦12孔板（或6孔板）⑧EP管⑨滴管、小瓶等⑩相机、反光板等 ⑧实验需用的细胞株胃腺癌细胞MGC7901 2.操作： 实验为无菌操作，均需在超净工作台或安全柜中进行。因此，每次实验前需提前常规将操作台紫外杀菌，乙醇消毒（前已述，在此不多述）。 第一天： ?制备细胞悬液：取对数生长期胃腺癌细胞MGC7901，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，用含15%血清的RPMI-1640稀释，使细胞密度为3×102cell/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。 具体操作如下： ①胰酶消化：将培养瓶中原培养液从上面轻轻吸取弃之（可用滴管），加消化液1ml使之均匀分布作用于瓶内贴壁生长的细胞，细胞变形呈圆形颗粒附着于瓶底（镜下可见）即可弃消化液（可用滴管）（一般数十秒甚至几分钟）。