揭秘人体冷冻保存技术：死而复生或难实现

英语演讲选修课人体冷冻

55. Personalize your ideas ?Personalize: to present one’s ideas in human terms that relate in some fashion to the experience of the audience. * People are interested in people. Sample speech with commentary Cryonics by Jayne Richter 1.The time is now. Imagine your mother or father has suffered a heart attack. Deprived of its vital blood supply, a part of their heart is dying. Or imagine your grandmother or grandfather lying nearly motionless in their nursing home bed. Advanced age, complicated by pneumonia, is about to end their lives. Or imagine a close friend has just entered the hospital with a massive systemwide infection. AIDS has left their body ravaged by multiple diseases. ?Begin with examples to get attention because they relate the topic to the audience.

细胞冻存方法

细胞冻存方法 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。 （2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 三、细胞冻存方法 主要操作步骤为： （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

细胞冻存的方法与步骤

细胞冻存的方法与步骤文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）

细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶??????〖〗 一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法： （1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。

国内首例本土人体冷冻于今年5月份完成,价格昂贵,每年补充液氮就需5万元

国内首例本土人体冷冻于今年5月份完成，价格昂贵，每年补充液氮就需5万元 2017年5月8日凌晨，展文莲被宣布死亡，年仅49岁。 但她还要再经历一场手术。山东银丰研究院和山东大学齐鲁医院的专家们要将她“冷冻”了起来。丈夫桂军民几乎是毫不犹豫且坚定地接受了，“我比较相信新科技，（复活）完全有可能。我受过教育，这个事情（指接受人体冷冻），很简单。”

他将妻子的“遗体”捐赠给了齐鲁医院，成为了“生命延续计划”的志愿者。在银丰研究院的美国专家看来，“死亡”不是一个瞬时概念，也并非不可逆。就算心脏停跳、呼吸停止，人的身体和大脑，还“活”着。做人体冷冻耗资不菲，“每做一次冷冻，光是冷冻保护剂的费用就是二三十万。还有手术的其他耗材费用，专家费用，救护车费用等等。”

专家称，人体进入低温保存状态后，每隔10天到半个月需要补充一次液氮，这一费用大约为每年5万元。

所谓人体冷冻(或人体冷藏)，就是指一种试验中的医疗科学技术，把人体或动物在极低温(摄氏零下196度以下)的情况下冷藏保存，梦想未来能通过先进的医疗 科技使他们解冻后复活及治疗。目前最大型的人体冷藏公司为美国的阿尔科生命延续基金和美国人体冷冻机构。 一些曾在苏联低温生物学研究学会工作过的科学家们对冷冻死者遗体 和脑袋,可以盼望将来"复活"的说法嗤之以鼻，并指责这种行为是一种"专骗死人钱"的诈骗行为。

低温生物学研究专家格里申科说:"即使是将一个活着的健康的人冷冻起来，那么当你再为他解冻后，他也不可能再活下来。"克里奥鲁斯公司老板辩解称，他们并没有给予顾客任何将来可以"复活"的担保。但他们的服务可以给一些惧怕死亡的人或死者的悲痛亲属提供某种心理安慰。人体冷冻复活术最早出现在科幻小说中。 1931年，美国《奇异》杂志发表的一篇故事写到，一个叫詹姆斯的人去世后，遗体被发射到太空中，在那里，寒冷和真空使其遗体无限期保存下来。几百万年后，人类早已灭绝，某种外星机械民族发现了这具冷冻的尸体。他们把詹姆斯的头颅复活后移植到一个机械人身上，后来，詹姆斯便长生不死了。被称为"人体冷冻学之父"的罗伯特·埃廷格看到这

细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项

培养细胞的冷冻保存与复苏 ?概述?冻存过程 ?冷冻保存与复苏的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论

? Ｐolge等人(１9４9)发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用,她们仍 然以精子进行研究发现,加入甘油能够大大提高贮存于-７９0C下精子的存活率。接下来的重大进展就是Luyｅｔ(１9５1)与Ｌoveｌock(1953)等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。她们的结论就是,电解质浓度增大就是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Ｍerryman(１９5６)、Reｙ(195７)以及Ｓmｉtｈ(1９61)等学者的继续与发展。 １94９年至1９６0年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”,这一时期对生物材料的冷冻保存一般都就是以甘油作为保护剂。Lovｅｌock(１95９)等人发现了一种新的化学保护剂,这就就是人们熟悉的二甲基亚砜(ＤMSＯ)。而且,用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前,无论就是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品与设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟与完备。 返回页首 ?冷冻保存与复苏原理 在低于-70０C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极其缓慢,甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度的降低,细胞内外的水分都会结冰,所形成的冰晶会造成细胞膜与细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度的降低,细胞外部的水分会首先结冰,从而使得未结 冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长,

俄人体冷冻专家揭秘永生：保存大脑仅1万美元

俄人体冷冻专 家揭示永生奥秘 北京时间1月4日消息，据俄罗斯《五线谱》报道，不会生病，不会变老，人人都梦想永生。科学家认为，这种出现在科幻片中的情节是有可能变成现实的。科学不断向前发展，人体冷冻的疯狂想法已成为现代生活的一部分。生物衰老研究所首席专家、生物物理学家伊戈尔-阿尔特尤克霍夫向《真理报》总编辑伊娜-诺维克娃讲述了人类在永生上的不懈努力。 以下为访谈实录： 诺维克娃：“阿尔特尤克霍夫先生，如果你把一个死于绝症的人冰冻起来，20年、30年、40年甚至100年内有可能对他进行治疗吗？” 阿尔特尤克霍夫：“20年后，这或许不可能。但40年内，我不会排除这个可能性。如果人们在100年内还没有掌握这项技术，我会感到非常吃惊。如果科技以今天这个速度向前发展，那很可能变成现实，而且可能性非常大。” 诺维克娃：“我们知道有家公司叫KrioRus，它主要研发未来冷冻保存技术。你和这家公司有关吗？” 阿尔特尤克霍夫：“是的，事实上我是这家公司研究部门的负责人。老实说，我们在那里并没有做太多科学实验，原因很简单，就是没有支持这种研究所需的财政资源。这家公司处在生存的边缘，所以提供的服务不会很贵。” 诺维克娃：“有多便宜？” 阿尔特尤克霍夫：“冷冻保存大脑只需约一万美元，整个身体需要3万美元，而且这是一次性费用。” 诺维克娃：“也就是说，你们和客户签订了合同。”

阿尔特尤克霍夫：“是的。但大多数人打来电话都说，‘你知道，我们的爷爷已经去世了，我们想把他冷冻起来。’” 诺维克娃：“你们已冰冻多少身体或身体部分？” 阿尔特尤克霍夫：“约20个。” 诺维克娃：“你们有一个储藏设施。里面必须具备一些条件？” 阿尔特尤克霍夫：“是的，里面有液氮，温度在零下196摄氏度。在这么低的温度中保存是项很难的技术。事实上，把钱花在这上面是值得的。” 诺维克娃：“你能从科学角度解释一下这项技术吗？” 阿尔特尤克霍夫：“经验告诉我们，许多动物和昆虫都可以被冷冻，而且在不会对它们造成过多伤害的情况进行解冻。例如，西伯利亚蝾螈生活在雅库特。进入冬天，这里的温度经常在零下40摄氏度。这种动物爬进永久冻土裂缝中，可留在那里很长时间。” 诺维克娃：“有多长？” 阿尔特尤克霍夫：“记录在案的最长时间是90年。血液、精子和干细胞都可储存在冰冻状态中。” 诺维克娃：“现在我们设想你的客户将来解冻了，也得到治疗，结果这个人却对新生命一无所知，他们甚至一时无法适应。这时怎么办？”科幻世界 阿尔特尤克霍夫：“当然，这是个问题。一个人从偏远村落来到大城市，一开始也不适应，但随着时间推移他们会慢慢习惯陌生环境。我们有专人为客户适应一切开发一个特殊程序。但我认为，相比在人体解冻过程中会出现的其他挑战，适应将成为一个最简单的问题。” 诺维克娃：“你将来会写科幻小说吗？” 阿尔特尤克霍夫：“这不是真正的科幻小说，而是把实践记录下来。但我还没最终确定写还是不写。一个人可以有选择。例如对我来说，看到未来发生的事会非常有趣。” 诺维克娃：“你准备在自己身上进行这项实验吗？” 阿尔特尤克霍夫：“当然。我做这一切还会有其他理由吗？” 诺维克娃：“你是为自己做这一切？” 阿尔特尤克霍夫：“自然是这样的。KrioRus毕竟是个非营利组织。为确保财政稳定，我们花钱非常谨慎。这家公司就是为我们自己和我们所爱的人创办的。” 诺维克娃：“你有接班人吗？谁会继续从事这项工作？”

细胞冻存的方法与步骤

细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1、材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法： （１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。 ３、步骤： （1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 （2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。

alcor人体冷冻程序

A patient being prepared for cryoprotectant perfusion at Alcor's facility in Scottsdale, Arizona. 在亚利桑那州斯科茨代尔的Alcor基地，医护人员正准备对病人进行冷冻保护剂 灌注。 Alcor Procedures Alcor的冷冻程序 The purpose of cryonics is to preserve life. Alcor therefore intervenes in the dying process at the earliest moment that is legally possible. If proper procedures are followed immediately after the heart stops, then legal death need not impact the biology of cryonics or its prospects for success. For further information concerning this issue see Cardiopulmonary Support in Cryonics. 人体冷冻的目的是保护生命。因此，Alcor会在法律允许的范围内，尽可能早地干预死亡过程。如果在心脏停止跳动后立刻采取适当措施，那么虽然在法律上病人已经死亡，但并不会影响人体冷冻的实施以及冷冻成功的概率。欲了解有关该问题的更多信息，请参见人体冷冻中的心肺支持。 Cases with Cardiopulmonary Support

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展 蔡元1、2，张凤鸣1、2，潘红梅1、2、，陈四清1、2 (1.重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460 .2.重庆市养猪工程技术研究中心重庆荣昌402460) 摘要：本文对家畜胚胎冷冻保护液的成分、冷冻方法、胚胎解冻方法与冷冻保护剂的脱除及最新研究进展进行了综述。 关键词：家畜；胚胎；冷冻保存 Present Research Advance in Cryopreservation of Livestock Embryos Cai yuan1、2, Zhang fengming1 2 ,Pan hongmei1、2 ,Chengsiqing1 2 (1.Chongqing Institute of Animal Science ,Chongqing Rongchang 402460 2.Chongqing Swine engineering Research，Chongqing Rongchang 402460) Abstract： Advances on cryoprotextive solution, freezing way, thaw way and the elimination of cryoprotective solution and recent situation in livestock embryos were reviewed in this paper. Key words：Livestock；Embryo；Cryopreservation 家畜胚胎的超低温冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单有效的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。自从1972年,英国学者Whittingham等人首次冷冻保存小鼠胚胎获得成功后[1]，到目前已经在20多种哺乳动物上获得成功，奶牛、黄牛、山羊、绵羊、马、兔和小鼠等的冷冻胚胎已得到较广泛的使用[2-3]，特别是牛和羊的胚胎冷冻保存研究进展很快，其冷冻胚胎已经走向商品化应用。目前人们对冷冻保存原理、冷冻保存的因素和冷冻方法进行了广泛的研究并取得了巨大进步。 1、抗冻保护剂和冷冻溶液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中，加入抗冻保护剂的目的是为了防止冰晶的形成。抗冻保护剂常可分为三类：(1)细胞内液抗冻保护剂。常用低分子量可渗性物质，例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等；(2)细胞外液抗冻保护剂。常用低分子量不可渗性物质，例如半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trchaose)、聚蔗糖(Ficoll)等。（3）大分子量不可渗性物质，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，羟乙基淀粉及其它一些聚合物。 在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂，如甘油或乙二醇等，而快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冻保护剂，如甘油和丙二醇、甘油和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。甘油可调节细胞脱水并保护蛋白结构，而糖类，例如海藻糖可以保持膜结构，甘油本身并不能保持细胞膜结构，而且在高浓度和高温下可以诱发膜融合，因此解冻后需尽快除去甘油。这些不同低温保护液的特性表明，他们是以不同方法来保持胚胎细胞免受冷冻损伤，有效的低温保护液应将各种低温保护剂

最新alcor人体冷冻程序汇总

a l c o r人体冷冻程序

A patient being prepared for cryoprotectant perfusion at Alcor's facility in Scottsdale, Arizona. 在亚利桑那州斯科茨代尔的Alcor基地，医护人员正准备对病人进行冷冻保护剂灌 注。 Alcor Procedures Alcor的冷冻程序 The purpose of cryonics is to preserve life. Alcor therefore intervenes in the dying process at the earliest moment that is legally possible. If proper procedures are followed immediately after the heart stops, then legal death need not impact the biology of cryonics or its prospects for success. For further information concerning this issue see Cardiopulmonary Support in Cryonics. 人体冷冻的目的是保护生命。因此，Alcor会在法律允许的范围内，尽可能早 地干预死亡过程。如果在心脏停止跳动后立刻采取适当措施，那么虽然在法律 上病人已经死亡，但并不会影响人体冷冻的实施以及冷冻成功的概率。欲了解 有关该问题的更多信息，请参见人体冷冻中的心肺支持。 Cases with Cardiopulmonary Support

玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用

玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用 戴志俊季钢张芳芳张奕 （合肥市妇幼保健院，合肥230001，安徽） 摘要：目的：探讨玻璃化冷冻法保存人类囊胚的临床应用效果。方法：回顾性分析2011年1月～10月在我院生殖中心行玻璃化冷冻解冻囊胚患者共12个周期的结局。结果：玻璃化冷冻解冻共21枚胚胎，存活21枚（存活率100%），共解冻12个周期，均有胚胎移植，获得临床妊娠5例（妊娠率41.67%），着床率23.81%（5/21）。结论：玻璃化冷冻法是保存人类囊胚的一种有效方法。 关键词：囊胚，玻璃化，冷冻保存，人类 Clinical Application Of Vitrification For Human Blastocysts Dai Zhijun, Ji Gang , Zhang Fangfang , Zhang Yi （Hefei Maternity and Child Health Hospital,Hefei 230001,Anhui）Abstract:Objective: To examine the clinical value of vitrification for human blastocysts. Methods: Retrospective analysis of 12 patients who conduct embryos vitrification from Jua.2011 to Oct.2011. Results: All of the 21 blastocysts were thawed and survived , survival rate was 100%(21/21);5 cycles of 12 cycles got clinical pregnancy after transferred, clinical pregnancy rate were 41.67% ,implantion rate were 作者单位：合肥市妇幼保健院 安徽医科大学妇幼保健临床学院安徽230001

细胞冻存方法

冷冻保存方法： （1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 （2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。 （3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 4、注意事项： （1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。 （2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 （3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 这是我的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与1ml的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀

细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)

背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 易生物仪器库：https://www.360docs.net/doc/971535812.html,/yp/product-list-42.html （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清

胚胎冷冻保存技术

胚胎冷冻保存技术 摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。 关键词：胚胎冷冻保存 为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。 现有的胚胎冷冻保存方法有四种： 一、常规冷冻法 常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。 二、一步冷冻法 一步冷冻法：也叫一步细管法。该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。 三、程序冷冻法 程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。 程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。 通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。在冷冻仪内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自身的特性，

冷冻人能否成真

“冷冻”人能否成真？ 苏少奎《光明日报》（ 2012年06月19日 06 版） 科幻影片中冷冻人体的场景。资料图片

美国阿尔科生命延续基金会的冷冻人体设备。 资料图片 这是一个常见的、也是最令人震惊的实验：将活的金鱼迅速放入液氮中，金鱼被冻僵，一动不动，宛如死了一般。然后，再将金鱼迅速放入水中，几秒钟后，金鱼又“复活”了，在鱼缸中游弋。

人类是恒温动物，低温是生命的大敌；但在低温的世界里，很多我们熟悉的东西发生了不可思议的变化，这让人们产生了无限遐想。就如液氮中“死而复生”的金鱼，人类能否也利用液氮冷冻自身，待医学极度发展时再解冻“重生”，甚至，获得永生？ A 金鱼为何“死而复生” 我们生活的温度，称之为室温；从室温到-120℃，我们称之为普冷，从-120℃到-272.15℃为低温，低于-272.15℃，也就是低于1K，被称为极低温。我们常见的低温环境主要是由液氮、液氦等低温液体来保持的。液氮是将空气中的氮气液化得到的；液氦是将天然气中的氦气液化获得的。液氮的在标准大气压下的沸点是77.3K（-195.8℃）；液氦的在标准大气压下的沸点是4.2K（-268.9℃）。 随着温度的降低，一些化学反应会减缓，甚至停止。最典型的、且最和我们相关的，就是生命的新陈代谢的反应。金鱼的试验就是这个道理。 这是为什么呢？原来，当水缓慢降温时，会发生相变，变成晶体冰，体积会膨胀。但是，当水迅速降温时，液体水会变成固体的冰，我们称之为非晶冰。非晶冰的体积与水的体积没有变化。 我们知道生命体的主要物质是水。所以，生命体若是缓慢降温，其体内细胞内的、血管内的水变成晶体冰后，体积膨胀，从而胀破细胞或血管，进而造成生命体的伤害或者死亡；若是迅速降温，水成为非晶冰，体积没有变化，则不会造成伤害，只是让生命体的新陈代谢停止，生命被暂停、保存。当生命体迅速回到室温时，在温度激发下，各个反应又开始进行，也就是又开始了新陈代谢。 冷冻能不能成功，这就涉及低温保持生命的成功的关键——降温速度了。要想得到非晶冰，降温速度要非常快，甚至要到100万K/S。对于微小的生物，如细菌、精子、卵子等大

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤

细胞冻存和细胞复苏的方法步骤 点击次数：3337 发布时间：2011-4-12 细胞的冻存 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、细胞冻存操作步骤： (1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 (2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。 (4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

小鼠胚胎冷冻方案

药品器材清单 PMSG 孕马血清促性腺激素 hCG 人绒毛膜促性腺激素 DPBS 杜氏磷酸缓冲液 M16 体外培养液 EG 乙二醇 蔗糖 塑料细管 1ml注射器 35mm培养皿若干 二氧化碳培养箱 小鼠胚胎的获取 控光（14h光照，10h黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG，48h后腹腔注射10 IU/只hCG。注射hCG后（计时为0h）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。在DPBS中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。 小鼠胚胎的玻璃化冷冻 平衡液EG10，见附录溶液的配制。 玻璃化溶液EFS40 ，见附表2。或者EG40，亦见附录溶液的配制。 解冻稀释液用DPBS稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。 将室温调至25℃,经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance) 按顺序吸入解冻稀释液5cm———空气1㎝——1.5cm玻璃化溶液。 用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟,而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。 小鼠冷冻胚胎的解冻 将冻好保存于液氮中的细管,取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出,用吸水纸将细管水珠拭净,剪断细管两端的栓塞后,用含有解冻稀释液(0. 8ml)的注射器(带16号针头),将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀,置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟,以便脱出细胞内部乙二醇,再用PBS洗净后,移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气,相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。 小鼠胚胎的发育能力判定 体外培养回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。 胚胎移植解冻后的胚胎,约经3小时培养,选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中,一侧5～7枚,每只受体10～14枚胚胎为宜。妊娠19～22天观察产仔情况。

哺乳动物胚胎冷冻保存综述

哺乳动物胚胎冷冻保存综述 09动物生物技术2班 200930380216 宋骥晨 摘要：哺乳动物胚胎冷冻保存效果受冷冻保护剂、冷冻方法、解冻方法等多种因素影响, 其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻; 玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比, 玻璃化冷冻法简化了操作过程, 大大缩短了操作时间, 不需昂贵的程序控制冷冻仪。 关键词：胚胎; 冷冻保存; 冷冻保护剂; 冷冻; 解冻 胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在 -196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。1972年, whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。 1.胚胎冷冻保存原理 胚胎细胞是发育中的细胞, 细胞内水分含量达到80%以上, 如

果不经保护, 冷冻时细胞内部就会形成冰晶, 破坏蛋白质的结构使其发生不可逆的变化, 从而导致胚胎死亡。常规慢速冷冻法的原理是通过加入低浓度的防冻剂, 缓慢降温将胚胎内的水分在冻结前脱出, 阻止冷冻过程中形成有害冰晶而造成胚胎损伤。将胚胎放到含有渗透性防冻剂的溶液中,防冻剂使胚胎细胞内的水分能够在-10℃以上不冻结并且能替换出部分水分。随着降温的进行, 细胞外液开始形成冰晶, 细胞外液浓度变高, 由于渗透压的原理使细胞内的水分开始脱出。为了保证细胞外液冰晶形成的时间总是早于细胞内液, 大多数冷冻程序采用植冰的方式来诱发细胞外液冰晶的生长, 植冰通常在-5℃到- 7℃进行。缓慢降温使细胞内的水分有更多的时间在冻结前脱出。需要指出的是, 胚胎在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶。关键是冰晶的大小和数量能否造成胚胎的损伤。玻璃化冷冻保存的原理是在足够低的温度下或采用高浓度的防冻剂使冷冻过程中形成玻璃样物质减少细胞内外冰晶的形成。总之, 无论采取何种冷冻方法, 胚胎冷冻保存的原理都是阻止冷冻、解冻过程中细胞内形成致死冰晶。 2.抗冻保护剂和冷冻保护液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中, 冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。-15℃~ -50℃是一个致死温度区, 在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。抗冻保护剂主要分为3类：（1）低分子质量可渗物质, 如甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油等一些醇类; （2）低分子质量不可渗物质, 如葡萄

细胞冷冻保存方法、复苏经验总结

细胞冷冻保存方法、注意事项 1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 –90 ％致密度。 2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron F GLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 4、冷冻保存之细胞浓度： （1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml （2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。 （3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。 （4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 10 6cells/ml。 5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 6、冷冻方法： （1）传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 长期储存。 （2）程序降温：利用等速降温机以–1 ～-3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 7、材料：