实验室操作规程sop
分子病毒及生物制药实验室操作规程
二O 一O 年四月二十四日
分子病毒及生物制药实验室研究方向为动物源性病原跨种间传播机制和分子进化、病原微生
物与宿主之间相互作用、抗病毒药物（细胞因子）的研究与开发及乙肝病毒侵染机理、致病机制
及乙肝治疗的研究。
课题组负责人：刘文军，博士，中国科学院微生物研究所在职研究员，博士生导师。中国科
学院病原微生物与免疫学重点实验室副主任，分子病毒中心主任，中关村科技园区分子病毒及生
物制药开放实验室主任。主要从事流感病毒跨种间传播的分子机制、病毒的分子进化及病毒结构
蛋白与宿主内蛋白相互作用的生物学意义研究，研究开发增强机体免疫和抗病毒的蛋白质药物。
分子病毒及生物制药实验室研究内容为流感等重大传染病病原微生物的分子流行病学、分子
进化规律的研究；重大传染病病原微生物与宿主相互作用及跨种间传播机制的研究；肝炎病毒侵
染机理、致病机制、免疫应答及免疫防治的研究；新型抗感染治疗药物的研发；新发、突发人畜
共患病原微生物（病毒与细菌）基因组、转录组、蛋白组分析；重要免疫分子与病原微生物蛋白
结构与功能研究等。
实验室操作规程（分子病毒及生物制药实验室操作规程）的制定是为了更好的规范实验室基
本操作，使实验室的操作规程化、标准化，为实验室操作及标准化认证提供理论基础和参考依据。
实验室操作规程主要编者：刘文军研究员实验室操作规程审核人员：朱以萍、孙蕾、杨利敏、刘晓玲、贾晓娟实验室操作规程参编人员：王增福、周远成、于茂荣、张珂、许崇凤、孟珊珊、曹帅、王珊
珊、张定勇、赵振东、陈才伟、高晟妍、瞿洪仁、李铮、陆鹭、高蕾实验室操作规程编辑及排版：李晶虽然我们在修订过程中力求全面、完整，但由于时间较紧、工作量大，加上笔者的水平和能
力有限，归纳成册后疏漏及错误之处肯定不少，殷切希望实验操作人员提出批评指正。
编者
2010-4-24
血凝抑制试验的标准操作规程（编号：001） (1)
酶联免疫吸附（ELISA）试验的标准操作规程（编号：002） (5)
聚合酶链式反应（PCR）的标准操作规程（编号：003） (10)
引物设计的标准操作规程（编号：004） (14)
质粒提取及纯化标准操作规程（编号：005） (17)
质粒线性化及纯化的标准操作规程（编号：006） (20)
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007） (21)
T载体克隆标准操作规程（编号：008） (23)
蓝白斑筛选标准操作规程（编号：009） (25)
DNA琼脂糖凝胶电泳标准操作规程（编号：010） (26)
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞标准操作规程（编号：011） (28)
核酸连接试验标准操作规程（编号：012） (29)
琼脂糖凝胶回收纯化DNA标准操作规程（编号：013） (30)
病毒TCID50测定的标准操作规程（编号：014） (31)
细胞病变抑制法测定干扰素效价标准操作规程（编号：015） (34)
反向遗传技术拯救流感病毒标准操作规程（编号：016） (37)
膜结合试验的标准操作规程（编号：017） (38)
拓扑结构分析荧光蛋白酶保护试验标准操作规程（编号：018） (39)
转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程（编号：019） (40)
稳定表达细胞系的建立和鉴定的标准操作规程（编号：020） (42)
FCM流式细胞术检测细胞表面蛋白的标准操作规程（编号：021） (44)
FITC标记抗体的标准操作规程（编号：022） (45)
HBV假病毒包装的标准操作规程（编号：023） (47)
哺乳动物细胞HepG2 电转化的标准操作规程（编号：024） (49)
肝组织总蛋白提取的标准操作规程（编号：025） (50)
慢病毒表达系统的标准操作规程（编号：026） (52)
人肝组织冰冻切片免疫组化染色的标准操作规程（编号：027） (54)
提取纯化细胞和组织膜蛋白的标准操作规程（编号：028） (56)
细胞计数试验的标准操作规程（编号：029） (58)
细胞冷冻和复苏的标准操作规程（编号：030） (59)
PEI转染细胞方法的标准操作规程（编号：031） (61)
真核细胞裂解和总蛋白提取试验的标准操作规程（编号：032） (63)
ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程（编号：033） (65)
血清-病毒中和试验的标准操作规程（编号：034） (68)
淋巴细胞增殖试验的标准操作规程（编号：035） (70)
ELISPOT测定小鼠IFN-γ水平试验的标准操作规程（编号：036） (72)
MTT法的标准操作规程（编号：037） (76)
PCR鉴定目的基因在酵母基因组中的整合标准操作规程（编号：038） (77)
SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039） (78)
毕赤酵母电转化的标准操作规程（编号：040） (85)
蛋白质染色（银染法）标准操作规程（编号：041） (88)
基因重叠延伸法合成基因的PCR方法标准操作规程（编号：042） (90)
目的蛋白抑菌活性检测的标准操作规程（编号：043） (92)
重组酵母的诱导表达的标准操作规程（编号：044） (93)
提取哺乳动物细胞染色体外DNA 标准操作规程（编号：045） (96)
ELISA检测血清及细胞上清中HBsAg和HBeAg的标准操作规程（编号：046） (98)
哺乳动物细胞的脂质体转染的标准操作规程（编号：047） (100)
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048） (101)
GST Pull-down的标准操作规程（编号：049） (103)
免疫共沉淀（CO-IP）的标准操作规程（编号：050） (105)
Western Blot的标准操作规程（编号：051） (107)
RT-PCR的标准操作规程（编号：052） (109)
Real-time RT-PCR 标准操作规程（编号：053） (111)
流感病毒的收集与纯化标准操作规程（编号：054） (113)
噬斑试验的标准操作规程（编号：055） (114)
流式细胞仪标本制备的标准操作规程（编号：056） (115)
细胞培养的标准操作规程（编号：057） (116)
荧光共定位的标准操作规程（编号：058） (118)
流式细胞技术检测流感病毒M1 抗原的标准操作规程（编号：059） (120)
FCM流式细胞术检测细胞表面蛋白的标准操作规程（编号：060） (122)
Phage-ELISA标准操作规程（编号：061） (123)
噬菌体库滴度测定的标准操作规程（编号：062） (126)
噬菌体库固相-液相筛选的标准操作规程（编号：063） (128)
离子交换层析的标准操作规程（编号：064） (132)
化学交联的标准操作规程（编号：065） (134)
Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程（编号：066） (135)
Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白的标准操作规程（编号：067） (137)
分子筛层析的标准操作规程（编号：068） (139)
亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程（编号：069） (141)
木瓜蛋白酶酶切IgG的标准操作规程（编号：070） (143)
Tricine-SDS PAGE的标准操作规程（编号：071） (145)
包涵体纯化的标准操作规程（编号：072） (147)
大肠杆菌表达蛋白的标准操作规程（编号：073） (148)
附录 (149)
附录1 实验室常用技术参数资料 (150)
附录2 PAGE凝胶配方表 (168)
附录3 蛋白质电泳相关试剂、缓冲液的配制方法 (169)
附录4 实验室常用试剂、缓冲液的配制方法 (171)
血凝抑制试验的标准操作规程（编号：001）
1. 目的
该SOP 是利用具有血凝性的病毒凝集动物红细胞的能力可以被相对应的抗体抑制使其不能再凝集红细胞的现象来测定与该病毒相对应的抗体的效价。
2. 适用范围
该SOP 适用于具有血凝性的病毒类疫苗免疫动物后血清抗体的检测并依此进行疫苗的效力检验，可用于猪流感疫苗、禽流感疫苗、猪细小病毒疫苗、鸡减蛋综合症灭活疫苗等的效力检验；免疫后及时监测，辅助诊断病毒性疾病。
3. 主要仪器
1000～5000rpm 台式离心机、冰箱、微量振荡器、96 孔V 型血凝板、八道加样器、200μL单通道加样器、积液槽
4. 试剂
4.1 生理盐水、柠檬酸三钠、重铬酸钾、硫酸、蒸馏水
4.2 抗凝剂的制备
用天平称量3.8g 柠檬酸三钠，溶入100mL 生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
4.3 红细胞悬液的制备
4.3.1 红细胞的采集：选1～2 只健康鸡，将血液采集到等量抗凝液中混匀，置4℃冰箱保存。
4.3.2 红细胞悬液的制备：以800～1000rpm 离心5min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中800rpm 离心5min，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5 次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液。放入4℃ 冰箱中可保存2～3d。使用时用1mL 吸管吸取0.1mL 红细胞，然后加入9.9mL 的生理盐水，此即1%红细胞悬液。
4.4 清洁液的制备
4.4.1 1%的稀硫酸溶液：水10kg，硫酸100mL，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌。
4.4.2 96 孔V 型板和微量滴头清洁液的配制：重铬酸钾79g，水1000mL，硫酸100mL，将重铬酸
钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100mL，不断搅拌。
5. 操作步骤
5.1 血凝试验（HA）步骤
5.1.1 用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25μL。
5.1.2 用微量移液器吸取待测抗原25μL于第1 孔中并挤压6 次混合，后吸出25μL 至第2 孔，依次倍比稀释到第11 孔，弃去25μL。
5.1.3 微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL。
5.1.4 置于微量振荡器上振荡1min，室温静置30min 后观察结果。
5.1.5 结果判定：将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。
5.2 抗原校正
5.2.1 根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4 单位抗原。
5.2.2 首先用微量移液器向反应板的第2 孔至第6 孔加生理盐水25μL，第1 孔不加。
5.2.3 用微量移液器吸取4 单位抗原25μL分别加入第1 孔、第2 孔中，从第2 孔开始挤压6 次混合，后吸出25μL至第3 孔，依次倍比稀释到第5 孔，弃去25μL。
5.2.4 用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1～6 孔，每孔25μL。
5.2.5 置微量振荡器上振荡1min，室温静置30min 后观察结果。
5.2.6 结果观察：第1、2、3 孔为完全凝集，第4 孔红细胞为50%沉淀，第5 孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4 单位抗原准确，校正成立。
5.3 血凝抑制（HI）试验步骤
5.3.1 用微量移液器先加25μL生理盐水于各孔中。
5.3.2 用微量移液器吸取待检血清25μL置于第1 孔中，然后倍比稀释至第11 孔，弃去25μL。最后1 孔不稀释，为红细胞对照。
5.3.3 用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25μL。
5.3.4 置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置20min。
5.3.5 用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25μL。
5.3.6 置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置40min 后观察结果。
5.3.7 结果观察：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制试验滴度，以2 的
指数表示。
5.4 结果判定
“－”表示不凝集，红细胞沉积于管底，呈边缘整齐的圆盘状。“+”表示微量凝集。红细胞沉积于管底，呈边缘不清晰的圆盘状。“++”表示凝集，红细胞沉积于管底呈环状，四周有凝集的小块。“+++”大部凝集，红细胞呈颗粒状凝集，边缘不整齐，有下垂趋势。“++++”完全凝集，红细胞均匀铺于管底。以能完全阻止血球凝集（“－”）的血清最高稀释度为血凝抑制效价。5.5 试验用具处理
5.5.1 96 孔V 型反应板的清洗：新反应板可直接放入清洁液中浸泡24h，用过的反应板先用流水冲
净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24h 后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏
水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。
5.5.2 微量滴头的清洗：新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡
在清洁液中，最少浸泡24h，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，
甩干，放入恒温箱中烤干，备用。
5.5.3 吸管及积液槽的清洗：将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24h 后捞出，用流动水冲洗干
净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1～2h 后备用，玻璃制品可
高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干。
6. 注意事项
6.1 正确选用96 孔微量板，根据所用红血球不同来决定，鸡血球选用V 型板，豚鼠、人血球用U
型板。
6.2 红血球的浓度和4 个血凝单位的正确调制。
6.3 标准参比血清应包括疫苗株和代表株的。
6.4 孵育时间不宜过长，有些病毒的血凝现象因病毒游离而很快消失。
7. 问题向导
7.1 由于流感病毒不同亚型间有交叉反应，判定结果时应注意。如试验用4 种标准血清，待检病毒只能被甲3 抗血清抑制，抗体效价为80，其他血清皆不抑制，那么，该鉴定病毒为甲3 型流感病毒，HI 效价为80。如果7 待检病毒被甲3 抗血清抑制，效价40，甲1 抗血清抑制，效价320，其高出甲3 抗血清效价4 倍以上，故该待检病毒判定为甲1 型流感病毒。标准参照血清对分离物的抑制效价≥20 才可判断为阳性。若标准参照血清对分离物的抑制效价均<20，速将分离物送国家流感中心进一步鉴定。
7.2 鉴定未知病毒时对照应有红细胞、阴性血清对照、标准血清对照，HI 试验不适用于流感的早期诊断，但在不能分离病毒或病毒分离阴性时，检测病人的急性期和恢复期双份血清有助于近期感染的诊断，即如恢复期血清抗体效价（滴度）高于急性期血清抗体效价≥4倍确诊可成立。
起草人：陆鹭
起草时间：2010-3-18
酶联免疫吸附（ELISA）试验的标准操作规程（编号：002）
1. 目的
该SOP 是利用抗原抗体特异性结合的原理，将待检抗体/抗原和酶标抗原/抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原/抗体起反应。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，利用颜色反应放大反应效果从而定性或定量分析，从而使测定方法达到很高的敏感度。
2. 适用范围
该SOP 适用于测定抗原抗体的匹配程度，血清中的抗体滴度，利用已知抗体判定未知蛋白的生物学特性等。
3. 主要仪器
酶标仪、洗板机、酶联条、微量移液器
4. 试剂
0.05 M pH 9.6 碳酸盐缓冲液、0.15 M pH 7.4 PBST、稀释液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、底物反应液A、底物反应液B、终止液（2 M H2SO4）具体的制备步骤见附件。
5. 操作步骤
5.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）常规操作
5.1.1 将重组蛋白用包被缓冲液按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 稀释后，每孔加100μL，设两排平行孔和阴性对照孔，4℃过夜包被（12-18h）或37℃包被5h。
5.1.2 次日用封闭液37℃封闭1h，PBST 洗涤3 次，每次2min。
5.1.3 加入100μL 用稀释液1:1000 稀释的一抗，37℃温育30min，再用PBST 洗涤后，每次2min。
5.1.4 加入100μL1:1000 稀释的HRP 标记的二抗兔抗马IgG，37℃温育15min，洗涤后分别加入ELISA 显色A 液和B 液，各50μL，5min 后再加入50μL 终止液，最后测定其A450nm，以测定孔与阴性对照孔A450nm＞2.1 判为阳性。
5.2 其他模式酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤
5.2.1 双抗体夹心法
5.2.1.1 将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。
5.2.1.2 加入待检样品，使之与固相抗体充分接触，使得样品中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物，洗涤除去其他未结合的物质。
5.2.1.3 加入酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样品的量正相关。
5.2.1.4 加入底物，夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
5.2.2 双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。当样品中待测抗原浓度过高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。
5.2.3 间接法测抗体
5.2.3.1 将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
5.2.3.2 加入稀释的待检血清，其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤后固相载体上只留下特异性抗体。
5.2.3.3 加入酶标抗抗体，与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
5.2.3.4 加入底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体的量。
5.2.4 竞争法
5.2.4.1 将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤。
5.2.4.2 待测管中加入待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样
的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量，洗涤。
5.2.4.3 加入底物显色，参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
5.2.5 捕获法测IgM 抗体
5.2.5.1 将抗人IgM 抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM，洗涤。
5.2.5.2 加入稀释的血清标本，保温反应后血清中的IgM 抗体被固相抗体捕获，洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
5.2.5.3 加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性IgM 结合，洗涤。
5.2.5.4 加入针对特异性的酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合，洗涤。
5.2.5.5 加入底物显色，如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM 抗体存在，是为阳性反应。
6. 注意事项
6.1 封闭液每孔不能少于300μL，以充分封闭非特异性结合位点。
6.2 1×PBST 洗涤次数不得少于3 次，每次洗涤结束后应在吸水纸上拍干。
7. 问题向导
7.1 建立新的ELISA 方法时，需重新用矩阵法确定最佳抗原包被浓度、最适封闭液、最佳一抗浓度，最佳二抗浓度等条件。
7.2 应用亲和素－生物素系统在ELISA 中的应用时有多种形式。可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点暴露。另外，在常规ELISA 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
附：
1. 包被缓冲液
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸馏水至1000mL
溶解后每瓶50mL 分装，高压灭菌备用。
2. 洗涤缓冲液
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
加蒸馏水至1000ml
加热溶解后50mL 分装，高压灭菌备用。用前加Tween-20 至0.05％。
3. 稀释液
NaCl 2.1g
PEG6000 4g
加洗涤缓冲液至100ml
4. 封闭液
BSA 3g
加洗涤缓冲液至100mL
溶解后50mL 分装，－20℃保存备用。
5. 0.2M Na2HPO4
Na2HPO4·12H2O 7.16g
加蒸馏水至100mL
溶解后50mL 分装，高压灭菌备用。
6. 0.1 M 柠檬酸
柠檬酸·H2O 2.10g
加蒸馏水至100mL
溶解后50mL 分装，高压灭菌备用。
7. 0.1 M EDTA
EDTA 3.72g
加蒸馏水至100 mL
用NaOH 调pH 值8.0，加热溶解后每瓶50mL 分装，高压灭菌备用。
8. 底物反应液A
0.2M Na2HPO4 51.4 mL
0.1M 柠檬酸48.6 mL
30 % H2O2 67 L
用HCl 调pH 值5.0～5.4
9. 底物反应液B
TMB 50 mg
加无水乙醇（或DMSO） 5 mL
0.1M 柠檬酸 5 mL
0.1M EDTA 0.5 mL
加蒸馏水至100 mL
10. 终止液（2 M H2SO4）
蒸馏水178.3 mL，逐滴加入98％的浓硫酸21.7 mL
起草人：孟珊珊
起草时间：2010-3-18
聚合酶链式反应（PCR）的标准操作规程（编号：003）
1. 目的及适用范围
以DNA 的半保留复制机理为基础，利用温度控制DNA 的变性与复性，通过添加引物，DNA 聚合酶，dNTP 等完成特定基因的体外复制，已被广泛用于特定基因的体外扩增，是分子生物学研究的最重要技术之一。
2. 主要仪器
PCR 仪，掌型离心机
3. 试剂
DNA 聚合酶、dNTP 混合物、10×聚合酶Buffer、去离子水
4. 操作步骤
4.1 在无菌的0.2mL 离心管中按下列顺序加入试剂：
4.2 将混合物振荡混匀，于掌型离心机上轻微离心。
4.3 将反应管置于基因扩增仪模块中，按以下顺序开始扩增：
4.3.1 热变性94 ℃5min
4.3.2 变性94 ℃1min
4.3.3 退火温度及时间根据具体实验设定
4.3.4 延伸温度及时间根据具体实验设定
4.3.5 步骤4.3.2 至步骤4.3.4 循环进行，共29 个循环
4.3.6 延伸72 ℃10min
4.3.7 冷却4℃
5. 问题向导
5.1 PCR 产物的电泳检测时间
一般为48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚至消失而出现假阴性，不出现扩增条带。
5.2 PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备、引物的质量与特异性、酶的质量及PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，模板DNA 中含有杂质蛋白或聚合酶抑制物如酚，乙醇等都会影响PCR 反应效率。
引物：引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是影响PCR 效率的主要因素。引物应高浓度小量分装保存。反应体系中每条引物的浓度控制在10～100pmol 范围内，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
DNA 聚合酶：DNA 聚合酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
5.3 PCR 循环条件：PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
5.3.1 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃足以使模板DNA 变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步骤若不能使靶基因模板完全变性，就会导致PCR 失败。
5.3.2 退火温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，
还有靶基序列的长度。对于20 个核苷酸，G+C 含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm 值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)、复性温度=Tm 值-(5～10℃)
在Tm 值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR 反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
5.3.3 延伸温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性：70～80℃150 核苷酸/S/酶分子、70℃60 核苷酸/S/酶分子、55℃24 核苷酸/S/酶分子、高于90℃时，DNA 合成几乎不能进行。PCR 反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA 片段，延伸时间1min 是足够的。3～4kb 的靶序列需3～4min；扩增10Kb 需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
5.4 其它影响因素：
5.4.1 反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。或100μL，应用多大体积进行PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。
5.4.2 物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。
5.4.3 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。
5.5 假阳性的原因：
5.5.1 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增时，扩增出的PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
5.5.2 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进
枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引
物互补后，可扩增出PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR 方法来减轻或消除。
5.6 出现非特异性扩增带：
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：①引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。②Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。③酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶，减少dNTP的浓度，适当降低Mg2+浓度，增加模板量，减少循环次数。
起草人：高晟妍
起草时间：2010-3-18
引物设计的标准操作规程（编号：004）
1、软件使用
1.1 推荐软件：Primer Premier 5.0
1.2 优点：操作简单、显示各种参数改变和二聚体、异二聚体、发夹结构等。
1.3本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar；DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)。
1.4网上同类软件：Primer3、JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。http://210.7
2.11.60网站已引进并调试好这两种软件。
2、推荐操作
引物搜索：Primer Premier 5.0、引物评价：Oligo 6.22
3、引物设计的原则
首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再
次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需
要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错
误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，
如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：3.1 引物的长度一般为18-25bp，引物长度过长会导致延伸温度过高，从而影响DNA聚合酶的效率，上下游引物长度差别最好不要大于3bp。
3.2 引物最好在模板DNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。可在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
3.3 引物3′端不能选择A，最好选择T。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，
当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配
的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
3.4 引物的GC含量一般为40-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值以接近72℃为宜，上下游引物Tm值同样不应相差过大。
3.5 引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因
密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
3.6 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值）。
3.7 碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
3.8 Frq曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。
3.9 以公式(4×G/C + 2×A/T–5)计算Tm值，即退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度。4-6℃的差别似乎对PCR产量影响不大，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃。
3.10 DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。
3.11 向引物的5’端添加限制性酶切位点，因为位于DNA分子5’端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以，引物应当超出内切酶识别位点至少3个核苷酸。引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
4、引物设计注意事项
4.1 对特异性的标准掌握更严格一些，也比普通PCR引物设计时更优先考虑特异性。
4.2 Tm值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR 的热循环程序。选用Tm值稍高一些，甚至退火温度接近酶的最佳延伸温度的引物，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。
5、简并引物的设计
5.1 简并引物常用的几个方面：从已知蛋白到相关核酸分子的研究；用一组引物扩增一类分子。5.2 注意事项
5.2.1 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子。
5.2.2 充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。
5.2.3 引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。
5.2.4 在简并度高的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。
sop操作规程
威世半导体(西安)有限公司中国陕西省西安市西安高新开发区新型工业园信息大道20号文件号：SOP-9 修改号：文件名称：电气检修作业安全操作规程第7 页共8 页3.7.4 高处工作时应用带绳传递物料，不得上下抛掷。 3.7.5 顶棚内工作需要照明时，应用安全灯或手电筒照明，不准使用明火或一般照明。3．8 铅酸蓄电池使用保养注意事项3.8.1 搬运蓄电池，必须使用工具车平稳运送，不得多层放置，应轻拿轻放，不得在地面上拖动，应避免剧烈振动。 3.8.2 蓄电池支架必须牢固可靠，防止打滑倾覆。 3.8.3 紧固端子前，应首先检查端子确保无氧化、断裂、变形。固定螺栓螺母外观检查必须做到六方头部完好、螺纹无损坏。紧固前固定螺栓螺母必须涂抹“抗锈成”防腐润滑剂。 3.8.4 端子固定方向应以保证紧固工具不会碰撞其它端子为宜。 3.8.5 拆装、紧固蓄电池端子时，必须使用合适规格的套筒扳手或呆扳手，注意每次旋转角度不得大于60度，以防电极间短路。 3.8.6 各类连接线、工具、零件不得放置于蓄电池上，以防引起极间短路。3.8.7 端子紧固完毕后，应在其表面涂抹一薄层黄油以防止腐蚀。3.8.8 连接端子时必须注意极性，操作时首先连接正极电缆。 3.8.9 电池拆下时应先关闭浮充电源，静置1h以上再作业，拆下时应避免正负端子打火。 3.8.10 拆卸连接电缆后，必须用绝缘包布包扎电缆裸露铜线部分。保持电池外观清洁，注意及时擦去尘埃与电解液，尤其是接线端子及接线电缆.。注意检查液口栓排气孔是否堵塞。 3.8.11 定期检查液面，如低于低位线，请用蒸馏水或纯净水补注液至上水线，绝不可添加硫酸液。注液后的电池应及时使用，如长期不用，定期进行补充电。 3.8.12 新电池初注液后，应静放置20分钟如液面不下降，则可进行充电，若液位下降，应再次加注。 3.8.13 电池长时间连续放电导致亏电后，应该实施恒流充电。此时，应将液口栓打开排气。充电完毕后，逐渐减小充电电流再切断电源。充电后，电池应静放0.5h 后再将液口栓拧紧。
标准操作规程(SOP)基础知识
标准操作规程（SOP）基础知识 标准操作规程（SOP）是各种标准化管理认证和产品认证的重要内容，各行业都有SOP的要求。什么是SOP？简单的讲，SOP就是一套包罗万象的操作说明书大全。一套好SOP是确保产品或服务质量的必要条件。SOP不仅仅是一套技术性范本，它更重要的涵盖了管理思想、管理理念和管理手段。由于在成熟的行业，都有明确的管理规范和认证体系，因此其SOP的标准化和成熟性都比较高，编写SOP也有依据难度较低。由于目前还没有成熟的实验室管理和认证体系，因此，在检验工作中编写SOP会有些盲然。 首先，SOP具有行业特点，不同的行业都有不同的SOP。就检验工作而言，仪器有仪器的SOP，试剂有试剂的SOP，各个项目有各自不同的SOP，别说是细菌、生化免疫这些学科不同的有不同的SOP，就是同一学科内不同项目也有不同的SOP。所以检验SOP不是一个，而一套。 第二，SOP事无巨细，也就是说只要与项目有关，要详细全面，要包括所有的可能出现的细节。以飞行员操作规程为例，第一条竞然是“坐下”，由此可以看出，SOP涵盖细节程度。SOP不是简单的操作说明，而应该是实用操作大全，应该成为工具书性质的东西。一套理想的SOP 应该让一个不懂的学了后就能成为专家。 第三，SOP不是仅仅是详尽的操作说明，它是管理规范的一部分，也包涵着质量控制和管理理念，从中甚至可以看到人员配置等情况。 虽然不同的行业SOP的具体内容是不同的，但是其是有确实的逻辑联系，因此借鉴其他行业特别相近行业的SOP要求是很有价值的。以药品生产SOP为例，其要求是GMP认证所要求的，根据GMP，其SOP的重点见附。 借鉴药品的SOP的重点，检验SOP应该包涵： 1、操作程序：实验和仪器的操作程序、实验器械的取用和实验后的处理、实验台的清洗、实验物溢漏的处理等 2、质量控制：实验和仪器的质量监控，如实验质控数量（高、中、低？），仪器的校正（人员、时间、方法等）、维护和保养、实验的原始记录等。实验原始记录很重要，发现问题和解决问题的重要手段，除病人资料外，还应有环境参数（天气情况、温湿度等）、使用仪器及仪器情况、样本性状和质量、试剂厂商及批号、同批质控结果以及处理方式（如复查、重抽、发报告）等，尽量详尽。 3、异常结果判断及处理：判断异常结果的指标，及分析处理原因方当及程序。如，是异常给果，还是实验误差或错误？怎么判断？样本正常范围是多少？非正常范围的标本如果处理，大于多少或小于多少复查或与临床联系？ 4、流程：应包括样本收发、报告单收发审核、质量和仪器问题处理等
人员培训标准操作规程SOP
人员培训标准操作规程SOP 一、目的；建立人员培训标准操作规程，确保培训规范的执行，提高全体员工素质。 二、适用范围：适用于全体员工的培训管理。 三、责任者：综合管理部。 四、管理制度： 1 培训的基本原则： 1.1 各级管理人员，生产、检验以及与生产活动有关的维修、清洁、仓储、 服务等人员，均应按《保健食品良好生产规范》（以下简称《规范》）的原则和各自的职责要求接受培训教育。 1.2 培训教育方案应根据不同培训对象的要求分别制订。教材要深入浅出， 注重普及与提高，理论与实践相结合。 1.3 培训教育工作要制度化、规范化。个人培训记录要归档保存，培训效 果要定期考核、评比。 1.4 培训教育部门在编制企业教育规划及计划时，应将《规范》培训教育纳入计划，配备一定的任教人员，且任教人员的知识应不断提高更新，提高培训质量。 2 培训的基本内容：根据培训的对象确定培训教育的内容，制定教育方案及培训教育达到的目的和要求。培训教育的基本内容包括有关法规、规定、制度的培训，包括《保健食品良好生产规范》、企业规章制度、工艺规程及岗位操作法等。 3 培训的对象：培训对象是公司负责人、质量、生产制造等部门的负责人和从事生产、质量、销售、设备等部门的技术人员和管理人员及生产操作工人。 4培训的目的与要求： 通过培训使全体员工意识到保健品的生产、经营等各个方面都已进入法制化的阶段。 4.2 保健品是特殊商品，保健品质量关系着人的健康，全体员工要确立质量第一的原则。 4.3 使各级负责人具有相应的管理知识，懂得实施《规范》的意义和内容， 掌握实施《规范》的有关知识、方法和评价的基本原则。 4.4 使全体员工掌握企业的规章制度。 4.5 技术、管理人员进行专业知识和管理知识的培训，使其在各自的岗位上， 认真实施《规范》所规定的本岗位职责及活动内容。 4.6检验及操作人员进行全面的《规范》学习及保健品检验专业知识的培训 和本岗位的操作规程、工艺流程、岗位责任制的学习，使其了解本岗位
标准操作规程(SOP)
标准操作规程（SOP） （一）申请程序 1、申请的提出 （1）由申办者向伦理委员会提出伦理审查申请，填写《提请伦理审查申请书》，按要求准备申请材料。 （2）伦理委员会秘书负责申请材料的受理工作，并初查提交的材料是否符合伦理委员会要求。 2、申请文件 （1）伦理审查申请表； （2）临床研究批准文件； （3）申办方资质文件； （4）临床研究方案（注明版本号）及其摘要； （5）研究病历、病例报告表、受试者日记卡和其他问卷表； （6）知情同意书（注明版本号）； （7）主要研究者履历； （8）其他（如受试者招募启示等）。 3、申请的受理 （1）秘书确认申请材料符合要求、伦理委员会审查经费到位后，提请主任委员或受委托的副主任委员决定会议时间(从材料符合要求、经费到位之日起不超过15个工作日)。 （2）会议时间确定后由秘书负责向申办者发出《受理通知》。 （二）审查准备工作程序 1、秘书负责整理会议所需资料，并将审查材料于会议前3个工作日提交伦理委员会委员预审。 2、秘书负责预定会议地点，并将会议日程通知伦理委员会委员、申办者、主要研究者，必要时根据主任委员指示邀请独立顾问参会。 （三）审查程序
1、审查内容 伦理委员会在临床试验开始前要从保障受试者利益的角度严格对临床试验文件、规定进行审议，主要内容有： （1）研究方案及其附属文件 ①试验方案设计是否充分考虑了伦理原则，评价受试者在临床试验中预期风险、负担与受益的比例； ②受试者的纳入/排除标准； ③受试者退出的标准； ④不良事件的记录要求和严重不良事件的报告方法、处理措施、随访的方式、时间和转归；当受试者因参加临床试验而受到损害甚至发生死亡时的应急措施，给予的治疗和/或保险措施； ⑤暂停或中止试验的标准； ⑥临床试验的质量控制与保证； ⑦对试验方案提出的修正意见是否可接受； ⑧定期审查临床试验中受试者的风险程度。 （2）知情同意书及其取得过程 ①知情同意书应采用受试者或其法定代理人能理解的语言和文字； ②知情同意书中应告知试验目的、试验的过程与期限、检查操作、受试者预期可能的受益和风险，告知受试者可能被分配到试验的不同组别； ③必须使受试者了解，参加试验是自愿的，而且有权在试验的任何阶段随时退出试验而不会遭到歧视或报复，其医疗待遇与权益不会受到影响； ④参加试验及在试验中的个人资料均属保密。必要时，药品监督管理部门、伦理委员会或申办者，按规定可以查阅参加试验的受试者的资料；
SOP标准作业程序与作业指导书
SOP标准作业程序与作业指导书 标准作业程序与作业指导书 我常常在咨询或者辅导企业的时候有人问到：“如何才能够增强执行力”，这个问题并不难；其实一个人先有了想法，才会有看法、说法和做法，您必须让执行作业的人，知道自己的岗位职责需要做哪一些事情？那就是想法；做好的标准那就是看法；执行业务的人能够很清楚地说出来以上要做的事流程、步骤、注意事项等等以及标准那就是说法，进一步现场去执行做好，那就是做法，从想法、看法、说法到做法，一个主管部门到底如何培育与培训员工？需要那一些资料？培训？工具呢？如何做好绩效考核？怎样才能够完善呢？我在之前写的博客有提到任何一个部门体系建立都需要建立在五个方面：1、制度标准化（System Standardization）、2、专业手册化（Specialized handbook）、3、培训标准化（Training standardization）4、考核量化（Inspection quantification）5、完善工具化(Perfect tool)。 建立体系需要的两个基本的概念与技术，那就是标准作业程序SOP与作业指导书，这两个工具与技术很简单，但是很多人不想去彻底做好它，所以导致执行力弱或者低下，当然做好之后的培训更是重要，让我们先看看看怎么做，下一篇文章再告诉大家怎样来培训与怎么做好执行力的培训？ 标准作业程序SOP（Standard Operation Procedure） 什么是SOP（标准作业程序） 所谓SOP，是Standard Operation Procedure三个单词中首字母的大写，即标准作业程序，就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。 SOP的精髓，就是将细节进行量化，用更通俗的话来说，SOP就是对某一程序中的关键控制点进行细化和量化。 SOP的由来 在十八世纪或作坊手工业时代,制做一件成品往往工序很少,或分工很粗,甚至从头至尾是一个人完成的,其人员的培训是以学徒形式通过长时间学习与实践来实现的。随着工业革命的兴起,生产规模不断扩大，产品日益复杂,分工日益明细,品质成本急剧增高,各工序的管理日益困难。如果只是依靠口头传授操作方法,已无法控制制程品质。采用学徒形式培训已不能适应规模化的生产要求。因此,必须以作业指导书形式统一各工序的操作步骤及方法。 SOP的作用 1) 将企业积累下来的技术﹑经验,记录在标准文件中,以免因技术人员的流动而使技术流失; 2) 使操作人员经过短期培训,快速掌握较为先进合理的操作技术; 3) 根据作业标准,易于追查不良品产生之原因; 4) 树立良好的生产形象，取得客户信赖与满意。 5) 是贯彻ISO精神核心(说，写，做一致)之具体体现，实现
临床试验项目标准操作规程(SOP)
临床试验项目标准操作规程(SOP) 临床试验项目 标 准 操 作 规 程
临床研究流程图文件编码： 起草人：审核人： 执行日期：批准人： Ⅰ. 目的：建立临床试验的流程图，临床试验的SOP按此图制定。Ⅱ. 范围：适用于所有临床试验SOP。 Ⅲ. 规程 临床研究流程图
Ⅰ. 目的：为使项目管理人员有所参考，提高项目管理质量和效率，特撰写此总纲。 Ⅱ. 范围：医学部。 Ⅲ. 规程 1、项目管理的定义： 项目的管理者，在有限的资源约束下，运用系统的观点、方法和理论，对项目涉及的全部工作进行有效地管理。即对项目的全过程进行计划、组织、指挥、协调、控制和评价，以实现项目的目标。 2、项目管理的内容包括以下9个部分： 1、项目范围管理 是为了实现项目的目标，对项目的工作内容进行控制的管理过程。它包括范围的界定，范围的规划，范围的调整等。 2、项目时间管理 是为了确保项目最终的按时完成的一系列管理过程。它包括具体活动的界定，如：活动排序、时间估计、进度安排及时间控制等项工作。 3、项目成本管理 是为了保证完成项目的实际成本、费用不超过预算成本、费用的管理过程。它包括资源的配置，成本、费用的预算以及费用的控制等项工作。 4、项目质量管理 是为了确保项目达到客户所规定的质量要求所实施的一系列管理过程。它包括质量规划，质量控制和质量保证等。 5、项目人力资源管理 是为了保证所有项目关系人的能力和积极性都得到最有效地发挥和利用所做的一系列管理措施。它包括组织的规划、团队的建设、人员的选聘和项目的班子建设等一系列工作。 6、项目沟通管理 是为了确保项目的信息的合理收集和传输所需要实施的一系列措施，它包括沟通规划，信息传输和进度报告等。 7、项目风险管理 涉及项目可能遇到各种不确定因素。它包括风险识别，风险量化，制订对策和风险控制等。 8、项目采购管理
GMP标准操作规程(SOP)的制定方法
GMP标准操作规程(SOP)的制定方法 GMP软件系统主要包括生产管理、质量管理、技术管理、厂房设施和设备管理以及物料管理等五大系统。GMP软件系统构成按其性质可分为标准和记录两大部分，其中标准分技术标准、管理标准和工作标准，而标准操作规程(SOP)在软件系统中属于工作标准中的一类。因各国的GMP虽基本内容相似，但GMP并没有具体到每个企业应当如何做的地步，这就要求每个企业必需制定出各自实施规范的具体规定和要求，这些通常包括在标准操作规程内。因此，SOP是GMP规范中有关内容在某一特定企业的具体规定。 标准操作规程，其英文名称为standard operating procedures(SOP)，在制定GMP软件系统中是个关键和难点，因在一般GMP规范中只是叙述一种笼统条理性条文，如在《药品生产质量管理规范》(1992年修定)中第七章生产管理第五十二条指出：每一产品均应制定生产工艺规程和岗位操作规则；第五十三条指出生产工艺规程和岗位操作规则的制定和修改应履行起草、审查、批准程序，并不得任意改变。这里的岗位操作规则即指SOP，在实际工作中可操作性差。现根据一些参考文献以及自己的理解浅析SOP的制定方法，以供参考。 1SOP制定的一般原则 一个企业在实施GMP过程中应结合本企业的实际出发，开发出一套实施GMP规范的具体规定和具体要求。首先应制定标准操作规程的SOP，具体应由质量管理部门(QA)将SOP 进行分类，对照GMP要求列出必需制定的SOP并按部门进行分类，统一编号以便统一管理；确定制定SOP的程序，明确制定人、审核人、批准人权限；确定SOP的基本格式，一个企业最好做到基本格式一致；根据SOP分类不同确定编写基本内容的思路；确定SOP 的执行与修改程序。 2SOP的分类 2.1SOP分类的一般原则标准操作规程的具体内容除了生产管理规程外，还包括卫生管理规程、质量管理规程、设备管理规程以及物料管理规程等。一般地说，有一些SOP涉及到公司许多部门的共同活动，而与产品无关，如：如何进入生产区；厂房和设备的维修；清洁指令等。 而另一些SOP则专门适用于某一类产品，规定了这类产品的生产和质量管理活动，例如：鲎的采血规程；鲎细胞洗涤规程；TAL灌装规程；TAL灵敏度标定规程等。 另外，对于某些生产方法来说，有些产品之间有许多细节是相同的，因为批生产记录必须给出每一产品制造过程的详细指令，为了避免这种雷同，最好将这些重复内容包括在SOP内，这样，批生产记录中就常用参考号码的方式指明某一SOP，例如：安瓿的洗涤；高压蒸气灭菌操作；干热除热原操作等。 2.2制药企业SOP的基本分类一个企业参照GMP要制定SOP可以有所不同，但基本应包括如下类别： 2.2.1总则(企业共同必须遵守的SOP)。 2.2.2物料管理的基本SOP(原辅料、包装、成品、半成品的收货发货，物料、成品、半成品的标签、标记凭证的储存与使用)。 2.2.3工艺及生产操作的基本SOP(工艺单元操作、批号编制、工序管理)。 2.2.4质量控制与检查的基本SOP(取样、留样、检测的单元操作、监测检查)。
稳定性试验标准操作规程(SOP)
稳定性试验标准操作规程 1. 稳定性试验的内容： 1.1 加速破坏试验，预测样品的有效期； 1.2 样品在规定的保存条件下观察若干年限的检测结果。 2.稳定性试验的基本要求： 2.1 稳定性试验包括影响因素试验、加速试验和长期试验。 2.1.1 影响因素试验适用于原料药的考察，用1 批原料药进行； 2.1.2 加速试验和长期试验适用于原料药与药物制剂,要求用3 批供试品进行。 2.2 原料药供试品是一定规模生产的，供试品量相当于制剂稳定性实验所要求的批量，原料药合成工艺路线、方法、步骤应与大生产一致。药物制剂的供试品应是放大试验的产品，其处方与生产工艺应与大生产一致。 备注：原料药的初步有效期或复检期可基于中试规模的批号，如果①中试批号采用的生产方法和工艺路线是模拟用于商业生产规模的最终工艺；②原料药的质量代表了商业生产规模的物料。 2.3 供试品的质量标准应与各项基础研究及临床验证所使用的供试品质量标准一致。 2.4 加速试验与长期试验所用供试品的容器和包装材料及包装方式应与上市产品一致。 2.5 研究药物稳定性，要采用专属性强、准确、精密、灵活的药物分析方法和有关物质的检查方法，并对方法进行验证以保证药物稳定性试验结果的可靠性。在稳定性试验中，应重视有关物质的检查。 注：有关物质的检查，Namely：杂质的检测，包括异构体，确定的or未知的其他杂质，单杂，总杂等；及包括降解，络合，破坏产生的一系列物质。 稳定性重点考察项目（附件1） 原料药： 性状、熔点、含量、有关物质、吸湿性以及根据药品性质选定的考察项目题外话：除了主峰以及辅料或溶剂峰外都是杂质峰，有的是主成分的降解产物，有的是合成中未除尽的中间体或溶剂等，还有的就是制剂过程中带进来的，都要严格控制，尤其是注射剂等品种。
SOP标准操作规程
SOP标准操作规程 血清直接胆红质（货号：OSR6111，OSR6211） 实验原理： 胆红质是血色素分解代谢的最终产物。在肝脏中它与葡糖醛酸结合，结合形式通过胆汁分泌物排出循环系统。 直接胆红质的评估有助于肝功能紊乱的测定。与阻塞性黄疸有关的总胆红质的增加主要原因在于直接胆红质。在肝炎中，血清中的直接胆红质和间接胆红质都增加。在患有溶血性黄疸和新生儿黄疸的新生儿病人中，总胆红质增加主要原因在于间接胆红质。红细胞大量破坏，胆道阻塞，肝脏疾病及肝脏在摄取，结合和排泌胆红质方面先天性异常和生理缺陷等均可导致血中胆红质升高而引起黄疸1。 方法 奥林巴斯直接胆红质是由Van den Bergh和Mueller发展的改良的重氮法2。直接（结合）胆红质直接和一种重氮盐，3，5-二氯苯基重氮盐（DPD）在酸性介质中发生反应，生成重氮胆红质。血清中的直接胆红质和重氮胆红质的颜色变化成正比，在540/600nm进行测量。一个单独的血清空白被执行以消除内生血清的干扰1。 胆红素+3，5-二氯苯基重氮盐（BF）4-------------﹥重氮胆红质 标本： 病人准备：无特殊要求。 类型：血清或肝素A血浆，标本最好不要溶血，应避光保存，尽快进行测定。 标本稳定性：暴露在直接光照条件下，标本中的胆红质会在一个小时之内减少50%。在很好的避光保存的条件下，血清中的胆红质在2～8℃下可稳定3天，在-20℃稳定大约三个月1。 仪器与材料: 仪器：奥林巴斯640生化分析仪 材料：奥林巴斯640 直接胆红质 参与反应成份的最终浓度： 盐酸150mmol/L 3，5-二氯苯基重氮盐0.07 mmol/L 其中含有稳定剂，表面活性剂和保护剂。 注意：1. 此试剂为体外诊断用。 2. 警告！腐蚀剂！不要入口。避免和眼睛，皮肤或衣服接触。如果接触到，立即用大量的水冲洗受损害的部位15分钟。接触到眼睛或吞服，立即寻找医疗保护。 试验用试管的直径在12～16mm。 定标液：奥林巴斯胆红质定标液（Cat. No. DR0046） 试剂准备：奥林巴斯AU640的直接胆红质是即开即用的。无需特殊准备。 执行参数（性能参数）：以下数据是根据奥林巴斯640直接胆红质试剂已经建立的程序。 精密度：精密度的评估是根据NCCLS推荐的典型方法5，AU640批内精密度小于4%或SD ≤0.04，总精密度小于5%或SD≤0.07。用于分析的质控血清和数据处理符合以上的NCCLS 的规则。
化学品SOP化学品操作规程
化学品操作规程SOP 一.目的 使作业人员掌握化学品性质及安全（MSDS）、化学品设备CDM、阀门分流箱VMB、化学桶更换操作及应急反应措施，确保化学品房的正常工作及必要的安全保证，特制定本规程。 二.适用范围 本规程适用于本厂化学品设备作业全过程。 三.职责 1．运行巡检人员定时巡检抄表，并熟练掌握CDM控制屏及一些调压阀、流量计的使用与操作，巡检时一旦发现异常，立即通知化学房相关负责人。 2．维护人员（或化学品相关负责人）不仅要掌握CDM、VMB的熟练操作（包括送液、换桶操作），还应对化学品的MSDS非常熟悉，发生化学品泄漏时做出相应的处理。 四.操作 （一）供液操作 1. 首先确保供给工艺机台的液体是酸或碱，确保是满桶，确保抽风已开 （0.2KPa左右）；氮封压力满足：不大于0.1MPa；PRG压力：0.3MPa左右（NaOH、KOH、H2SO4的PRG压力在0.4MPa左右）；VRG压力：0.5Mpa左右； 2. 穿戴合适的PPE：C级防化服、乳胶手套、防化靴、防毒面具（俗称“猪鼻子”）；准备相应的吸收棉； 3. 检查CDM内应打开手动阀是否已经打开（PMV、SMV、FIV、FOV），应打开的气动阀其气动软管是否插上，应关闭的手动阀门是否已关，酸（碱）桶接头是否紧固、管路接头、阀门部件及其连接处有无松动、泄漏，并确认无误； 4．检查VMB管路是否良好，应打开手动阀门（包括进入VMB的主阀及其支路阀门）是否打开、应开气动阀门是否插上气动软管，并确认无误； 5．检查机台的应开手动阀或者气动阀是否打开并确认无误。
6. 一切准备就绪，检查完好，手戴乳胶手套按CDM柜上“Stand By”按钮，让一桶“准备供液”，另一桶“待机”，把供液操作调成自动模式，实现桶空自动切换，保证工艺机台的持续供液。 7. 通知工艺机台负责人所需化学品设备已待机，机台发出信号，CDM就开始自动供液； 8. 送液完成 （二）换桶操作 图示： 注：按下Stand by钮前需要进入报警记录画面恢复空桶报警。 在进行酸（碱）桶更换操作时，务必穿戴合适的PPE 语言描述： 1.当系统发出空桶报警并将空桶下线后，按下静音按钮（Mute钮）； 2.穿戴好PPE并准备相应工具 （1）需穿戴的PPE有：C级防化服、防毒面具、乳胶手套、防酸碱手 套、防化靴 （2）需准备的工具有：扳手、丁字形酸碱桶盖拆卸工具、吸收棉、夹 酸车或推酸车（200L桶用）、液压车（1000L桶用） 3.打开CDM们，拆卸酸桶接头并用吸酸棉将其包住放到Coupler盒子 内，盖上桶盖； 4.将空桶从设备中移出，记录空桶编号，将其放到空桶储存区域； 5.用液压车或者推酸车将新桶装入设备中，检查酸碱桶化学品名称是否 正确，记录新桶编号； 6.用扳手缓缓拆卸桶盖并连接好酸桶接头； 7.关闭CDM门；
GZPTS标准操作规程(SOP)
目的：建立GZPTS高速旋转式双出料压片机标准操作规程,规范操作行为。范围：适用于GZPTS高速旋转式双出料压片机的操作全过程。 责任人：操作工、维修人员。 内容： 1、操作前的准备： 1.1启动 接通主电源开关，打开安全锁，系统给电。PLC控制器的显示器进入“初始画面” 1.2参数检查 触摸“特权输入”按钮，检查机器各分系统是否正常，并调整好分系统工作参数。 1.3液压设定 根据冲头的直径的形状调定液压的压力。 1.4加料 料斗装填药粉之后按下左、右两侧的“加料单控”键，让加料器空转大约1分钟，使药粉充满加料器。 2、药片的生产 2.1初次压片一定要减少充填、减低压力。将送料器速度设置为最低速。 2.2点动，稍加压、调整重量调节装置，直至生产出坚固得足以拿起的压片。 2.3长按点动键，同时进行重量取样。并根据要求调整“片重增加”或“片重 减少”，直到机器两侧的压片重量正确并保持一致。 2.4调节预压力 设备处于“检修运行”时，打开玻璃门，调节上预压力轮手轮，顺时针
药片可采取减小主压增加预压的处理办法。 2.5启动主机 启动主机有两种方式：一种是点动方式即触摸“点动”按钮，主电机运转，同时加料器也工作，当释放按钮时，主电机和加料器停止工作：另一种方式是当触摸“运行”按钮时，机器就连续工作。 2.6主机停止 主机停止分为高速停止和降速停止。紧急状态下直接按动“停止”按钮，主机停止。在正常状态下，应慢慢降速停止。压力不大时，可不减载。压力大或停机时间较长时必须减载。 2.7主机运行 主机启动，待机器运行稳定PLC读数变化不大后，在“生产状态”画面，进入“参数设置”画面。根据PLC运算的结果进行参数的设置，需要设置的有“标准压力”、“标准偏差”、“最大压力”、“最小压力”。 设置的方法是：“标准压力”一定要接近PLC运算的“平均压力”；“标准偏差”一定要大于PLC运算的“平均偏差”；“最大压力”一定要大于PLC运算的“单冲最大压力”；“最小压力”一定要小于PLC运算的“单冲最小压力”；点击“自动”，设备将进入片重自动调整状态。保存设置的参数，以备以后的生产。自动状态下升速，物料浪费较少，一般适合新的贵重的物料。注意升速要缓慢，给机器一个自动调整的时间。 直接升速，升速较快物料浪费稍多。达到要求的速度后，检测药片的重量，并进行相应的调整。按着上述方法进行参数的设置，再进入自动运行状态。保存设置的参数。 3、模具的拆装 3.1上冲头的拆卸： 拧下上冲头挡板两个螺钉，取下上冲头挡板。即可拔出上冲头。 3.2下冲头的拆卸： 取下重量调整组件上面的下凸轮轨道护档板，松开两个固定手轮，水平取下重量调整组件。用手逆时针转动机器，向下拉动下冲头，即可以拆掉下冲头。 3.3中模的拆卸： 拧松模具螺钉，但不能超过中冲盘边缘。将模具顶出杆插入冲头导向孔。
临床实验标准操作规程SOP
目录 附件A06 标准操作规程（SOP）目录
SOP（Standard Operating Procedure）：为有效地实施和完成某一临床试验中每项工作所拟定的标准和详细的书面规程。 药物临床试验机构标准操作规程制订、修订及编码的操作规程 1、药物临床试验机构办公室指定人员起草或修订机构总的SOP。 2、起草人或修订人按照GCP的要求，根据医院的实际情况起草 或修订SOP。 3、药物临床试验机构办公室主任审核。 4、药物临床试验机构对SOP实行统一编码。 5、编码格式为：“JGSOP×××”，“JG”代表“机构”；“×××”为 顺序号。例如：“标准操作规程的制订，修订及编码操作规程”的编码为：JGSOP001。 6、SOP经专家小组讨论通过，由药物临床试验机构主任审核批准后 生效。 7、药物临床试验机构办公室对通过的SOP归档保存。 8、新的SOP通过后，旧的SOP同时废除，并统一由办公室回收。 10、药物临床试验机构办公室组织相关人员学习SOP。由药物临床试 验机构办公室监督SOP的实施。
各专业标准操作规程的制订、修订及编码的操作规程 1、药物临床试验机构专业科室指定人员起草或修订本专业的SOP。 2、起草人或修订人按照GCP的要求，根据本专业的实际情况起草或 修订SOP。 3、对SOP实行统一编码。 4、编码格式为：“YYSOP×××”，“YY”为本专业前两个字的汉语 拼音的第一个字母（大写）；“×××”为本专业SOP的顺序号。 例如：心血管专业的第一个SOP的编号为：“XXSOP001”。 5、SOP经本专业专家小组讨论通过，专业负责人审核，上报药物临 床试验机构主任批准后生效 6、归档保存（一份存本专业办公室，一份存医院机构办公室）。 7、新的SOP通过后，旧的SOP同时废除。 8、本专业组织相关人员学习SOP并组织实施。
标准操作规程的编制规程
标准操作规程的编制规程 Final approval draft on November 22, 2020
标准操作规程编制规程 1.目的：建立标准操作规程编制管理规程，规范标准操作规程的结构、内容、一般格式和编写方法。 2.范围：适用于本公司所有标准操作规程的编写管理。 3.职责：各部门负责人负责编制或指导编制本部门相应的SOP，并且负责培训。 4.内容： 4.1标准操作规程描述与实际操作有关的详细、具体工作，是文件体系的主要组成部分，主要有生产操作、检验操作、设备操作、设备维护保养、环境监测、质量监控、清洁和职责，用SOP表示。 4.2分类： 4.2.1生产操作SOP：描述产品制造过程中与各工序实际操作有关的详细具体的工作，在公司的文件体系中，这类文件主要由生产车间起草编写。 4.2.2检验操作SOP：描述原辅料、包装材料、工艺用水、中间产品、成品检验过程中有关的详细、具体的工作，这类文件主要由质量管理部、中心检验室起草编写。 4.2.3设备操作SOP：描述生产设备、检验仪器设备的使用方法和步骤、注意事项等，这类文件主要由设备工程部起草编写。 4.2.4设备维护保养SOP：描述生产、检验仪器设备的维护保养方法、程序，维护保养校验时间和频次、所使用的润滑剂等，由设备工程部起草编写。 4.2.5清洁SOP：描述各种设备设施、容器具的清洁方法和程序、所要达到的标准、间隔时间、使用的清洁剂或消毒剂，清洁工具的清洁方法和存放地点，以保证产品
生产和检验过程中不被污染或混淆，这类文件由实施部门起草编写。 4.3SOP编写原则 4.3.1所有设有记录与生产有关的制造、检验文件中的操作均以SOP的形式描述。 4.3.2对SOP的每一个步骤的表述应清晰、简明、准确，同时，要求文件形式完整，整个公司内部的SOP类文件必须保持一致性。 4.3.3SOP的编制人员必须是熟悉了解所描述程序的技术人员或管理人员，SOP编写完成后必须经各个相关部门或相关操作者讨论后，并经该部门负责人审核、经各主管副厂长批准后才能颁布执行。 4.4SOP的格式按《文件分类编号及编写格式管理规程》执行。 4.5SOP的编写：生产操作和清洁操作SOP应在此详细说明SOP的具体操作步骤、方法、技术指标、注意事项等，在具体编写时可根据具体情况把这一项分解成各具单元内容的若干小项，以便清楚地描述整个过程。检验操作SOP应说明所用仪器与用具、试剂、操作方法步骤、计算公式、允许偏差、结果判定、检验操作注意事项。 4.6SOP的审核和批准：每个SOP都要由本部门的部长审核，最后经公司主管该项工作的副厂长或厂长签字批准，以保证该文件符合国家法规和公司内部已经建立的制度和文件。 4.7SOP的管理：质量管理部负责全公司的SOP文件的管理，负责SOP的保存、分发和修订管理。当SOP中涉及到影响其正确使用的因素如：工艺操作和质量控制方法发生变更时，SOP要随着改变。否则，每两年更新一次。颁发部门即为SOP的管理部门。分发部门是指与本SOP的实施和管理有关的部门，这些部门将得到由颁发部门拷贝的正式复印件。
标准操作规程SOP基础知识
标准操作规程SOP 基础知识
标准操作规程（SOP）基础知识标准操作规程（SOP）是各种标准化管理认证和产品认证的重要内容，各行业都有SOP的要求。什么是SOP？简单的讲，SOP就是一套包罗万象的操作说明书大全。一套好SOP是确保产品或服务质量的必要条件。SOP不但仅是一套技术性范本，它更重要的涵盖了管理思想、管理理念和管理手段。由于在成熟的行业，都有明确的管理规范和认证体系，因此其SOP的标准化和成熟性都比较高，编写SOP也有依据难度较低。由于当前还没有成熟的实验室管理和认证体系，因此，在检验工作中编写SOP会有些盲然。首先，SOP具有行业特点，不同的行业都有不同的SOP。就检验工作而言，仪器有仪器的SOP，试剂有试剂的SOP，各个项目有各自不同的SOP，别说是细菌、生化免疫这些学科不同的有不同的SOP，就是同一学科内不同项目也有不同的SOP。因此检验SOP不是一个，而一套。第二，SOP事无巨细，也就是说只要与项目有关，要详细全面，要包括所有的可能出现的细节。以飞行员操作规程为例，第一条竞然是“坐下”，由此能够看出，SOP涵盖细节程度。SOP不是简单的操作说明，而应该是实用操作大全，应该成为工具书性质的东西。一套理想的SOP应该让一个不懂的学了后就能成为专家。第三，SOP不是仅仅是详尽的操作说明，它是管理规范的一部分，也包涵着质量控制和管理理念，从中甚至能够看到人员配置等情况。
虽然不同的行业SOP的具体内容是不同的，可是其是有确实的逻辑联系，因此借鉴其它行业特别相近行业的SOP要求是很有价值的。以药品生产SOP为例，其要求是GMP认证所要求的，根据GMP，其SOP的重点见附。借鉴药品的SOP的重点，检验SOP应该包涵：1、操作程序：实验和仪器的操作程序、实验器械的取用和实验后的处理、实验台的清洗、实验物溢漏的处理等2、质量控制：实验和仪器的质量监控，如实验质控数量（高、中、低？），仪器的校正（人员、时间、方法等）、维护和保养、实验的原始记录等。实验原始记录很重要，发现问题和解决问题的重要手段，除病人资料外，还应有环境参数（天气情况、温湿度等）、使用仪器及仪器情况、样本性状和质量、试剂厂商及批号、同批质控结果以及处理方式（如复查、重抽、发报告）等，尽量详尽。 3、异常结果判断及处理：判断异常结果的指标，及分析处理原因方当及程序。如，是异常给果，还是实验误差或错误？怎么判断？样本正常范围是多少？非正常范围的标本如果处理，大于多少或小于多少复查或与临床联系？ 4、流程：应包括样本收发、报告单收发审核、质量和仪器问题处理等都要有明确的流程规定。如谁收标本、谁发报告、多少时间收，多少时间发、向谁收、仪器故障的报养程序等等。 5、试剂和样品质量指标、验收及贮存：谁人进、谁人检、以什
标准操作规程(SOP)
戴安HPLC标准操作规程(SOP) 一、准备工作： 1、泵： A、流动相： ①、流动相是否充足：(主要是有机相或者是单一通道的缓冲盐体系)，一般应在所预计 的消耗量之上加150ml，以保证仪器运行过程中不会出现流动相短缺； ②、流动相是否新鲜：(主要是高纯水及缓冲盐流动相)，一般情况下一次制得的纯水或 缓冲盐流动相应在连续的24小时内使用完，如未使用完也应弃去不用，并重新配制新鲜的流动相。特殊情况至少应重新过滤并脱气。 B、柱塞清洗液：清洗液是否新鲜及匹配：对于常规的流动相(一般指不含盐或离子对等 添加剂的流动相)，配制50%甲醇作为清洗液，在连续不超过4天工作的情况下可以两周一换；若超过4天，则一周一换。对于含盐或其它添加剂的流动相，配制5%甲醇(或高纯水)作为清洗液，在连续使用时，应每日更换；中间如有较长时间不用，则应改为50%甲醇作为保存液，并在下次使用时，根据所使用的流动相配制适宜的清洗液。 *：若泵超过半个月以上不用，应将柱塞清洗溶剂管(蠕动泵下压部分)抽出，再下次使用时放回原位置，以保证清洗管道的正常使用。 C、溶剂管道： ①、管道中的气泡：在泵长期不用时，由于脱气机停止工作，流动相会重新溶剂环境中 的气体，而产生的气泡会对柱、泵及检测器产生不同程度的影响，因此要求在停泵后重新使用时应先观察A、B、C、D四溶剂管道进比例阀部分是否存在气泡，如无，在泵启动后等待5分钟后(脱气机自动脱气)，再启动泵流速；若有，则选择相应的通道(按泵面板上的相应字母并保持约3秒钟)，打开PURGE阀后，按面板上的PURGE键进行流动相自动脱气(可选择再次按键关闭，或等待5分钟后仪器自动停止)，完成后先关闭PURGE 阀，再启动泵流速。 ②、流动相快速替换：由于流动相通道有限，当在同一个通道中更换流动相时，应首先 打开PURGE阀，再按泵面板上的PURGE键进行快速溶剂替换(流动为6ml/min，持续5分钟)，完成后再关闭PURGE阀，按要求进行系统的过渡或平衡。 2、自动进样器： A、进样针排气：当自动进样器非连续使用时(间隔一天或以上)应在仪器启动前(尤其是 泵)先进行进样针排气。打开Chromeleon主程序后，点出Files，选择Browser，打开后，点击Dionex Temp.，选择Panle中的Dionex_LC，在右边的窗口中双击ASI100.pan文件打开后，点菜单Control拉至最低下点击，在Connect变绿后，选手Wash,settings更改Wash V olue为250、Dispense为50后，在R、B盘中放置甲醇，G盘中放置异丙醇，按Prime进行针排气，完成后即可。(对于面板中有设置的用户直接在自动进样器设置窗口中按针排气(Syringe Prime)即可。 B、进样针清洗：当连续使用中需要更换样品类型或流动相粘度较大时，应在每次进样 完成后进行针清洗。在Program编辑查看时，在结束时间命令前加WASH命令；如选择单瓶进样，则在进样完成后，按自动进样器选项中的Wash键进行清洗。 3、柱温箱：柱温箱应在打开电源且柱连接好后，及时设置为方法要求的温度。 4、检测器：为减少灯能量浪费，检测器应在样品准备完成后或基本完成时，且仪器系 统按要求流动相及流速平衡至少30分钟以上后打开，在完成自检20分钟以后方可开始样品的分析。 二、仪器平衡：
检验项目标准操作规程SOP
检验项目标准操作规程 S O P Newly compiled on November 23, 2020
检验项目标准操作规程（SOP） -1-检验标本的采集 一、标本的正确采集 标本采集必须符合 2个条件，即必须满足检测结果正确性的各项要求和检测结果必须 能真实地反映检验对象当前病情，避免干扰因素的存在。 二、标本的贮存 标本采集后尽快送至实验室，若不能及时送检，已采集的标本要按检验规定的贮存条 件，如室温、冰浴、温浴或防腐贮存，将标本直立置于稳定、干燥、避光、密闭的环境中， 避免振摇，以免标本遗洒或溶血影响检测结果。 三、标本的运送 必须保证运送后标本所分析的结果与刚采集标本后分析的结果一致。 四、标本的签收 临床工作人员从口才采集标本并将标本从临床运送到实验室及实验室人员接收临床标 本，均应按标准化要求进行，做到认真核对，包括标本来源、标本属性、检查项目、标本采 集和运送是否合乎要求等，标本送出人员和标本接收人员都要做认真的记录并签字存档。 五、标本的处理
1、实验室接收标本后应及时正确地予以处理，否则会影响检测结果的准确性。 2、如果取血后未尽快转送或分离血清、血浆，血清与血块簪时间接触可发生变化。 3、实验室接收标本后处理应注意事项： （1）、时间：实验室接收标本后应尽快予以分类和离心。①、促凝标本应尽早处理，可在采血5-15分钟后离心；②抗凝标本可采血后立即离心；③非抗凝（无促凝）标本采血30-60分钟后离心； ④抗凝全血标本（全血细胞分析、ESR等）不需要离心。 （2）、温度：一般标本为室温（最好是22-25℃）放置；冷藏标本（对温度依赖性分析物）应保持在2-8℃直到温度控制离心。 （3）、采血管放置：应管口（盖管塞）向上，保持垂直立位放置。（4）、采血管必须封口：管塞移去后会使血PH改变，影响检测结果， 封口可以减少污染、蒸发、喷洒和溢出等。 六、分析前的可变因素 1、生物因素：可引起所检测物质在体内的变化，此种变化与检测方法无关，分为可变的和固定的生物因素。 2、干扰因素：在收集和分析标本过程中，干扰因素常导致分析结果与被测物真实浓度不符。 七、标本采集的基本原则 遵照医嘱采集各种标本均应按医嘱执行。凡对检验申请单有疑问，应核实清楚后再执行。
Western blot 标准操作规程(SOP)
Western blot 标准操作规程(SOP) 关键词：western blot 聚丙烯酰胺分离胶积层胶电泳 目的：蛋白质的检测与分析 【原理】 一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA 和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western（西）印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。本法所需时间6小时或过夜。 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH 值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含 Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有 0.1％的SDS(Laemmli, 1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 【材料】 分离胶及积层溶液 水饱和异丁醇 1 X Tris·Cl/SDS, pH8.8