大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌检查法
Escherichia Coli Test Method
1.目的
建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。
2.范围
适用于大肠埃希菌检查的操作。
3.责任者
QC化验员。
4.程序：
4.1.简述
4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG 与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。
4.2.仪器、设备及用具
4.2.1. 无菌室
4.2.2. 净化工作台
4.2.3. 培养箱(36±1℃)
4.2.4. 高压蒸汽灭菌器
4.2.
5. 显微镜(1500X)
4.2.6. 微波炉
4.2.7. 恒温水浴（45±1℃）
4.2.8. 离心机(500～4000r/min)
4.2.9. 0.45μm±0.02μm薄膜及过滤器
4.2.10. 电冰箱
4.2.11. 匀浆仪
4.2.12. 366nm紫外灯
4.2.13. 玻璃器皿、器具
4.3.试液、指示液
4.3.1. 0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.2. 靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛
5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。
4.3.3. 甲基红指示液取甲基红0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。
4.3.4. V-P试液
α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。
氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。
4.3.
5. 革兰染色液
4.3.
5.1. 结晶紫染液取结晶紫1.0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。
4.3.
5.2. 革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。
4.3.
5.3. 脱色液95％乙醇
4.3.
5.4. 沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，
将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。
4.3.6. 亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。
4.3.7. 溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6.0～7.6(黄→红)
4.3.8. 酸性品红指示液取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L 氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.0～7.4(黄→红)。
4.3.9. 曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。
4.3.10. 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.11. 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠2
5.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121℃灭菌20分钟。
4.3.13. 中性红指示液取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。变色范围
Ph6.8～8.0（红→黄）。
4.3.14. 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，加热使溶解，过滤。分装，灭菌。
4.4.培养基
4.4.1. 营养肉汤培养基
胨10g 氯化钠
5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水
1000ml
取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
4.4.2. 营养琼脂培养基
胨10g 氯化钠
5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水
1000ml
琼脂14.0g
取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
4.4.3. 胆盐乳糖培养基（BL）
胨20.0g 磷酸二氢钾 1.3g
乳糖 5.0g 牛胆盐2.0g
氯化钠5.0g （或去氧胆酸钠）(0.5g)
磷酸氢二钾 4.0g 水1000ml
除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，
灭菌。
4.4.4. 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1-β
-D-glu-curonide,MUG）培养基
胨10.0g 磷酸二氢钾（无水）0.9g
硫酸锰0.5mg 磷酸氢二钠（无水） 6.2g
硫酸锌0.5mg 亚硫酸钠40mg
硫酸镁0.1g 去氧胆酸钠 1.0g
氯化钠5.0g MUG 75mg
氯化钙50mg 水1000ml
除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。
4.4.
5. 曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB）
营养琼脂培养基100ml 曙红钠指示液2ml
20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液 1.3-1.6ml
取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。
4.4.6. 麦康凯琼脂培养基（MacC）
胨20.0g 1%中性红指示液3ml
乳糖10.0g 琼脂14.0g
牛胆盐5.0g 水1000ml
氯化钠5.0g
除乳糖1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，
调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。
4.4.7. 蛋白胨水培养基
胰蛋白胨10g
氯化钠5g
水1000ml
取上述成分混合，加热溶化，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。
4.4.8. 磷酸盐葡萄糖胨水培养基
胨7g 磷酸氢二钾（K2HPO4）
2g
葡萄糖5g 水
1000ml
取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。
4.4.9. 枸橼酸盐培养基
氯化钠5g 枸橼酸钠（无水）2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g 溴麝香草酚蓝指示液20ml
磷酸氢二钾（K2HPO4）1g 琼脂
14g
硫酸二氢铵（NH4H2PO4）1g 水
1000ml
除指示液和琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热溶化，加入指示液，混匀。分装于小试管，灭菌，制成斜面。注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。
4.4.10. 乳糖培养基
胨20.0g 乳糖
10.0g
0.04%溴甲酚紫指示液25ml 水
1000ml
除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.2±0.2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml。灭菌。
5%乳糖培养基
胨0.2g
溴麝香草酚蓝指示液6ml
氯化钠0.2g 乳糖
5g
磷酸氢二钠0.2g 水
100ml
除乳糖和指示液外，混合各成分，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.4，加入乳糖/指示液，混合，分装于含小倒管的灭菌小试管中，115℃灭菌15min。
4.5.对照用菌液