分子生物学实验课件..
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取
一、实验目的
学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂
1、实验材料
大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp-
2、实验设备
恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅
3、试剂
酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素
三、实验步骤
液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：
蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）
酵母提取物(Yeast extraction) 0.5% （0.5g/100 ml）
氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）
PH 7.0
固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉
请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！
(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至
100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培
养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
(9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。
每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。
(10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml
50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。
(11)接种环蘸取菌液，密密划线。
(12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。
(13)一天后观察菌落。
四、思考题
(1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌
种的什么信息？
(2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完
毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？
(3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什
么不是正放呢？
(4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？
实验二碱裂解法小量提取质粒DNA
一实验目的
了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。
二实验原理
本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA的方法主要包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
三实验材料
转化质粒pUC19后经氨苄抗性筛选获得的E. coli DH5α系列菌株
四实验设备
微量取液器(100μl,1000μl)，台式高速离心机
五试剂
溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH 、1％SDS (临用前用0.4mol/L NaOH和2％SDS母液稀释)。
溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L
饱和酚、氯仿、TE缓冲液
六实验步骤
1. 用移液枪取1.5ml培养液放入1.5ml eppendorf管中，5000 rpm 5 min收集菌体；
2. 弃上清,将管倒置于吸水纸上尽量使液体流尽；
3. 菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中；
4. 按试剂配方配制溶液Ⅱ，加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和上下颠倒eppendorf管数次以混匀溶液(千万不要振荡，动作轻柔)；
5. 立即加入200μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口并温和颠倒离心管数次，混匀溶液，置冰浴中10分钟；
6. 12000 rpm离心10分钟；
7. 加入等体积的酚/氯仿(1:1)，颠倒混匀，12000 rpm 10分钟；
8. 小心吸取上清夜移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟；
9. 12000 rpm离心10分钟；
10. 弃上清, 将管倒置于吸水纸上使所有液体流出，加入200μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀。
11. 同步骤10，重复洗涤沉淀一次；
12. 弃去乙醇溶液，将管倒置于吸水纸上使液体流尽，室温或37℃下干燥；
13、将沉淀溶于5μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。最好在用酚/氯仿抽提一次后再用氯仿抽提一次，以去除残留的酚对质粒的后继实验，如酶切反应等的不良影响。
3. 沉淀DNA通常使用冰冷的无水乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇，但由于常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
4. 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性。
5．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：C
A.染色体DNA断成了碎片
B.染色体DNA分子量大，而不能释放
C.染色体变性后来不及复性
D.染色体未同蛋白质分开而沉淀
七思考题
1.溶液I中葡萄糖和EDTA各有什么作用？
答：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2. 溶液II为何必需即用即配？
答：NaOH溶液长时间配制存放会与空气中的CO2反应，降低PH值，影响对细胞的裂解作用。
3. 加入溶液II后作用时间不能长，需要快速加入溶液III中和碱性溶液。如果溶液II的作用时间过长或者
反应过于激烈会导致什么后果？
答：作用时间过长会使细菌的基因组DNA被打断，从而不能被彻底沉淀除去，影响质粒DNA的纯度。
4. 在变性蛋白质的过程中，为何必须注意不要将酚残留在上清液中？
答：残留的酚对核酸酶具有抑制作用，因而会影响后面质粒DNA的酶切反应。
5. 最后DNA沉淀可以溶解在双蒸水（ddH2O）中，但最好溶解于TE缓冲液中，为何？
答：由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl 系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
\实验三琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
一、实验目的：
学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，了解质粒DNA电泳条带的多态性
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,
形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快，开环与线状分子的泳动亦有差异，于是在电泳时会产生三个条带的现象。
三、试剂与仪器设备：
1. 质粒DNA
2. 琼脂糖
3. 6×载样buffer 0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油
4．50×TAE 电泳Buffer 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。
5．溴化乙锭(EB)溶液10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
6. DNA Marker：共6条带，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。上样6ul时750bp的带约为100ng，其余带约为50ng
7．各种国产移液器(10，20，100μl)
8．消毒的tips枪头
9．水平电泳槽和电泳仪
四、实验步骤
1、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1×TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
2、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间，将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入1×TAE缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样：取1μl DNA溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。质粒DNA加样完毕，选取一个未加样点样孔加入6ul DNA Marker。注意每加完一个样品要更换tip枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在5V/cm。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2～1cm时,停止电泳。
6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
7、观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。
[注意] EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
五、实验结果分析
质粒DNA电泳条带的形态。根据DNA marker分析质粒DNA溶液大致的浓度。
六、思考题
1、电泳时所加电压值如何确定?
答：可根据DNA大小来确定，越大的电压可低点，避免拖尾现象；越小的电压可适当大一点缩短电泳时间，避免时间过长DNA扩散导致条带模糊。
2、就你的理解，DNA marker的用途是什么?
答：分析DNA大小和浓度的依据。
3、电泳中用到两种buffer，各自的作用。
答：
上样缓冲液主要作用：
（1）螯合Mg 2＋，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。
（2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。
（3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp 的线状双链DNA相同。
电泳缓冲液的作用：
一是维持合适的pH；二是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移。此外，电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。
4、如果质粒DNA电泳条带只有一条，说明提取的质粒质量高还是低，为什么？
答：质量高。这说明产生只有超螺旋的正常质粒闭合环双链DNA。
实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备
一、实验目的
掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法
二、实验原理
1、感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发
生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在加入抗生素的培养基上形成菌落。
三、实验材料、设备及试剂
1、实验材料
前次实验中所复壮的大肠杆菌单菌落液体培养物
2、实验设备及器具
低速冷冻离心机、超净工作台、50 ml 离心管、10 ml刻度移液管、玻璃棒（三种器具均已经过灭菌处理）。
3、试剂及配置
0.1 M氯化钙溶液（配制：称取1.1g无水氯化钙，溶于90ml双蒸水中，定容至100 ml, 转移至试剂瓶中，121 ℃灭菌20 min，保存。
四、实验步骤
教师完成：
1.挑取实验一中平皿培养基上生长良好、外观呈圆形的单菌落，接种于实验一配好的LB液体培养基（试管装）中，37 ℃ 200rpm振荡培养14 h 。
2.按1：50-1：100的比例进行接种，例取1.5 ml 上述培养物转接在25 ml LB液体培养基中，37 ℃200rpm振荡培养2-3 h （菌液的OD600约为0.4－0.5）。
学生操作：
3.每小组（按实验一确定的4人组）领取一支离心管（已灭菌，不要随便打开），贴上自己的标签（铅笔写学号），按老师安排两个小组同步在超净工作台上工作，每个小组用10 ml的移液管（已灭菌）吸取10 ml菌液放入自己的离心管中，两个小组将离心管与盖子一起置天平上进行平衡，平衡后盖上盖子置于盛有冰块的盆中冰浴10分钟（时间可超过十分钟）。待满8管后送至离心机所在的实验室中，4000 rpm ，4 ℃,离心10 min 。
4.两小组同步在超净工作台上倾去上清液，用5 ml的移液管（已灭菌）量取5 ml预冷的氯化钙溶液加入离心管中，用手轻弹管壁将沉淀混匀,两小组间用氯化钙平衡，冰浴25 min（可延长）,待有8管后4000rpm，4 ℃,离心10 min。
5.在超净工作台上倾去上清液，用取液枪吸取1ml冰浴预冷的氯化钙溶液加入离心管中，轻弹管壁使细菌悬浮，制成感受态的细胞悬浮液，用取液枪转移至预冷的1.5ml eppendolf管中，按顺序摆放在离心管盒中，置－70 ℃保存。
注意：实验从第三步开始，整个实验过程都必须无菌操作！
五、思考题
1、用试剂瓶盛装的氯化钙在灭菌时应怎样操作？
分子生物学实验
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验课件复习过程
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 --- AmpMDH5α菌株：R，，大肠杆菌（E. coli） 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用 100ml量筒定容至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶 50ml固体LB培养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高0.1Mpa℃（121指示锅内温度升高至． 压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
分子生物学实验
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳 一、目的 掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。 二、原理 1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH 12.0- 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的 质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。 2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、实验材料、仪器、试剂 （1）菌种：大肠杆菌DH5α （2）分子生物学试剂 10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。 50×TAE电泳缓冲液: 24.2g Tris 5.71g 冰乙酸 10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
分子生物学实验复习题附答案(最新整理)
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
分子生物学课件整理朱玉贤
1、广义分子生物学：在分子水平上研究生命本质的科学，其研究对象是生物大分子的结构和功能。2 2、狭义分子生物学：即核酸（基因）的分子生物学，研究基因的结构和功能、复制、转录、翻译、表达调控、重组、修复等过程，以及其中涉及到与过程相关的蛋白质和 酶的结构与功能 3、基因：遗传信息的基本单位。编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息 的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(对以RNA作为遗传信息载体的 RNA病毒而言则是RNA序列)。 4、基因：基因是含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，包含产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 5、功能基因组学：是依附于对DNA序列的了解，应用基因组学的知识和工具去了解 影响发育和整个生物体的特定序列表达谱。 6、蛋白质组学：是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。 7、生物信息学：对DNA和蛋白质序列资料中各种类型信息进行识别、存储、分析、模拟和转输 8、蛋白质组：指的是由一个基因组表达的全部蛋白质 9、功能蛋白质组学：是指研究在特定时间、特定环境和实验条件下细胞内表达的全部蛋白质。 10、单细胞蛋白：也叫微生物蛋白，它是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微 生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。 11、基因组：指生物体或细胞一套完整单倍体的遗传物质总和。 12、C值：指生物单倍体基因组的全部DNA的含量，单位以pg或Mb表示。 13、C值矛盾：C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。 14、重叠基因：共有同一段DNA序列的两个或多个基因。 15、基因重叠：同一段核酸序列参与了不同基因编 码的现象。 16、单拷贝序列：单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次，因而复性速度很慢。单 拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。 17、低度重复序列：低度重复序列是指在基因组中含有2～10个拷贝的序列 18、中度重复序列：中度重复序列大致指在真核基因组中重复数十至数万（<105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。 19、高度重复序列：基因组中有数千个到几百万个拷贝的DNA序列。这些重复序列 的长度为6~200碱基对。
分子生物学实验-心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。 一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感分子生物学实验的"试炼"。 分子生物学实验心得体会 东强（生科01级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA的制备、PCR技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值。
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学实验课件..
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
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分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增
分子生物学试验基础知识
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学实验方法与步骤
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部