细胞工程实验总结
实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备
1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。
②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？
1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。
2）干粉培养基过滤除菌
（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）
认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。 2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。 3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。 4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。 5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。 7）立刻不锈钢过滤器过滤除菌，贴上标签，4℃保存备用。
灭菌方法：高压灭菌。
3）胰蛋白酶-EDTA消化液
①胰蛋白酶溶液配制：称取胰蛋白酶（1:250）粉末0.25g置烧杯中，溶于100mL PBS，搅拌混匀，置室温
4 小时并不断搅拌振荡，过滤除菌。（若配制400 mL则应称取1g胰蛋白酶）
灭菌方法：过滤除菌。
②EDTA 溶液配制：0.2g EDTA用400mL PBS溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶， 4℃冰箱保存。
灭菌方法：高压蒸汽灭菌。
胰蛋白酶与EDTA 按1：1混合后分装，4℃冰箱保存。
4）抗生素液
双抗（青霉素、链霉素）各1克，溶于100mL纯水，过滤除菌，分装，4℃冰箱保存。使用前1：100稀释。灭菌方法：过滤除菌。
3、简单介绍动物细胞培养实验室常用仪器的操作方法及注意事项。
操作方法：
2清洗1）新玻璃器皿的清洗2）使用过的玻璃器皿的清洗3）胶塞的处理
3 消毒1）物理消毒法 (2)干热灭菌 (4) 过滤除菌（5）煮沸消毒急2）化学消毒法
常用的消毒液有如下几种：
(1) 70％(或75％)酒精 (2) 0.1％新洁尔灭(3) 来苏儿水(煤酚皂溶液) (4) 0.5%过氧乙酸(5) 乳酸蒸气(6) 37%甲醛加高锰酸钾 (7)甲醛消毒方法
注意事项
1、清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10-15次。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。枪头和试管一定要用超声清洗处理后逐个清洗。
2、干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。
3、高压灭菌后器皿务必晾干或烘干。
4、牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂均不能高压。需要长期保存的血清必须储存于-20℃—-80℃低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。血清在冻入低温冰箱前，不要装得太满，必须预留一定体积空间，（其他溶液冻存也是如此）。一般厂商提供的血清无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤。血清解冻需采用逐步解冻法，切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀，使温度与成分均一，待全部溶解后再分装。
5、滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜，包好，经高压灭菌后才能使用。过滤前可用压进空气的办法测试过滤器是否完好，去除压力后针筒会反弹即为完好无损。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6、使用化学消毒法时，配制75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。
7、培养基过滤器过滤除菌注意事项：
(1) 细胞培养用水一般为三蒸水或超纯水，医药生产上一般为注射用水。 (2) 建议尽量选择与所用量相匹配的包装一次使用。
(3) 溶解干粉培养基时先加入终体积90%－95%的培养用水，添加剂加完后再定容。
(4) 如需添加的组分较多时，某一组分完全溶解后，再添加另一组分。
(5) 待培养基完全溶解后再加入碳酸氢钠。
(6) 所有成分完全溶解后，培养基应立即过滤或高压除菌。
(7)在过滤前，可将pH调至比所需值低0.1-0.2个单位。
(8) 在细胞培养过程中，建议不加或加少量的抗生素，如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低一些。
(9) 建议用1N HCl或1N NaOH来调节培养基的pH。
8、物品放进饭盒后要贴好标签，还需要用棉布或牛皮纸包好再贴上标签。在标签处包扎好。容器，包括装PBS的玻璃瓶，瓶口要拧松，不能紧，瓶口包扎牛皮纸，灭菌后立刻拧紧瓶盖，然后再取出，冷却后放入冰箱。注意检测标签是否脱落。
9、根据每个实验的要求，准备好所需物品，一并放入超净台内。实验器材准备的数量要大于实际使用数，瓶盖要大于瓶数。要配备至少三套器械（一套使用，一套备用，一套清洗灭菌），循环使用。
10、玻璃瓶、移液管要封闭包扎使用端，标记手持端。
实验二鸡胚胎成纤维细胞的原代培养
1、如何进行鸡胚胎成纤维细胞的原代培养。
实验进行前，准备好相关器材，无菌室及超净工作台以紫外灯照射灭菌30-60 分钟（溶液同时37℃预热），然后开启通风10 分钟后，才开始实验操作。实验用品以75% 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域酒精灯火焰旁进行。
1、取9-10日龄的鸡胚，用酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头尾、四肢及内脏；
2、胚体用含双抗PBS冲洗2-3次，切成1-2mm3的小块，然后转入容积适量大小的离心管；
3、按每个鸡胚加入大约5mL的胰酶消化液，在室温（或37℃）下消化10 min，吸管（或枪头）不停吹打；
4、加入含小牛血清培养液终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；
5、收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，1200转离心5 min；离心管用酒精擦拭后拿进超净台，拧开盖子后，管口过火焰两次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下过火焰两次；
6、细胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培养液重新悬浮；
7、以5×105个/mL的密度溶液3.4ml接种到培养瓶中（大约20-30mL细胞液/鸡胚0.6ml），观察细胞形态
37℃、5% CO2浓度、饱和湿度条件下培养。
8、经过1天的培养。
2、原代培养时如何从组织分离细胞?
收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，1200转离心5 min；离心管用酒精擦拭后拿进超净台，拧开盖子后，管口过火焰两次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下过火焰两次；
6、细胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培养液重新悬浮；
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。
实验三：培养细胞的形态观察及活率检测
1简述培养细胞的形态观察方法及注意事项。
(一)培养细胞的形态观察
1、将细胞培养瓶从二氧化碳培养箱中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。
2、打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。
3、调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、
形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是20X
(二) 观察细胞体外培养状况
细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：
A．首先要观察培养细胞是否污染（观察阳性对照样品）。主要观察培养液颜色的变化及混浊度。
B．观察培养基颜色变化及细胞是否生长。
C．如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。
D．观察完毕，可用台盼蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。
2、简述台盼兰染色和伊红染色检测细胞活率的原理及操作方法。
台盼兰染色原理：
由于培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞
一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。
伊红染色检测细胞活率的原理：
贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。
操作方法：
（四）台盼兰染色
1）配制0.2％(W/V)台盼兰水溶液（溶于PBS，加热使之完全溶解，用滤纸或纱布过滤除渣，装入瓶内室温保存），及4.25 %(W/V) Nacl溶液；
2）测定前，取4份0.2％台盼兰与1份盐水混合；
3）取台盼兰溶液，另入到等量细胞悬中(细胞浓度2-5×106细胞/ mL)混匀；
4）将细胞悬液加入血球计数板中，使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要
重新滴加。分别计数末染色的细胞数(活细胞)及染色的(死细胞)细胞数。细胞计数200
5）计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100 %。
（五）伊红Y染色
1）配制0.2％(W/V，溶于PBS)伊红Y水溶液；2）取0.1mL细胞液悬(细胞浓度2-5×106细胞/ mL)，加入等量伊红Y溶液混匀；3）2 min后将细胞悬液加入血球计数板中，镜检、计数。死细胞染成桃红色，
200
4）计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100％。
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。
放大的计数室
按下式进行细胞浓度的计数：
注① 4大格中的每一大格体积为0.1mm3。1mL=l，0000大格，因此，1大格细胞数×104=细胞数／mL。注②染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。
进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。
实验四：鸡胚胎成纤维细胞的传代培养
1、简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。
在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部（绘图），如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
1、完全培养基配制:DMEM液90％；小牛血清10％；双抗(1万单位／mL) 加至约100单位／mL；
2、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内；
3、从培养箱内取出细胞，取出细胞时要旋紧瓶盖，再在镜下观察细胞。用酒精棉球擦拭后放入超净台内；
4、在酒精灯旁打开瓶塞，在酒精灯上烧口消毒，吸出原培养液，然后用PBS清洗细胞2次，尽量除去残余的血清；
5、25 mL培养瓶中加入0.2 mL的消化液进行消化，以盖满细胞为宜，置于室温或放置于培养箱内，停留1-2min后，不停摇晃培养瓶。消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形，细胞之间不再连接成片为度；
6、吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；
7、收集细胞悬液，1200-1500转离心5 min，去上清；
8、用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活率和密度，以5×105个/mL密度（1：3）接种到培养瓶中，在瓶侧壁做好标记；
8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度；适当旋松瓶盖，于37℃、5% CO2浓度、饱和湿度条件下培养；
9、4小时后及第二天观察细胞生长情况。
图4-2 贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程
五、注意事项
1、严格无菌操作，作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开，不同液体不要共用吸管。
2、所有溶液最好37℃预热。
3、掌握好消化程度。
4、正确摆放使用的用具，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
2、细胞传代培养获得成功的关键要素是什么?
①在做传代细胞培养之前，将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，才能进行传代培养。
②传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。
实验二鸡胚胎成纤维细胞的原代培养
（大约20-30mL细胞液/鸡胚），观察细胞形态（绘图），
实验三：培养细胞的形态观察及活率检测
在观察时，最经常使用的是20X物镜（绘图）。
（观察阳性对照样品，（绘图））。细胞计数200个以上，（绘图）。
活细胞不着色，（绘图）。细胞计数200个以上。
实验四：鸡胚胎成纤维细胞的传代培养
观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部（绘图），
8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度（绘图）； 9、4小时后及第二天观察细胞生长情况（绘图）。
图4-2 贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程
啤酒发酵实验
实验目的：
1. 学习酵母菌种的扩大培养方法，为实验室啤酒发酵准备菌种。
实验原理：1在进行啤酒发酵之前，必须准备好足够量的发酵菌种。在啤酒发酵中，接种量一般应为麦芽汁量的10%，因此，要进行大规模的发酵，首先必须进行酵母菌种的扩大培养。扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母，另一方面是使酵母由最适生长温度（28℃）逐步适应为发酵温度（10℃）。
.2啤酒酿造包括麦芽粉碎、麦汁糖化、麦醪过滤、麦汁煮沸、麦汁冷却及啤酒发酵等几个过程。啤酒发酵是纯种发酵，必须先对空的发酵罐进行灭菌处理。
3.麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程。由于麦芽的价格相对较高，再加上发酵过程中需要较多的糖，
实验器材：恒温培养箱，生化培养箱，显微镜、粉碎机、糖化煮沸锅、过滤沉淀槽、发酵罐、制冷机、板式换热器、糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅、带冷却装置的发酵罐（50L，100L）、。
实验步骤：
一.啤酒酵母的扩大培养
28℃，2天
菌种扩大: 麦汁斜面菌种→麦汁平板——→镜检，挑单菌落3个，接种
50mL麦汁试管（或三角瓶）—20℃，2天→550mL麦汁三角瓶—15℃，2天→计数备用。
每天摇动3次每天摇动3次
1 培养基的制备
取协定法制备的麦芽汁滤液（约400 mL），加水定容至约600 mL，取50 mL装入250 mL三角瓶中，另550 mL至1000 mL三角瓶中，包上瓶口布后，0.05 Mpa灭菌30分钟。
2 菌种扩大培养
按上面流程进行菌种的扩大培养（斜面活化菌种由教师提供）。注意无菌操作。
五、注意事项：灭菌后的培养基会有不少沉淀，这不影响酵母菌的繁殖。若要减少沉淀，可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤。
二、小型啤酒酿造设备介绍及发酵罐的空消
1. 熟悉各项设备；
清洗各项设备；
在回旋沉淀槽、板式换热器、发酵罐中通入蒸汽，消毒30分钟。
待各项设备使用结束后，应及时进行清洗灭菌。
三、麦芽汁的制备
1.麦芽粉碎
用谷物粉碎机粉碎，使粗细比例控制在1：2.5，同时使表皮破而不碎。必要时可稍稍回潮后在粉碎。
2.糖化
采用浸出糖化法
实验台称600g麦芽加入3000ml水，分入四个烧杯中于水浴锅上加热，使水浴锅中的液面高于烧杯中的液面。
糖化流程：35~37℃，保温30min→50~52 ℃ 60min→65 ℃30min（碘液反应完全）→76~78 ℃送入漏斗中进行过滤。
3.麦汁过滤：
用4~6层纱布进行过滤，前1L滤液收集返回漏斗中重新过滤，其余正常过滤。
把糟用2L的70度的水冲洗出来，充分利用原料。
（过滤目的：尽快把麦汁和麦槽分开，以得到清凉和较高收率的麦汁，避免影响半成品麦芽汁的色香味。）4.麦汁煮沸：
收集全部滤液，加热煮沸后加入5g酒花，继续煮沸1~1.5h。其间要经常搅拌。
停火后，沿着锅壁顺着一个方向搅拌，锅底中间会出现沉淀物。静置，把热麦汁趁热缓缓倒入灭过菌的封口容器（大的带盖子的），尽量减少沉淀物进入。
目的：通常采用传统的间歇常压煮沸法。煮沸时间一般为70-90分钟。）
5.麦汁冷却。
在麦汁冷却到室温后加入啤酒酵母，这个过程容易染菌，须在酒精灯火焰保护下加入
6.设备清洗
由于麦芽汁营养丰富，各项设备及管阀件（包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器）使用完毕后，应及时用洗涤液和清水清洗，并蒸汽杀菌。
7.主发酵
10 ℃发酵5~6d。发酵结束制成嫩啤酒。观察主发酵过程中的变化，并且做好实验记录。
8.后发酵
装瓶后置于冰箱中发酵7d。
实验结果
（注：本资料素材和资料部分来自网络，供参考。请预览后才下载，期待你的好评与关注！）
细胞培养实验和Western Blot实验报告
细胞培养实验和Western Blot实验报告 姓名：张人龙学号：YX16100508115 专业：中医骨伤科学 实验一：细胞培养 1.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。 2.实验原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。 3.实验用品 3.1 材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞) 3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。 2.3 试剂含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。 4.实验方法 4.1 原代细胞培养 4.1.1 原理 细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
细胞生物学实验
1. 什么是细胞培养？ 细胞生物学实验 指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。 最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。 原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。 不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。 传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、293、Vero 等细胞。 2. 细胞的生长周期 游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。 贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。 潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。
对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。 停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。 3. 细胞生长所需要营养条件 细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。 基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。 血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？ 合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘
米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，
细胞生物学知识点总结
细胞生物学知识点总结 导读：细胞生物学知识点总结 细胞通讯的方式 （1）细胞通过分泌化学信号进行细胞间通讯，这是多细胞生物 普遍采用的通讯方式。 （2）细胞间接触依赖性的通讯，指细胞间直接接触，通过与质 膜结合的信号分子影响其它细胞。 （3）动物相邻细胞间形成间隙连接以及植物细胞间通过胞间连 丝使细胞间相互沟通，通过交换小分子来实现代谢耦联或电耦联。 细胞分泌化学信号可长距离或短距离发挥作用，其作用方式分为：（1）内分泌，由内分泌细胞分泌信号分子到血液中，通过血液 循环运送到体内各个部位，作用于靶细胞。 （2）旁分泌，细胞通过分泌局部化学介质到细胞外液中，经过 局部扩散作用于邻近靶细胞。在多细胞生物中调节发育的许多生长因子往往是通过旁分泌起作用的。此外，旁分泌方式对创伤或感染组织刺激细胞增殖以恢复功能也具有重要意义。 （3）自分泌，细胞对自身分泌的物质产生反应。自分泌信号常 存在于病理条件下，如肿细胞合成并释放生长因子刺激自身，导致肿瘤细胞的'持续增殖。 （4）通过化学突触传递神经信号，当神经元接受刺激后，神经 信号以动作电位的形式沿轴突快速传递至神经末梢，电压门控的Ca2+
通道将电信号转换为化学信号。 通过胞外信号介导的细胞通讯步骤 （1）产生信号的细胞合成并释放信号分子。 （2）运送信号分子至靶细胞。 （3）信号分子与靶细胞受体特异性结合并导致受体激活。 （4）活化受体启动胞内一种或多种信号转导途径。 （5）引发细胞功能、代谢或发育的改变。 （6）信号的解除并导致细胞反应终止。 核被膜所具有的功能 一方面，核被膜构成了核、质之间的天然选择性屏障，将细胞分成核与质两大结构与功能区域，使得DNA复制、RNA转录与加工在核内进行，而蛋白质翻译则局限在细胞质中。这样既避免了核质问彼此相互干扰，使细胞的生命活动秩序更加井然，同时还能保护核内的DNA分子免受损伤。 另一方面，核被膜调控细胞核内外的物质交换和信息交流。核被膜并不是完全封闭的，核质之间进行着频繁的物质交换与信息交流。这些物质交换与信息交流主要是通过核被膜上的核孔复合体进行的。 核被膜的结构组成及特点 （1）核被膜由内外两层平行但不连续的单位膜构成。面向核质的一层膜被称作内（层）核膜，而面向胞质的另一层膜称为外（层）核膜。两层膜厚度相同，约为7。5 nm。两层膜之间有20～40nm的
原代细胞培养实验(药理)
一.细胞培养的基本原理 细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。如心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%;而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95%以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程;用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象;还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。此外，还能节约研究费用。如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。 但细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。 二.细胞培养的基本设备与用品 (1)细胞培养的基本设备 细胞培养的基本设备有：CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。 (2)常用的实验用品 1.玻璃器皿 细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶[有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积(平方厘米)表示];培养皿(直径有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格);离心管(5毫升，10毫升);注射器(1毫升，5毫升等);用生理盐水瓶代替的贮存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它还有尖吸管和移液管，载玻片(厚度0.8～1.2毫米)，盖玻片(厚度0.12毫米)，贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管(1.5毫升，2毫升)等。
细胞生物学实验社会实践报告
建立一个动物细胞培养室与植物细胞培养室所需的条件与社会价值无菌环境是细胞离体培养的最基本条件，所以构建一个细胞培养室需要保证工作环境不受微生物和其他有害物质污染，并且干燥无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室。 一、基础实验室配置 ⑴消毒间：消毒间主要为了处理实验器材以及实验材料，营造一个无菌的试验环境，一般消毒间会配备超净实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉、酸缸等。 ⑵无菌操作间：一般由缓冲间和操作间两部分组成。缓冲间在外侧，多用于实验之前的准备，例如：更衣，准备实验材料，处理实验数据等，可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等。工作人员进入操作间一定要消毒并更衣。 （3）培养基配制间：主要用于配置细胞培养所用的培养基。主要包括冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。 （4）培养室：用于培养细胞，放置以接种的培养基等。为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺
设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。 （5）洗涤间：主要用于清洗实验之后的用具。除配置水槽外，还需配置洗液皿、落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等，有需求的还可以配置洗瓶机。 以上基础设施若实验室条件不够，可将消毒间，培养基配制间，洗涤间合并一起，但注意实验室卫生以及仪器摆放，房间要保持清洁，明亮。 二、辅助实验室 细胞学鉴定室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。 生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等。 温室：用于试管苗的锻炼和移植，为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。常用设备有：温室、弥雾装置、荫棚、移栽床、钵、盆、基质等（用于植物细胞培养室）。 实验器材汇总：
细胞工程实验报告
原理，实验步骤或实验方法，实验结果与分析，注意事项，实验感悟 实验一培养基母液的配制 一、实验目的 通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法 二、实验原理 配置培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配置，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配置即可。 三、实验材料、试剂和仪器设备 1.试剂 NH 4NO 3 ,KNO 3 ,KH 2 PO 4 , CaCl 2 ·2H 2 O ,MgSO 4 ·7H 2 O,FeSO 4 ·7H 2 O Na 2-EDTA,MnSO 4 ·4H 2 O,ZnSO 4 ·7H 2 O, , KI,CuSO 4 ·5H 2 O,CoCl 2 ·6H 2 O,肌醇，甘氨酸， 盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水NAA,6-BA 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml、1000ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。 四、实验步骤 1 大量元素母液的配制 先用量筒称量适当蒸馏水放入500ml烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取： NH 4NO 3 ,KNO 3 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 ·7H 2 O, CaCl 2 ·2H 2 O，待第一种化合物完全溶解后再 加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 2 微量元素母液的配制 按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO 4·4H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O H3BO3 , KI, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O，CuSO 4 ·5H 2 O, CoCl 2 ·6H 2 O,按制备母液I的方法逐个 溶解，转移至容量瓶中，然后定容至500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 3铁盐母液的制备
细胞生物学实验
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
实验报告-细胞原代培养实验
细胞生物学实验报告 实验三细胞原代培养 1引言 1.1 实验目的 1. 理解细胞原代培养原理。 2. 了解细胞原代培养的应用。 3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。 4. 巩固无菌操作技术。 1.2 实验原理 细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 2实验仪器、试剂及操作步骤 2.1 实验仪器 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒 （头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等 2.2 实验试剂 DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等 2.3 实验材料 动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚 2.4 实验步骤 A.鸡胚成纤维细胞的原代培养 1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。 2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。 3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。 4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。 5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋 壳。 6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。 7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。 8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。 9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。 10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组 织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。 11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在
细胞生物学复习总结
Chapter 2 Cell membrane 1.简述细胞膜的特性。 1）不对称性：细胞膜的两侧具有不同的组成，包括三种成分的不对称性和维持膜功能的方向性。 膜脂分布不对称：脂质双分子层两边组成不同； 膜蛋白不对称：膜蛋白不对称分布，膜蛋白的不同定向； 膜糖的不对称：膜糖分布朝向胞外。 2）膜的流动性：膜成分处于不断运动中，是保证膜功能的重要条件，包括膜脂流动性与膜蛋白流动性. 2.试述不同类型膜蛋白的特点。 1）膜内在蛋白： 部分或全部镶嵌在细胞膜中或内外两侧；以非极性、疏水性氨基酸与脂双分子层的非极性疏水区相互作用而结合在质膜上；分子中具有一个或多个富含疏水性氨基酸的疏水区，多呈α螺旋； 在膜上可单次穿膜或多次穿膜。 2）膜周边蛋白质： 分布于膜的外表面；通过非共价键与膜脂极性头部结合；通过与膜内在蛋白亲水部分相互作用间接与膜结合。 3.何为离子通道蛋白？在胞膜物质运输中该类蛋白有何作用？ 概念：大多都与离子的转运有关，通道蛋白也称为离子通道。 作用：具有离子选择性，只允许一定体积和电荷的离子通过； 转运速率高，离子通道转运离子的速率极快，比载体蛋白所介导的最快转运速率高1 000倍； 介导的物质跨膜运输是被动运输，使物质从高浓度向低浓度运输,不需要细胞提供能量. 4.举例说明离子泵在主动运输中的作用。 (答题要点：什么是离子泵，钠钾泵的组成及作用过程) 离子泵实际上就是膜上的一种ATP酶，实现离子或小分子逆浓度或电化学梯度的跨膜运动，是直接利用水解ATP提供能量的主动运输。 Na+-K+-ATP酶由大小两个亚基组成，大亚基是一个多次跨膜的膜整合蛋白，具有ATP酶活性，为催化亚单位。其中，大亚基在其胞质面有一个ATP结合点和三个高亲和的Na+结合点，在膜的外表面有两个高亲和K+结合点和一个K+结合点。 钠钾泵的作用是通过ATP驱动的泵构型改变来完成的。首先由Na+结合到胞质面的结合点，刺激ATP水解，使泵磷酸化，引起蛋白质构型改变，暴露Na+结合点面向细胞外，使Na+释放到细胞外；于此同时也将K+结合点朝向细胞外表面，结合胞外K+后引起泵去磷酸化，导致蛋白质的构型再次发生变化，将K+结合点朝向细胞质面，然后释放K+至胞质溶胶内，蛋白构型恢复原状。钠钾泵每秒钟可发生1000次构象变化，每个循环消耗1个ATP分子，泵出3个Na+和泵入2个K+。 5.试述细胞连接的主要类型及特点。 紧密连接：无间隙，点状对合结构。其作用是封闭细胞间隙：阻止物质从细胞之间通过，保证转运方向性。 锚定连接：粘着连接：带状、15-20nｍ缝隙、内有丝状物质.与微丝相连． 桥粒连接：纽扣状、胞质内侧圆盘型斑；中间纤维附着。 间隙连接：1.5-2nm间隙，中有规则排列的横颗粒；最普遍的细胞连接的方式。 6.试述细胞黏连分子的类型及特点。 类型：钙黏素，免疫球蛋白超家族，整合素，选择素。 1）钙粘素： 属同亲性依赖Ca2+的细胞粘连糖蛋白，介导依赖Ca2+的细胞粘着和从ECM到细胞质传递信号； 分类有，E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、P-钙黏蛋白； 钙黏素介导细胞间钙依赖同亲性粘着。钙黏素的细胞部分通过接头蛋白和肌动蛋白纤维相连。 2）免疫球蛋白超家族的CAM： 分子结构中具有与免疫球蛋白类似的结构域的CAM超家族；
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
细胞生物学部分总结
细胞生物学 1. 细胞生物学是从细胞的显微、亚显微、和分子三个水平对细胞的各种生命活动开展研的学科。 2. 细胞生物学发展的几个主要阶段：a细胞的发现与细胞学说的创立：细胞学说——一切生物，从单细胞生物到高等动物和植物均由细胞组成，细胞是生物形态结构和功能活动的基本单位。b光学显微镜下细胞的研究(19世纪中叶到20世纪初期）。C实验细胞学阶段（20世纪初期到20世纪中叶）——光镜+实验。D亚显微结构与分子水平的细胞生物学：1933年第一台电子显微镜。 3. 细胞：细胞是生命活动的基本单位1.细胞是构成有机体的基本单位2.细胞具有独立完整的代谢体系，是代谢与功能的基本单位3.细胞是有机体生长与发育的基本单位4细胞是遗传的基本单位，具有遗传的全能性5.没有细胞就没有完整的生命 4. 真核细胞的结构特点：1.脂质和蛋白质成分为基础的膜相结构体系——生物膜系统2.以核酸—蛋白质为主要成分的遗传信息表达体系——遗传信息表达系统 3.由特异蛋白质分子构成的细胞骨架体系——细胞骨架系统4.核糖体与细胞质溶胶。 5. 6. 内共生起源说：真核细胞是由原始厌氧菌的后代吞入了需氧菌逐步演化而来，进而使真核细胞能够在氧气充足的地球上生存下来。 7. 细胞膜：是包围在细胞质表面的一层薄膜，又称质膜。由脂类蛋白质糖类组成。 8. 骨骼肌收缩：1.动作电位的产生，每一肌纤维上都有神经分支分布，神经冲动是神经细胞向外释放乙酰胆碱，乙酰胆碱与细胞膜上受体结合，使肌细胞去极化并传至肌质网。2.Ca2+的释放，肌质网去极化后将钙离子释放到肌浆中。3.原肌球蛋白移位，在肌动蛋白细丝上，被原肌球蛋白占据的结合部位暴露出来，暴露的部位可与肌球蛋白分子头部结合。4.肌动蛋
(完整版)细胞生物学学习心得
细胞生物学学习体会 通过网络课程学习,有幸聆听到王金发教授对《细胞生物学》课程的讲授，使我不仅学到了细胞生物学专业新的知识与研究技术、方法,而且在教学方面也受益非浅。下面就我的学习谈一些体会。 一、全面学习了细胞生物学的专业知识 《细胞生物学》是一门包容量大、发展迅速的学科。内容涉及生物膜的结构与功能；内膜系统区室化形成及各种细胞器的结构与功能；细胞信号转导；细胞核、染色体以及基因表达；细胞骨架体系；细胞增殖及其调控；细胞分化、癌变及其调控；细胞的衰老与程序性死亡；细胞的起源与进化；细胞工程技术等多个方面。 (一)对细胞生物学的专业知识有了更深的认识。 1、细胞通讯方面 记得第一次听王老师的课就是讲授细胞的通讯，在多细胞生物中，细胞不是孤立存在的，而是生活在细胞社会中，它们必须协调一致，才能维持机体的正常生理机能，它们的协调是通过细胞通讯来完成的。细胞通讯是通过信号分子与受体的识别，从而在靶细胞内产生一系列反应的过程。信号分子有第一信使和第二信使之分，第二信使位于细胞内，由第一信使与受体识别后最先在胞内产生的，它主要与细胞内受体作用，所以受体也可分为表面受体和胞内受体。信号分子与受体的识别作用具有特异性。细胞信号传递所发生的反应有快速反应和慢速反应。快速反应是信号分子与受体作用后直接引起细胞内的一系列代谢反应；慢速反应则需要引起基因表达，再表现出各种代谢反应。细胞通讯过程是个复杂的过程，一个细胞的周围有上百种不同的信号分子，细胞要对这些信号分子进行分析，做出正确的反应。信号转换的研究在近年很热门，但进展缓慢，主要是因为信号转换的复杂性，不同信号的组合产生的效应是不一样的。 2、蛋白质的合成和分选机理 蛋白质的合成是在核糖体上，有两种合成体系，一种是在细胞质中游离的核糖体上，另一种是在膜旁核糖体上合成，它们合成的蛋白质将分布到不同的部
《细胞生物学与细胞工程实验》
细胞生物学与细胞工程实验 课程编号：2511240 英文名称：Cell Biology and Cell Engineering 课程负责人：王昌留 师资队伍：王昌留、黄玲、李清、曲明娟、孙振兴 适用专业：生物科学 开课学期：秋季学期 课程类型：专业基础必修课 实验课性质：独立设课/非独立设课 先修课程：植物学实验/2511110、动物学实验/2580070、生物化学实验/2501040 总学时：理论学时实践学时 36 课外学时 总学分：1 采用教材及参考书： 1. 安利国主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2004 2. 杨汉民主编：《细胞生物学实验》第二版，高等教育出版社，1997 3. 李志勇：《细胞工程》第一版，科学出版社，2003 4. 徐承水，党本元主编：《现代细胞生物学技术》，青岛海洋大学出版社，1995 5. 王金发主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2003 内容简介： 本课程是一门理论性和技术性都很强的课程，是在学生已修完生物学、生物化学、细胞遗传学、细胞生物学与细胞工程、微生物学、免疫学基础上而设立的，是生物科学专业的必修课程。 本课程既包括细胞生物学基础实验又包括细胞工程综合实验，是一门对实验仪器要求较高的课程。开设本课程的目的是使学生掌握细胞生物学与细胞工程实验设备的操作方法，具备观察和研究细胞结构、功能与生命活动的基本方法，学会发现问题和解决问题的基本技能，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。 本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。 本实验包括的实验项目包括：
《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
细胞生物学实验课知识点总结
细胞生物学实验课知识点总结 一.细胞基本结构（basic conformation of cells） 1.洋葱表皮细胞 ①实验材料：洋葱鳞片叶内表皮 ②步骤：撕取一层内表皮、展开置于载玻片上、滴加伊红染液、盖上盖玻片、吸取多余染液、观察 ③注意事项：盖玻片放置方法：将盖玻片一端以45度角接触载玻片，另一段缓缓放下（目的：使装片内的气泡尽可能少） 2.人口腔上皮细胞 ①实验步骤：滴加生理盐水于载玻片、牙签刮取口腔内壁、刮取物与生理盐水相混合、盖上盖玻片、滴加甲苯胺蓝、染色5min、洗去浮色（生理盐水）、观察 ②注意事项：刮取口腔：先用第一支牙签将口腔内壁的某一区域挂净，然后用另一支牙签在同一区域刮取口腔上皮； 3.血涂片 ①实验材料：新鲜蟾蜍血 ②实验步骤：滴加蟾蜍血细胞悬液、铺平液体、风干、观察 ③注意事项：制取血细胞悬液：先在试管内加入柠檬酸钠，然后加入新鲜鼠血液（采血方法：摘眼球法） 滴加与铺平液体：在载玻片上靠近一端边缘而不是正中央的部位滴加；用另一载玻片以45度角接触液体（确保接触后液体在第二块载玻片接触端的后侧，以免磨碎细胞）后向另一段一次性地、缓慢地平推以展开液体（切忌反复平推，以免磨碎细胞） 4.骨骼肌纤维
①实验材料：蟾蜍腿部肌纤维 ②实验步骤：取材、摘取肌束、展开置于载玻片上、滴加生理盐水、盖上盖玻片、观察 5.蟾蜍精子 ①实验材料：蟾蜍精子（睾丸） ②实验步骤：剪取睾丸、置于生理盐水中、剪碎睾丸、滴加精子混悬液、盖上盖玻片、观察 ③注意事项：蟾蜍睾丸位于下腹部 二.细胞器基本形态（basic shape and fine structure of organelles） 1.线粒体活体染色 ①染液：詹纳斯绿B是线粒体专一活性染色剂，呈碱性，具有脂溶性，能穿过细胞膜进入细胞，结合到线粒体内膜上，其上的细胞色素氧化酶可使詹纳斯绿保持氧化状态而呈蓝色 ②实验材料：洋葱鳞片叶内表皮 ③实验步骤：撕取一层内表皮、展开置于载玻片上、滴加一滴詹纳斯绿B、染色15min、盖上盖玻片、洗去浮色（生理盐水）、观察 三.细胞化学（cell chemistry） 1.多糖（淀粉） ①实验材料：马铃薯块茎切片 ②试剂：I-KI溶液 ③注意事项：马铃薯切片时刀片应单方向一次性切到底 ④结果：蓝紫色椭圆形颗粒 2.酸性蛋白与碱性蛋白 ①实验材料：新鲜蟾蜍血
细胞传代实验报告
细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可 以与 体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较 经济， 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞 分散 后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养， 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞：293细胞株 2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附：消化液配制方法： 称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存， 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4） 五、实验结果
细胞生物学实验
细胞培养基本理论 一细胞培养概述 细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。 组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。 特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。 器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。 特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后， 生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态. 细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞 贴壁型细胞形态比较 成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源 上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期 多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等