体内药物分析复习题..

一、简述与常规药物分析相比，体内药物分析有哪些特点。

体内药物分析，是一门新兴学科，是药物分析的重要分支，也是现代药学的创新、延伸和发展。体内药物分析旨在通过各种分析手段，了解药物在体内的数量与质量变化，获得药物动力学的各种参数、药物在体内的生物转化、代谢方式和途径等信息。与常规药物分析相比，体内药物分析有以下特点：

1、干扰杂质多，样品一般需经过分离、净化才能进行分析。

2、样品量少（ng/ml-ug/ml），不易重新获得，在测定前需要浓缩、富集。

3、药物浓度低，对分析方法的灵敏度和专属性要求高。

4、要求较快提供结果（临床用药监护，中毒解救等）

5、要有可以进行复杂样品分析的设备如GC-MS、HPLC等。

6、工作量大，测定数据的处理和结果的阐明不太容易。

二、简述常用生物样本的种类及采集、储存方式。简述生物样品测定前除蛋白质的原因及常用方法。

1、血液

采集：待药物在血液中分布均匀后取样，从静脉采血。

制备：血浆(plasma)：全血+抗凝剂（肝素等）—离心—上清液（淡黄色）血清(serum)：全血静置一段时间—离心—上清液（淡黄色）

全血(whole blood)：全血 + 抗凝剂（肝素等）—混合

储存：采血后即使分离，不超过2h，分离后置于冰箱或冷冻柜中保存；若不予先分离，血凝后冰冻保存；短期4℃，长期-20℃。

2、尿液：尿中药物以原型、代谢物或缀合物形式存在。

采集：自然排尿，常用涂蜡的一次性纸杯或玻璃杯

制备：尿液加入适当的防腐剂于储尿瓶

储存：主要成分是水、尿素、盐类，易长细菌，短期可置4℃冷藏或加防腐剂，若保存时间长则需冷冻（-20℃）保存。

3、唾液

采集：漱口15min后，用插入漏斗的试管收集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合唾液采集时间至少10min 制备：唾液除去泡沫部分—放置分层—离心—上清液。

制备：唾液出去泡沫部分—放置分层—离心—上清液

储存：4℃以下保存冷冻的样品测定时需解冻冷冻，最好一次性测定完毕，不要反复冷冻--解冻--冷冻--解冻，以免药物含量下降。

样品的贮存除了上述的冷冻贮存，还包括：

1、加稳定剂：酶抑制剂：NaF，四氢尿苷，三氯醋酸；

抗氧剂：维生素C 等

2、防腐剂、改变pH 值

尿样中可加入的防腐剂有：甲苯、氯仿等或加无机酸、碱等调节尿液pH 值。

除蛋白质的原因：

1、使结合型药物释放出来，以测定总浓度。

2、得到较“干净”的提取液，减少乳化。

3、消除对测定的干扰。

4、保护仪器，延长使用期限。

常用去蛋白质方法：

1、蛋白质沉淀法——生成不溶性盐或盐析和脱水作用。包括：加酸类、重金属盐、中性盐和能与水混溶的有机溶剂等，如：三氯乙酸、高氯酸、Cu2+、硫酸铵、甲醇、乙腈等。

2、组织酶消化法——蛋白水解酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等。

三、简述体内药物分析方法的确证的内容。阐述定量限与检测限的定

义及区别、表示方法。

分析方法的验证，就是对药品分析实验所采用的分析方法是否完全达到了预

期目的，或证明由分析方法误差而导致试验结果判断错误的概率是否在允许范围之内，而进行的科学证明。分析方法的验证以验证参数表示：

1、专属性（Specificity）：专属性是指在一些可能存在的组分如杂质、降解产

物、基质等的存在下，对被分析物质的准确可靠的测定。

2、准确性(Accuracy)：准确性指的是真实值或认可的参考值与测量值之间相近

程度。

3、精密度(Precision)：精密度指的是规定条件下对同一匀质样品多次取样进行

一系列检测结果的一致程度（离散程度）。精密度可以从三方面考虑：重复性、中间精密度、重现性。分析方法的精密度通常以测量法的变异性、标准偏差或变异系数来表达。

4、重复性(Repeatability)：重复性是指在同样的操作条件下较短时间间隔的

精密度，也称为日内差(Intra-assay precision)。

5、中间精密度(Intermediate Precision)：中间精密度指的是试验室内部条件

改变（如：不同天、不同分析测试者、不同仪器等）情况下的精密度。

6、重现性（Reproducibility ）：指不同试验室之间的精密度，常用于合作

试验研究(collaborative studies)中的方法学的标准化研究。

7、检测限度(Detection limit)：检测限度指的是样品中的被分析物质能够被检

测到的最低量，通常无需定量。

8、定量限度(Quantitation limit)：某种分析方法的定量限度是指具有合适准

确性和精密度的条件下，能够定量测定分析组分的最低限量。它是样品中含量低的化合物定量分析的参数，特别适用于杂质和（或）降解产物的测定。

9、线性(Linearity)：分析方法的线性是指所得检测结果与样品中被分析物的浓

度（含量）成比例关系的性能。

10、范围(Range)：析方法的范围是指在样品中被分析物的较高浓度(量)和较低

浓度(量)之间的区间、已证实区间内具有合适的准确性、精密度、线性。11、耐用性(Robustness)：分析方法的耐用性是指试验参数适当地发生细小改变

时，测量能力保持不受影响，可用于说明正常使用时的可靠性。

定量限：是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其结果应具有一定的准确度

和精密度。

检测限：是指分析方法在规定的实验条件下试样中被测物能够被检测出的最低量。

区别：定量限所规定的最低浓度应满足一定的精密度和准确度的要求。

定量限：信噪比3:1

检测限：信噪比10:1

四、简述基质效应产生的原因、影响、确认方法以及消除。

原因：标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响，引起基质效应的因素相当复杂，涉及实验的多个部分：仪器设计、试剂组成、方法原理，以及质控物、定标物和PT 材料的成分和处理技术。

与标准样品和QC 样品相比，生物样品在进行液相色谱-电喷雾电离-质谱法分析时，会产生明显的基质效应。

产生于生物样品中的内源性物质、代谢产物或一同服用的其它药物，因在色谱分析中与目标化合物分离不完全或未被检测到而进入质谱后产生基质效应。影响：基质效应会使分析物的测定值发生改变，数值或偏大或偏小。

而在生物样品（以血浆为例）中，引起基质效应的主要是磷脂、胆固醇等内源性物质。他们随同待测物从色谱柱上一起被洗脱出来，经离子源气化，进入质谱进行检测分析。而就在液滴气化、发生库伦爆炸变成小液滴直至产生气体离子的过程中，这些内源性的物质由于极性较大，会同待测物离子竞相竞争液滴表面，从而导致待测物的离子化效率降低或增强，引起响应降低或增高，这就产生所谓的基质抑制或基质增强效应

基质效应的确认方法：

1、标准曲线法

2、柱后灌注法

3、监控法

基质效应的消除：

1、选择合适的样品制备方法——最有效。

2、改善色谱分析条件

3、优化质谱分析条件

4、内标的选择

五、比较比色法、紫外法、荧光法的异同点。

1、比色法：以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。

2、紫外法：可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐射的吸收，而产生化合物的可见紫外吸收光谱。

3、荧光法：利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可进行定性或定量分析的方法。

相同点：1、都以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。

2、都属于光谱分析法，操作简便、快速。

3、定量方法采用标准曲线法和标准对照法。

不同点：1、光源：比色法使用的是混色光源，紫外法使用的是单色光源。

2、比色法使用的是色阶和人的眼睛，相对误差较大，紫外法和荧光法

使用的是仪器和光电检测器，相对误差较小

3、比色法主要是定性的，而紫外法和荧光法是定量、定性

4、本质：紫外法为吸收光谱；荧光法为发射光谱。

5、灵敏度：荧光法10-10-10-1；紫外法10-4-10-72；比色法较低

6、选择性：紫外和比色法一般；荧光高

7、应用：荧光法的应用没有紫外广。

六、紫外法具体有哪些方法？基本原理如何？

1、差示分光光度法

原理：利用被测物在两种不同溶液中吸收光谱发生了特征性变化，而共存干扰物

在该两种溶液中未引起光谱变化，测定两种溶液的吸收度差值（ΔA值），根据ΔA与被测物浓度C的线性关系进行定量测定。

应用条件：必须使被测物在两种溶液中以不同的化学形式存在，且两种化学形式的吸收光谱应有显著差异。根据被测物理化性质，可选择不同的处理方法，除酸、碱外，还可用缓冲液、氧化剂等。但应使被测物在一种溶液中以一种形式存在，光谱纯度不低于99%。

2、双波长法：主要用于二元混合物或浑浊样品的测定。

原理：在λ

测处：A

测

= A

样

＋A

杂

在λ

参处：A

参

=A’

样

＋A’

杂

⊿A = A

测—A

参

=（A

样

＋A

杂

）—（A’

样

＋A’

杂

）

因为：A

杂= A’

杂

所以：⊿A= A

样—A’

样

，与干扰物无关。

应用条件：

λ测——被测物吸收峰附近

λ参——干扰物在λ测处的等吸收点，即干扰物在此两波长处A值相等3、导数光谱法

原理：如果干扰吸收随波长呈线性时，可用直线方程表示 A

混=E

测

·C

测

·L＋a＋

bλ，对上述公式求导：dA

混/dλ=dE

测

/dλ·C

测

·L＋b，干扰物质的吸收由随波

长呈线性变成了常数。

对于非线性干扰，可近似地用二次曲线表示A=E·C·L+t+uλ+wλ2，对上式求二阶导数，可使杂质干扰的二阶曲线t+uλ+wλ2变成常数w，从而消除干扰。

应用条件：根据干扰物质的吸收光谱图形，选择导数阶数

七、免疫分析的基本原理、基本条件是什么？常用免疫分析有哪几种？相互间区别在哪些方面？

免疫分析的基本原理是抗原-抗体的结合反应，当抗原遇到其相应的特异抗体时产生一系列的抗原-抗体反应，形成抗原-抗体结合物。

基本条件：特异性抗体、标记抗原、未标记抗原（即标准品）。

常用免疫分析有：放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法。

区别：标记物不同，由此采用的方法也不同。

1、放射免疫分析是放射性同位素测定法与免疫反应基本原理相结合的一种同位

素分析技术。该法具有灵敏度高、特异性强、标记物容易制备以及放射性强度容易检测等优点, 特别适合复杂样品中微量或痕量物质的分析。

2、酶免疫分析的基本原理是在抗体或抗原分子上连接酶分子, 进行免疫反应,

免疫复合物上的酶将特定的底物转化为特定的颜色, 用分光光度计测定, 由颜色的深浅确定待测物的量, 其催化底物可与核素一样起到信息放大作用, 具有很高的灵敏度, 检测下限可达到ng甚至pg水平, 有效期大大超过了125 I 标记物, 而且能减少放射性废物。

3、化学发光免疫分析法：所需时间短、灵敏度高、线性范围宽、对环境无污染,

荧光免疫分析是以荧光物质作为标记物与待测药物结合, 所形成的荧光标记药物能与抗体发生免疫反应, 引起荧光强度发生变化的一种分析方法。

八、测定药物与蛋白质结合率的意义何在？测定时需注意什么问题？

药物血浆蛋白结合率一般是指在治疗量时药物结合的百分率，它是药物代谢动力学的重要参数之一，是新药临床评价不可缺少的指标。它影响药物在体内的分布、代谢与排泄，更重要的是它与药物的药理作用强度密切相关。血浆蛋白结合率高的药物，即使有高的血药浓度，而发挥作用的游离药物的浓度并不高，药理作用就不一定强。因此，若没有血浆蛋白结合方面的资料，就不可能评价血药浓度的真实意义。

影响药物血浆蛋白结合率的主要因素有：药物的化学结构，血浆蛋白含量高低，某些生理，病理因素，合并用药。物与血浆蛋白结合是疏松的和可逆的，按质量作用定律经常处于动态平衡状态。结合率可受药物浓度、并用其他药物以及病人的生理、病理而改变。因此，测定时需要注意以上问题。

九、简述生物利用度与生物等效性的概念和实验方法。

生物利用度（bioavailability，F）是指药物被机体吸收进入体循环的相对量和速率。

生物等效性（bioequivalency , BE ）是指一种药物的不同制剂在相同实验条件下，给予相同的剂量，其吸收速度与程度没有明显差别。

实验方法：

1、参数tm、Cm、AUC是三项基本参数。Tm用于评价吸收速度。Cm、AUC→F用

于评价程度，要测准AUC，需测定7t

1/2。

2、实验安排：受试者应随机分组，经健康检查，进行交叉实验消除个体差异，

数据才有可比性。

3、取样点间隔和数量：预试验大概求出峰值，再设计取样时间

4、分析体液的选择：血液最常用，k尿液：取样容易，但不可能获得吸收瞬

时速度，且尿中常含大量代谢产物，所以药物主要以原形从尿排出者才适用。否则若线性代谢可测代谢物，另外还有唾液。

5、研究对象人体实验结果是最权威的资料，新药审批要求人，18-24例，但

也常用动物狗、猴、猪较接近人，家兔消化道生理与人相差大。

十、简述半衰期、表观分布容积、清除率、药-时曲线、AUC、稳态血药浓度、生物利用度的概念和含义。

消除半衰期:血药浓度下降一半所需时间，是决定给药间隔时间的重要参数之一。表观分布容积（Vd）:是指血药浓度与体内药物量间的一个比值，Vd=A/C=体内药

量/血药浓度。可反映药物分布的广泛程度或药物与组织结

合的程度。

清除率(Cl):即单位时间内多少容积血浆中的药物被消除干净。

药-时效曲线:以横座标为给药后时间，纵坐标为药物效应，则药后产生的药效随时间的变化的关系（时效关系）绘制出的曲线。

AUC:代表药物的生物利用度（药物活性成分从制剂释放吸收进入全身循环的程度和速度）,AUC大则生物利用度高，反之则低。

稳态血药浓度:药物在连续恒速给药（如静脉输注）或分次恒量给药的过程中，血药浓度会逐渐增高，经4～5个半衰期可达稳定而有效的

血药浓度，此时药物吸收速度与消除速度达到平衡，血药浓

度相对稳定在一定水平，这时的血药浓度称为稳态血药浓度，

也称坪值。

生物利用度：药物吸收速度与程度的一种量度。可药时曲线下面积AUC计算。