分子生物学考试(附答案版)

2019-2020学年第一学期分子生物学工作基础考题

一、（18分）

1、（3分）RT-PCR的基本原理是什么？

2、（3分）为了防止PCR产物突变，宜选用哪种耐热聚合酶？

3、(2分) 决定退火温度的因素是什么？

4、(3分)列举3种提高PCR特异性的方法（热启动、递减扩增、巢式PCR、佐剂的使用等）；

5、（5分）根据所给的DNA序列设计20bp的上下游引物。

二、（5分）鉴别CDNA产物中是否混杂有基因组DNA污染时，引物应设计在什么位置？

三、（10分）已经CDNA的部分序列，如何获得全长CDNA片段？

四、（10分）根据所给的质粒的图，列举5个描述质粒特性的用语并简要说明。（大概就是：amp r、ori、lacZ、MCS、T-载体、分子量小-3050bp、环状等）

五、（15分）MS-PCR的引物设计

六、（8分）简要比较Southern blotting 与Northern blotting的异同

七、（24分）王博士发现了P66基因可能与P88 蛋白之间有相互作用，P88与cyclinD1有相互作用等等：

（1）如何证明P66与P88之间的相互作用？

（2）如何证明P66对cyclinD1的转录有影响？

（3）如何证明P66与cyclinD1之间的功能联系及P66是通过P88对cyclinD1起作用？

（大概就是蛋白质之间的相互作用、蛋白质与DNA之间的相互作用、基因功能分析及蛋白质通路概念等几部分；其中蛋白质通路概念大概内容如下：蛋白质通路概念A-B-C ：A存在，B沉默，C不出现；外源加入B，C出现；A不存在，BC存在，A蛋白功能表达。）

八、（10分）用自己的话简单描述什么是“表观遗传学”？什么时“组蛋白密码”？研究它们的意义是什么？

一．⑴．要扩增下面一段序列，请设计出其上游和下游的引物。

gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcatttgggg gctcgtccgg gatcgggaga cccctgccca gggaccaccg acccaccacc gggaggtaag ctggccagca acttatctgt

gtctgtccga ttgtctagtg tctatgactg attttatgcg cctgcgtcgg tactagttag

要点：

原则：正向引物照抄反向则反向互补数量15~25不等，但保证tm值均在55度左右近似公式： tm=4*（G+C）+2*（A+T）

我在primer premier 中设计的引物如下供参考

f: GCGCCAGTCCTCCGA tm：55.3

r： CTAACTAGTACCGACGCAGG tm：55

另外还需考虑因素：引物与基因组其他基因是否有同源性？

引物自身及互相会不会有错配会不会形成二级结构会不会形成错配

是否需要在5’端设计酶切位点及保护碱基

⑵．请给出三个提高PCR特异性的方法。

要点： 1 热启动

2 Touchdown

3 巢式PCR（nest）

4 适当提高退火温度控制延伸时间控制循环数控制酶、引物、Mg2+等相对用量

二．要用RT-PCR扩增一段mRNA，请设计一种用于RT-PCR的引物来避免基因组DNA的污染，并简要说明原理。该段序列的基因组DNA序列的结构如下：

内含子

外显子

要点：上下游引物跨越内含子其他同一般引物设计原则

因为基因组DNA由于含有内含子扩增出来的片段会大于直接用cDNA扩增出的片段，抑或是由于片段太大，延伸时间不够无法扩增出来。

附：其他减少DNA污染的方法

1. 使用无污染技术减少污染如用 Trizol提取RNA 扩增级DNaseⅠ处理RNA

2. 使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染

三．下图给出了一段DNA序列和其酶切位点：

BamHI SalI MspI

5’-ATCG GGATCC ACTT GTCGAC ACCAAGC CCGG-3’

3’-TAGC CCTAGG TGAA CAGCTG TGGTTCG GGCC-5’

请设计两种实验方法用放射性核素标记该段序列的上游末端。(1、简要说明原理。

2、说明所用的酶。

3、说明所用的放射性标记的位置。）

附：

Enzyme Freq Position(s)

BamHI 1 : 5

v :

G GA TC C :

C CTAG G :

^ :

MspI 1 : 28

v :

C CG G :

G GC C :

^ :

SalI 1 : 15

v :

G TCGA C :

C AGCT G :

^ :

1 碱性磷酸酶处理 T4多聚核苷酸激酶+γ-32p-ATP 标记5’末端

2.酶切 Klenow+dNTP(- α～32P-dNTP) 标记3’末端

四．请简要说明定位克隆和同一酶切克隆有什么不同？

要点：方向性问题双酶切位点设计自身环化问题

五.现有一个pCAT质粒和一段带有p21Promotor的DNA 序列。请设计一个试验来证明P53蛋白是否能够通过与P21的启动子作用来调节P21的表达。简要地写出操作步骤和原理。

要点：将p21Promotor克隆至pCAT中将此p21的reporter同克隆有p53的质粒共同转染细胞，通过测量CAT的表达水平，探究P53蛋白是否能够通过与P21的启动子作用来调节P21的表达

将reporter与不含p53的空载体质粒转染细胞作为对照。

注意：转染适应选用合适的内参（如 renilla）。细胞系可以选择p53野生型或突变型。可考虑做剂量依赖实验。

六．写出用COBRA 和MSP 来检测甲基化状态的原理。

要点：

COBRA 主要用于检测目的DNA 序列中含有的特殊酶切位点的甲基化状态。其基本原理是亚硫

酸氢钠处理后，某些碱基序列的改变可以产生新的限制性内切酶图谱，即新的限制性内切酶

作用位点出现或者消失（由C-T 转换所致）。这种新的图谱可以通过PCR 扩增，然后用特定

限制性内切酶的消化处理而显示出来。与对照组相比较，发生变化的条带即可能为甲基化发

生的区域。这种方法的工作量和耗费相对较小，但只能获得特殊酶切位点的甲基化状态的信

息，因而检测的阴性结果不能完全排除样本DNA 中发生甲基化的可能性。

MSP ：

七. 北京大学蛋白质研究中心发现了一种新基因，设计实验研究该基因的功能。

要点： 1. 生物信息学分析 如对同源基因比对，结构，功能越分析预测新基因功能

2. 检测基因的表达谱（如不同时空表达情况，microarray ，ChIP-on-chip ）

3. 检测基因的定位情况

4. Gain of Function 在细胞/组织/个体 水平 引入表达/过表达未知基因，检测

其生物学效应 如转基因，knock-in ，转染细胞。 但由于未知基因在细胞中表达依然足够，

过表达可能不能观测出显著效应，可能出现假阴性及假阳性结果，

5. Loss of Function 如RNAi Knock-out 抑制活性

6. 上游事件

7. 下游作用 如对信号通路 基因转录 等的作用 必要时研究下作用机制

八．有学者发现了Onc-1和Onc-2两种蛋白，经过酵母双杂交试验发现两种蛋白

质能够相互作用。Onc-1能够调节基因FAF 的表达，促进细胞增值。故而该学者

推断Onc-1能够促进细胞增值，通过与Onc-2的作用调节FAF 的表达。请设计实

验证实该假设。

甲基化样本 Bisulfite 处理

后，m CG 没有改变 在甲基化引物 组中扩增 在非甲基化引物组

中不扩增 非甲基化

样本

Bisulfite 处理后，CG 变为TG

在非甲基化组 引物中扩增 在甲基化引物 组中不扩增

通过 1.confocal 检测两蛋白是否存在时空共定位此法直观但假阴假阳性大

2.CoIP 检测在过表达/未过表达情况下两蛋白是否能相互作用。此法可反映生理状况下蛋白是否能相互作用，但此相互作用可以是直接也可以是间接作用

3.GST pull-down 实验，可以在体外反映蛋白是否可以直接相互作用

4.亲和纯化法体外验证两蛋白可否直接或间接相互作用

以此验证 Onc-1 与Onc-2可以相互作用

B

1.通过ChIP 检测Onc-1 与Onc-2是否可以与FAF promoter 结合

2.分别单独过表达Onc-1 与Onc-2 以及同时过表达Onc-1 与Onc-2，反转录mRNA real-time 检测FAF mRNA 水平以及用Western bloting 检测FAF表达水平

3.分别silence Onc-1 与Onc-2 以及同时silence Onc-1 与Onc-2反转录mRNA real-time 检测FAF mRNA 水平以及用Western bloting 检测FAF表达水平

4. Luciferase法检测Onc-1 与Onc-2 对FAF promoter的作用

以此验证Onc-1 与Onc-2 共同调节FAF表达

C

1.检测在不同的细胞周期Onc-1 与Onc-2的表达水平以及FAF的水平判断是否呈现细胞周期依赖性

2.分别单独过表达Onc-1 与Onc-2 以及同时过表达Onc-1 与Onc-2。用流式细胞术检测而蛋白对细胞周期的影响

3.分别silence Onc-1 与Onc-2 以及同时silence Onc-1 与Onc-2用流式细胞术检测而蛋白对细胞周期的影响

当然也可以用BrdU掺入法以及其他增殖标志物检测来评估二蛋白对细胞增殖的影响九．请简要综述基因在肝脏和大脑中组织差异性表达的关键原因。

要点：涉及表观遗传学的概念，即在基因水平不变的情况下出现可遗传的表型变异。

机制主要有：

1.DNA 修饰（主要是CpG岛的甲基化）

2.组蛋白共价修饰（如甲基化乙酰化磷酸化泛素化 SUMO化糖基化核糖基化）

3.染色质重塑（如依赖ATP的染色体修饰及依赖共价结合反应的化学修饰）基因组印记

4.Non-coding RNA

毛：考试题

1.如何设计引物?

2.如？何提高PCR特异性

3.RT-PCR原理?

4.5',3'RACE原理?

5.PCR在基因表达调控中的作用

朱：1克隆

2基因表达

3DNA甲基化

尚：1新基因功能分析

2基因芯片

3基因表达的组织特异性原理

毛1 PCR 引物设计

！！！下游引物需颠倒碱基。颠倒顺序。

上游引物5‘gccagtcctccgattgactgagtc 3‘

下游引物5‘aactagtaccgacgcaggcgcataaaatc3‘

gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcatttgggg gctcgtccgg gatcgggaga cccctgccca gggaccaccg acccaccacc gggaggtaag ctggccagca acttatctgt gtctgtccga ttgtctagtg tctatgactg attttatgcg cctgcgtcgg tactagttag

ctaaaatacgcggacgcagccatgatcaa

毛2 提高PCR特异性

?

?1．热启动（hot-start)

?比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开

?（2）利用Taq酶的单克隆抗体抑制其活性。

? 2. Touchdown

?先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在退火温度下进行大量扩增。

? 3. Nested PCR

?先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断

? 4. Suppression PCR

?

?原理

RT—PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于

对表达信息进行检测或定量分析,还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。

RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机

引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。

毛4 5',3'RACE原理

RNA反转录5’末端交换机制（Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript，SMART）技术的出现是一个新的里程碑。其原理如下：在合成cDNA的反应中，事先加入的5'末端带Oligo（dT）的SMART引物（如5'–(T)25N-1N–3'，N = A, C, G或T；N-1 = A, G或C），由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo dG（5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACG CGGG–3'）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列（5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACG–3'），合成第二链后可以利用通用引物（UPM （Universal Primer Mix，Long：0.2mM，5'–CTAA TACGACTCACTA TAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'，Short：1mM，5'–CTAA TACGACTCACTA TAGGGC–3'）与NUP(Nested Universal Primer，10 mM，5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'）进行扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。这个方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的总RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、利用部分已知序列克隆全长cDNA，和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等

另：5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3' / 5‘-RACE 产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。

3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的。DNA片段扩增出来

朱1 DNA克隆：

应用酶学的方法，在体外将各种来源的目的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的

DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基因克隆或重组DNA。

1 目的基因的选择与处理（CDNA 文库或基因组文库）限制性内切酶

2 载体的选择与处理限制性内切酶

3 质粒的构建DNA连接酶

4 转染细菌让质粒扩增

5 筛选出插入成功的克隆（蓝白斑筛选）

6 再将筛选出的细菌大量扩增

7 提取DNA

朱3 DNA 甲基化

尽管DNA甲基化对细胞的生物活性有重要的影响，但是对它的检测要比检测DNA的碱基序列相对困难。这主要是由于甲基化的胞嘧啶并不影响C:G核苷酸的配对，而且在PCR 过程中，胞嘧啶上的甲基通常会被丢失。

常用的方法是将目的序列中甲基化状态的胞嘧啶转化为DNA序列碱基组成的变化，其基本做法包括两种，一种是依赖亚硫酸氢钠（Sodium Bisulfite）对甲基化和非甲基化的胞嘧啶的化学活性不同把两者区分开来（原理见下面所述）。另一种则依赖于5’-甲基化的胞嘧啶和非甲基化的胞嘧啶对特定的酶切处理的不同反应而实现的。

1 Sodium Bisulfite 处理

2 MS-PCR (methylation specific PCR)

设计甲基化和非甲基化状态的两种引物

3 处理加酶切甲基化的可以切。非甲基化的相当于突变所以切不动

尚1新基因功能分析包括几方面：

A 序列和结构分析：

是否保守(不同物种间比较) 是否与其他基因同源（不同基因比较）是否有同源的

DOMAIN 或MOTIF

B表达谱(用基因芯片探测其在什么组织表达。与什么蛋白质同表达。然后辅以生物信息学手段归纳出其大致的信号传导路径和与什么样的生物功能相关)

C亚细胞定位（某基因表达产物在细胞分裂的时相位于哪里，这些信息有助于分析其功能）

D Gain of function (overexpression )

使某基因表达增加的方式有两种1 从无到有INTRODUCTION OF EXPRESSION

2 从少到多OVER-EXPRESSION

或者在动物水平上敲除或转入某基因。以观察其对整体生命活动的影响

E loss of function (knock-down knock-out )

抑制性药物作用的两种方式：1 INHIBITION OF ACTING

2 INHIBITION OF EXPRESSION

另：1 实体动物水平的KNOCKOUT

2 ANTI-SENSE

3 RNAi

F Upstream cues (上游调控)

G downstream effects （下游效应）

尚2基因芯片

1) 当克隆出一未知功能的基因作为研究对象时

2）看某一未知基因与哪些已知基因的表达相关联。例如：当细胞受刺激时未知基因的表达会增高。通过芯片技术分析，有另外12个已知基因表达同时增高，伴随21个基因表达下降。通过分析这些已知基因的功能相关性，总结出可能有关的信号转导通路。我们的未知基因有可能就与该通路有关。

3）进而，可以设计实验验证我们的假设

尚3

A 排除genome 的影响：不同个体间同一个体间不同组织的DNA 序列都相同。故表达特异性与DNA序列无关

B染色质松紧状态不同，是否有转录因子结合的机会

影响因素：1）DNA 修饰（甲基化）

2）HISTONE 修饰（甲基化。乙酰化。磷酸化组成了HISTONE CODE）

3)引发不同修饰所需的酶不同

三因素整合后。引起不同染色质重塑效应。

C结合TF转录因子不同（另有COACTIV ATOR 和MEDIATOR的影响）同一基因在不同时期不同组织所结合的很多的TF形成了相对特异的复合物，进而解释了转录产物不同的原因

此外，TF 的结合是整合了细胞内外环境变化后做出的反应。不同细胞所处的为环境不同。激发的信号转导通路不同。产生的生物学效应也不同

08-09年第一学期分生工作基础重点

1、PCR引物的设计（给序列设计，主要是方向问题）

5’端开始写就OK

2、怎样提高PCR特异性

热启动（hot-start)：比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开（2）利用Taq 酶的单克隆抗体抑制其活性。

Touchdown：先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在退火温度下进行大量扩增。Nested PCR：先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断。

3、末端标记方法（给试剂，怎么标记）

DNA聚合酶I(Klenow片段)：随机寡核苷酸引物介导的DNA标记

T4 DNA聚合酶：

(1)放射性标记DNA片段的3‘末端

(2)选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3‘末端，

即所谓的“ 置换合成”

T7 DNA聚合酶：用于标记5‘末端突出的DNA的3’末端。由于它会在3‘端留下一个额外的碱基，因此不能应用于将粘性DNA末端转变成平端

反转录酶：对具有5‘突出端DNA片段的3’端进行填补和标记。

碱性磷酸酶：去除DNA和RNA的5‘端磷酸基，而后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用[ -32P ]ATP在5‘端进行标记，以便进行序列分析。

T4多聚核苷激酶：单双链核酸分子5‘末端的同位素标记

T4 RNA连接酶：R NA 3’末端的放射性标记

脱氧核糖核酸酶I （DNase I）：切口平移标记探针

1、单末端标记

用NheI切割

Klenow酶，dNTP(- α～32P-dNTP)

2、双末端标记

Klenow酶，dNTP(- α～32P-dNTP)

3、利用T4核苷酸激酶进行末端标记

碱性磷酸酶

T4核苷酸激酶，γ-32p-ATP

应用：DNaseI Footprint实验和Gelshift实验

4、RT-PCR，如何避免基因组DNA污染

RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。

为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA 模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。

5、粘性末端DNA片段的克隆（相同酶切,sticky ends）

目的基因和载体DNA分子用同一种酶切除得到相同的粘性末端。

开环线状质粒与DNA之间产生非共价的杂交分子，在复性时，载体和目的DNA片段上的5’-磷酸基和3’-羟基紧密接触，DNA连接酶就催化两分子间形成磷酸二酯键。开环线状质粒与DNA之间产生非共价的杂交分子时，需要高浓度的DNA。0.25-0.5 μg vector + 0.5-1.0 μg DNA。如质粒浓度明显高于DNA时，会产生空质粒，但质粒DNA被一种酶切产生的粘端易自身环化，需要选用磷酸酶去磷酸化。除出5‘端磷酸基团从而使其不能自身环化。而未经处理的目的基因DNA的3-OH和5-Ppi在连接酶作用下可发生共价连接。这样，一条链的连接为正常连接，另一条链由于失去磷酸基团而不能连接，留下3-OH和5- PPI的缺口，但在宿主细胞中被修复带有5‘磷酸基的外源DNA片段可有效的与去磷酸化的质粒DNA连接，形成含有两个缺口的开环分子，有较高的转化效率。

载体和目的DNA分别用酶切后，提取DNA, 再用连接酶连接，14度过夜，转化细菌

6、定向克隆（不同酶切）

该种方法较好，但问题是寻找相同的两个酶切位点（质粒和DNA).

When selecting enzymes, should avoid selecting the cut sites too close。

7、α互补鉴定重组质粒

E.coli β-半乳糖苷酶的两个无活性片段组合而成功能完整的酶的过程。很多质粒含有E.coli β-半乳糖苷酶的前143个氨基酸的编码序列及调控序列，这些序列中包含保持读框的多克隆位点。部分细菌分泌E.coli β-半乳糖苷酶的C端.只有两个E.coli β-半乳糖苷酶C-N结合起来才可分泌半乳糖苷酶。这种半乳糖苷酶可使X-gal现蓝色。

8、组蛋白密码的假说

Modifications on the same or different histone tails may be interdependent and generate various combinations on any one nucleosome

Distinct modifications of the histone tails would induce interaction affinities for chromatin-associated proteins

翻译成中文即可。

组蛋白被修饰导致染色质结构的改变,在真核基因表达调控中发挥着重要的作用. 修饰位点在组蛋白尾部,修饰形式包括赖氨酸、精氨酸甲基化与乙酰化,丝氨酸磷酸化和其他氨基酸的泛酸化等. 这种组蛋白尾部的复杂修饰模型提供了编码信息,细胞催化组蛋白修饰的酶对催化位点的识别具有特异性,可将其所携带的信息传递给染色质调节因子,最终导致基因表达的变化.

9、新基因和哪些蛋白相互作用及验证其功能

(1）Sequence and structure analysis：Conservation in mouse, or/and other organisms

Homologue to other known genes

Homologue to known domains, motifs, etc.

(2）Expression profiling

(3) Cellular compartmentalization：通过确定该基因的表达产物在细胞内的分布位置来推测该基因的功能。Cell membrane、Cytoplasm Nucleus、Other sub-organelles (4)Gain of Function：

Animal Experiments：Random insertion--transgenic、miceTargeted insertion--Knock-in Transfection Experiments：Transient transfection、Stable transfection：Constitutive expression、Regulated expression

Regulated Expression：TET ON/OFF SYSTEM

使该基因在机体内表达或过表达，通过观测基因表达前后机体生理状态的变化来确定该基因的功能。主要通过random insertion和target insertion两种方法达到gain of function 的目的。

(5)Loss of Function：抑制该基因的激活或表达，通过观测抑制前后机体生理状态的变化，从而确定基因的功能。抑制激活的方法有specific inhibitiors; dominant negatives; specific antibodies。抑制表达的方法有：knock out; anti-sense; RNA interference (6)Upstream cues：

Induction/inhibition of expression ：Cell cycle correlation；Effects of chemicals, biologicals, etc。

Regulation of expression：Analysis of trans-acting factors：Electrophoretic mobility shift assay、DNA footprinting、Chromatin immunoprecipitation

Analysis of cis-control elements：Luci

Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)

?Protein mobility

?Protein dynamics

?Protein-protein interaction

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

?Protein-protein interaction

?Protein conformational changes

(7)Downstream effects

10、用你的语言组织基因时空表达的机制和原因

基因表达的时间、空间特异性由特异基因的启动子和或增强子与调节蛋白相互作用决定。

08-1月分生工作基础试题

一 1、如何提高PCR特异性？列举三种方法

热启动（hot-start)：比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开（2）利用Taq 酶的单克隆抗体抑制其活性。

Touchdown：先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在退火温度下进行大量扩增。Nested PCR：先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断。

2、Tm值和什么有关？

片段的GC含量和长度。

3、为了避免PCR产物发生点突变，应选用那种耐热的聚合酶？

高保真的耐热聚合酶，如pfu

4、（忘了）

5、为以下序列设计一对20bp的引物（序列给定）

5’端写起。

二为了避免基因组DNA污染，RT-PCR引物因该如何设计？

为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。

简单的说就是跨内含子设计引物。

三已知一段cDNA片断，请设计实验获得该片断所在的全长cDNA。

基因组DNA步移法和Inverse PCR

基因组DNA步移法：用五种酶切，加上接头，根据已知序列和接头设计PCR引物，扩增。Inverse PCR：酶切，连接成环状，根据已知序列设计两个引物，PCR扩增。

四请写出下图中质粒的五种性质，并简述其功能。（质粒图谱给定）

五给以下序列设计一组MS-PCR引物。（序列给定）

引物中至少含有3个CG。MS-PCR中，需要分别针对甲基化和非甲基化的情况设计两类引物，而且至少要保证3对以上CpG双核苷酸序列存在于引物中。

六简述Southern blot 与Northern blot的异同点

两种印迹杂交法的不同点

七基础医学院王教授通过酵母双杂发现蛋白p66与p88存在相互作用，并且p66可激活cyclinD6转录

1、如果设计实验进一步验证p66与p88相互作用以及作用方式。

Co-IP证实是否有真正的相互作用（内源性的），GST-Pulldown进一步确认是否有直接相互作用。

2、设计实验证实p66调控cyclinD6转录

分别在细胞中过表达和RNAi P66，一段时间后，用RT-PCR和Western的方法检测cyclinD6的表达情况。利用cyclinD6的luci的报告基因的载体，转染细胞，过表达p66，看荧光激活情况。

3、如何进一步验证p66、p88、 cyclinD6三者的联系

分别在细胞中过表达和RNAiP88，用RT-PCR和Western的方法检测cyclinD6的表达情况。如果有变化，则推测p66调控cyclinD6可能与p88有关。同时用cyclinD6的luci报告基因载体转染不表达p66、p88的细胞，再分别过表达p66、p88、p66和p88，观察荧光激活情况，推测p66对cyclinD6转录的调控过程中，p88起协同作用还是抑制作用，以及p66对cyclinD6的调控过程中，p88和p66的结合是否是必要的。再选择三者都表达的细胞系，过表达和RNAi cyclinD6，RT和Western检测p66和p88的表达变化。

八用一句话概括表观遗传概念，什么是组蛋白密码假说，简述研究表观遗传的意义。

表观遗传学(epigenetics)主要研究基因序列没有发生改变的情况下所导致的可以遗传的表型变异的机制。

Modifications on the same or different histone tails may be interdependent and generate various combinations on any one nucleosome

Distinct modifications of the histone tails would induce interaction affinities for chromatin-associated proteins

翻译成中文即可。

组蛋白被修饰导致染色质结构的改变，在真核基因表达调控中发挥着重要的作用。修饰位点在组蛋白尾部，修饰形式包括赖氨酸、精氨酸甲基化与乙酰化，丝氨酸磷酸化和其他氨基酸的泛酸化等。这种组蛋白尾部的复杂修饰模型提供了编码信息，细胞催化组蛋白修饰的酶对催化位点的识别具有特异性，可将其所携带的信息传递给染色质调节因子，最终导致基因表达的变化。

表观遗传的意义：表观遗传是环境因素与表型间的作用界面：环境通过改变基因的表观型而影响表型。

肿瘤、神经与精神系统疾病、免疫系统疾病、内分泌系统疾病等重大疾病与表观遗传有密切的联系。

07年分生工作基础试题

一．⑴．要扩增下面一段序列，请设计出其上游和下游的引物。

gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg

tctcgctgtt ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcatttgggg gctcgtccgg

gatcgggaga cccctgccca gggaccaccg acccaccacc gggaggtaag ctggccagca acttatctgt

gtctgtccga ttgtctagtg tctatgactg attttatgcg cctgcgtcgg tactagttag

5’- gcgccagtcc tccgattgac-3’

5’-ctaactagta ccgacgcagg-3’

⑵．请给出三个提高PCR特异性的方法。

热启动（hot-start)：比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开（2）利用Taq 酶的单克隆抗体抑制其活性。

Touchdown：先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在退火温度下进行大量扩增。Nested PCR：先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断。

二．要用RT-PCR扩增一段mRNA，请设计一种用于RT-PCR的引物来避免基因组DNA的污染，并简要说明原理。该段序列的基因组DNA序列的结构如下：

跨内含子设计引物

三．下图给出了一段DNA序列和其酶切位点：

BamHI G|GATCC

CCTAG|G

SalI G|TCGAC

CAGCT|G

MspI C|CGG

GGC|C

5’-ATCG GGATCC ACTT GTCGAC ACCAAGC CCGG-3’

3’-TAGC CCTAGG TGAA CAGCTG TGGTTCG GGCC-5’

请设计两种实验方法用放射性核素标记该段序列的上游末端。(1、简要说明原理。2、说明所用的酶。3、说明所用的放射性标记的位置。）

单末端标记：

用BamHI切割

Klenow酶，dNTP(- α～32P-dNTP)

酶切后产生5’端伸出的粘性末端，利用Klenow酶的5‘→3’ DNA聚合作用和3‘→5’外切酶活性将带有同位素的dNTP(- α～32P-dNTP)加到粘性末端从而将此片段上游末端标记。位置：3’-CTAGG TGAA CAGCTG TGGTTCG GGCC-5’

将Klenow酶换成经修饰的T7 DNA聚合酶：其3‘ 5’外切酶活性可选择性的降低，或通过基因工程改造使之完全失活，而保留了DNA聚合酶活性。用于标记5‘末端突出的DNA的3’末端，它会在3‘端留下一个额外的碱基。

五.现有一个pCAT质粒和一段带有p21Promotor的DNA 序列。请设计一个试验来证明P53蛋白是否能够通过与P21的启动子作用来调节P21的表达。简要地写出操作步骤和原理。

将带有p21Promotor的DNA 序列插入到pCAT质粒的真核DNA位点中，转染到H1299细胞中，随后加入P53蛋白，作用一段时间后收集细胞，检测CAT值。若有作用，则CAT值增高。

六．写出用COBRA和MSP来检测甲基化状态的原理。

亚硫酸氢钠可以把非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，后者经PCR扩增克隆变成胸腺嘧啶而产生T:A的配对，但对甲基化的胞嘧啶亚硫酸氢钠则没有作用，这样甲基化状态不同的DNA 片段就转化为有碱基序列差异的两个片段。

COBRA主要用于检测目的DNA序列中含有的特殊酶切位点的甲基化状态。其基本原理是亚硫酸氢钠处理后，某些碱基序列的改变可以产生新的限制性内切酶图谱，即新的限制性内切酶作用位点出现或者消失（由C-T转换所致）。这种新的图谱可以通过PCR扩增，然后用特定限制性内切酶的消化处理而显示出来。与对照组相比较，发生变化的条带即可能为甲基化发生的区域。这种方法的工作量和耗费相对较小，但只能获得特殊酶切位点的甲基化状态的信息，因而检测的阴性结果不能完全排除样本DNA中发生甲基化的可能性。

MS-PCR：甲基化样本用亚硫酸氢钠处理后，CG没有改变，在甲基化引物组中扩增，而在非甲基化中不扩增；非甲基化样本用亚硫酸氢钠处理后，CG变TA，在甲基化引物组中不扩增，而在非甲基化中扩增。

七. 北京大学蛋白质研究中心发现了一种新基因，设计实验研究该基因的功能。

研究分析序列和结构，在种属中是否保守，是否和其他已知基因同源，是否有经典的domain 和motif或它们的同源体，以推测它的可能功能。

利用Northern检测其表达的时空特异性。

利用confocal通过确定该基因的表达产物在细胞内的分布来推测它的功能。

分别在动物水平和细胞水平将该基因random insertion或target insertion和过表达，观测该基因表达前后机体生理变化和其他基因表达变化（基因芯片），以分析它的功能。

再将该基因动物中knock out，细胞中RNAi或用specific inhibitiors; dominant negatives; specific antibodies后，观测机体生理变化和其他基因表达变化（基因芯片），以分析它的功能。

之后，可以研究它对细胞周期的影响，生物学功能等，以及转录因子和顺式作用元件对它表达的调控作用（主要研究方法有EMSA，DNA footprint，ChIP，做删减体等）。

八．有学者发现了Onc-1和Onc-2两种蛋白，经过酵母双杂交试验发现两种蛋白质能够相

互作用。Onc-1能够调节基因FAF的表达，促进细胞增值。故而该学者推断Onc-1能够促进细胞增值，通过与Onc-2的作用调节FAF的表达。请设计实验证实该假设。

在细胞中将Onc-1 knock down或过表达后，流式测细胞周期，并在转录和翻译水平检测细胞增殖相关基因的表达情况。

在细胞中将Onc-2 knock down或过表达后，在转录和翻译水平上检测FAF的表达情况。同时利用FAF的报告基因载体，转染不表达Onc-1和Onc-2的细胞，分别过表达Onc-1，Onc-2，Onc-1和Onc-2，检测荧光信号。

九．请简要综述基因在肝脏和大脑中组织差异性表达的关键原因。

基因表达的时间、空间特异性由特异基因的启动子和或增强子与调节蛋白相互作用决定。

不知是哪年的

1．PCR引物的设计

答：一般情况下，两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列分别位于待扩增DNA区段的两端。PCR引物的设计原则：

①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

2．如何提高PCR的特异性

答：（1）热启动：防止引物与模板随即结合。将Taq酶

与其他反应体系分开；利用Taq酶单克隆抗体抑制其活性。

（2）Touchdown：先在高温条件下进行几轮PCR，然后再在退火温度下进行大量扩增。

（3）递减PCR：通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，

直到退火温度低于Tm 5℃。这样，特异性最高的目的模板会被优先扩

增，并在随后的循环中继续扩增占据优势

（4）巢式PCR：使用巢式引物进行连续多轮扩增，由于同两套引物都互补的靶序列很少巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，从而提高PCR反应

的特异性和灵敏度

（5）加入佐剂：包括DMSO，甘油等，能构降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区

（6）引物：引物长度适当，18-24mers，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的

特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而

且长序列比短序列杂交慢，影响产量；引物浓度：引物的浓度会影响

特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导

致非特异性产物扩增

（7）Mg+: 较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行最适Mg2+浓度测定

3．RT-PCR设计引物时应注意哪些问题？

答：引物设计在两个外显子之间，这样扩增产物才可区分是RNA表达还是基因组污染(1)足够长, 18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量

(2) GC% 40%~~~~60%

(3) 5′端和中间序列要多GC, 以增加稳定性

(4)避免3′端GC rich, 最后3个BASE不要有GC, 或者最后5个有3个不要是GC

(5)避免3′端的互补, 否则容易造成DIMER

(6)避免3′端的错配

(7)避免内部形成二级结构

(8)附加序列 (RT site, Promoter sequence) 加到5′端, 在算Tm值时不算, 但在检测互补和二级结构是要加上它们

(9)使用兼并引物时, 要参考密码子使用表, 注意生物的偏好性, 不要在3′端使用兼并引物, 并使用较高的引物浓度

4．核酸探针的标记

答：（1）单末端标记：标记端一定是3`端内凹，先用NheI切割3`端，再用Klenow酶补平缺口加入标记物。

（2）双末端标记

（3）利用T4核苷酸激酶进行末端标记：先用碱性磷酸酶处理，再用T4核苷酸激酶将

γ-32p-ATP 加入两5`端` （4）随机引物标记：过程------先加热使DNA变性，双链变单链，加入随即引物在Klenow

酶作用下生成

（5）缺口平移标记：先用Dnase1在DNA双链上切掉几个DNA片段，再在Klenow酶作

用下将缺口补平。并加入被dNTP(α-32p-dNTP) 标记的探针.

5. Pr间的相互作用

答：1 GST融合蛋白进行Pulldow实验

(1）原理：

细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。

(2)应用：

1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用

2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用

2 免疫共沉淀

（1）原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档

缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用

3 酵母双杂交系统

（1）原理：

将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域(BD)的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域(AD)的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。（2）应用：

1）已知蛋白之间相互作用的检测

2）蛋白质的功能域研究

3）克隆新基因和新蛋白

4 蛋白质芯片

其制作原理类似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的样品是提纯的蛋白、多肽。其检测的原理类似于抗原、抗体检测的ELISA法。

6．如何检测一种基因的功能

答： (1）Sequence and structure analysis：

Conservation in mouse, or/and other organisms

Homologue to other known genes

Homologue to known domains, motifs, etc.

(2）Expression profiling

(3) Cellular compartmentalization：通过确定该基因的表达产物在细胞内的分布

位置来推测该基因的功能

(4)Gain of Function:使该基因在机体内表达或过表达，通过观测基因表达前后机

体生理状态的变化来确定该基因的功能。主要通过random

insertion和target insertion两种方法达到gain of function

的目的。

(5)Loss of Function：抑制该基因的激活或表达，通过观测抑制前后机体生理状态

的变化，从而确定基因的功能。抑制激活的方法有specific

inhibitiors; dominant negatives; specific antibodies。

抑制表达的方法有：knock out; anti-sense; RNA interference

(6)Upstream cues

(7)Downstream effects