生物技术概论重点总结

生物技术概念：

?生物技术（biotechnology），是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。

生物技术的种类

?生物技术不完全是一门新兴学科，它包括传统生物技术和现代生物技术两部分。

?传统生物技术：指旧有的制造酱、酒、面包、奶酪、酸奶及其它食品的传统工艺。

?现代生物技术：包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程

基因工程

?基因工程是20世纪70年代随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。是指在基因水平上操作并改变生物遗传特性的技术，也称为DNA重组技术。

细胞工程

?是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质的技术。

酶工程

?酶工程是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的技术。

发酵工程

?是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动植物细胞及其特定功能，通过现代工程技术手段生产各种特定的有用物质，或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。

蛋白质工程

?是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造和设计，构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更符合人类需要的新型蛋白质。

细胞中的主要物质

?遗传物质（即基因，编码蛋白质)

?蛋白质（催化生化反应、构成细胞骨架、运输物质等）

?碳水化合物（提供能量）

?微量元素（激活或抑制蛋白）

?水（溶剂）

微生物工程菌发酵工程

基因工程蛋白质或酶蛋白质工程或酶工程产品

动、植物个体或细胞细胞工程

优良动、植物品系

现代生物技术的理论背景：

现代生物技术是以20世纪70年代DNA 重组技术的建立为标志的。

◆1944 年Avery 等阐明了DNA是遗传信息的携带者

◆1953年Watson &Crick发现DNA双螺旋结构 开创分子生物学

◆1961年Nirenberg破译了遗传密码,揭开了DNA 编码的遗传信息是如何传递给蛋白质这一秘密

生物技术在经济、社会中的作用

1改善农业生产，解决食品短缺

1）提高农作物的产量及品质

–培育抗逆的作物优良品系

–植物种苗的工厂化生产

–提高作物品质

–生物固氮，减少化肥使用量

2）发展畜牧业生产

–动物的大量快速无性繁殖

–培育动物的优良品系

2提高生命质量，延长人类寿

1）开发制造贵重的新型药品

2）疾病的预防和诊断

3）基因治疗

4）人类基因组计划

3解决能源危机、治理环境污染

1）解决能源危机

生物能源将是最有希望的新能源之一，而其中又以乙醇最有希望成为新的替代能源。

2）保护环境

人们可以利用微生物净化有毒的化合物，降解石油污染，清除有毒气体和恶臭物质，综合利用废水和废渣，处理有毒金属，达到净化环境、保护环境、废物利用并获得新的产品的目的。

4制造工业原料、生产贵重金属

1）制造工业原料

利用微生物在生长过程中积累的代谢产物,生产食品工业原料,种类繁多。

2）生产贵重金属

利用微生物的浸矿技术对废渣矿、贫矿、尾矿、废矿进行提炼。

5生物技术的安全及其对伦理、道德、法律的影响

1）基因工程对微生物的改造是否会产生某种有致病性的微生物，这些微生物都带有特殊的致病基因，如果它们从实验室逸出并且扩散，有可能造成类似鼠疫那样的可怕疾病的流行。

2）转基因作物及食品的生产和销售，是否对人类和环境造成长期的影响，擅自改变植物基因是否可能引起一些难以预料的危险。

3）分子克隆技术在人类身上的应用可能造成巨大的社会问题，并对人类自身的进化产生影响；而应用在其他生物上同样具有危险性，因为所创造出的新物种有可能具有极强的破坏力而引发一场浩劫。

4）生物技术的发展将不可避免地推动生物武器的研制与发展，使笼罩在人类头上的生存阴影越来越大。

5）动物克隆技术的建立，如果被某些人用来制造克隆人、超人，将可能破坏整个人类社会的和平。

1.核酸的化学结构

碱基

2.核酸的分类

?核酸分为：

1.）脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid DNA),DNA含A,T,G,C四种碱基和脱氧核糖

DNA的碱基组成

?（1）组成1）A+G=C+T, G=C, A=T

2）同种生物的不同组织的碱基组成相同,不同生物的同种组织的碱基组成不同

3）年龄,营养,环境不影响碱基组成

?（2）DNA的书写方式

如：5’-GATCATAATTC-3’

3’-CTAGTATTAAG-5’

可写成：5’-GA TCATAATTC-3’

（3）DNA双链的存在形式：

几乎所有的真核生物的DNA都以线形存在，大部分原核生物的染色体DNA和全部线粒体DNA以及细菌的质粒DNA是环状DNA分子。病毒和噬菌体中有的含线形DNA，有的含环状DNA。

（4）DNA双链的基本特点：

1）DNA分子是由两条互相平行的脱氧核甘酸长链盘旋而成。

2）DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本的骨架，碱基排在内侧。

3）两条链上的碱基通过氢键结合，形成碱基对，它们的组成有一定的规律。

DNA的一级结构

一级结构即四种核苷酸的连接及其排列顺序

DNA的二级结构

指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构

DNA的高级结构

1）核小体

2）30nm纤维

3）300nm棒

4）染色体

DNA分子结构特征

?原核生物DNA分子中有基因重叠现象

?真核生物DNA分子中普遍存在插入序列

?编码的核苷酸顺序就携带着遗传信息

4.RNA的结构

?组成上与DNA相似，但为核糖核酸，碱基为A，U，G，C。

?单链，不存在碱基比例关系。

?局部能形成碱基对，出现双螺旋，不配对区域形成突起(环)

RNA的分类

?信使RNA(mRNA) - 转录遗传信息

?转运RNA(tRNA) - 运载氨基酸

?核糖体RNA(rRNA）- 蛋白质合成

mRNA的特点

?线形单链结构，携带DNA信息，作为指导合成蛋白质的模板

?真核生物5ˊ-端有帽子结构，免遭核酸酶的破坏

?有非翻译序列

?真核生物3ˊ--polyA结构，提高mRNA在细胞质中的稳定性tRNA的特点

1.四环四臂

2.氨基酸臂与反密码臂是识别氨基酸与密码的重要结构

rRNA的特点

?是细胞内含量最多（82%），也是质量最大的RNA

?与蛋白结合形成核糖体参与蛋白合成

?不具备单独功能

5. DNA分子的功能

?DNA分子能在细胞内半保留复制

DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位

置就称为复

制起点(Origin of replication)，用ori表示。

DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核生物中，每个DNA分子上就有一个复制子;而在真核生物中，每个DNA分子有许多个复制子，每个复制子长约50-200kb。

携带遗传信息

DNA的转录

?转录包括：转录启动子、转录区

?转录启动子：是5?ˉ端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确相结合并具有转录起始的特异性

?原核生物：-10区（TATAA T）、-35区（TTGACA）

?真核生物：-25---30区（TATA）、-70---80区（CAAT）、-80---100区（GC）

?转录区：从转录RNA的起录点开始，包括基因编码区和转录终止子

tRNA的特点

（一）蛋白质的化学组成

?蛋白质含有：碳、氢、氧、氮、硫。

?蛋白质水解可成为肽，肽进一步水解为氨基酸，它是组成蛋白质的最小单位。

氨基酸的化学通式

?组成蛋白质的常见氨基酸有二十种，通式如下：

?R不同，组成的氨基酸就不同

氨基酸的分类

–对于20种标准的氨基酸，按照侧链化学性质的不同，可以分为以下三组：

?疏水性的氨基酸

–Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro和Met

?带电氨基酸

–Arg、Lys（+）和Asp、Glu（-）

?亲水性氨基酸

?Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、His、Tyr、Trp

肽键、肽和多肽

?不同数目的氨基酸以肽键顺序相连，形成链状分子，即是肽或多肽，通常分子量在1500以下的为肽，在1500以上的为多肽，-NH2端为N末端写在左，另一端为C末端，写在右

蛋白质一级结构

?肽键

?肽链

?氨基酸排列顺序等

二级结构：肽链的主链在空间的走向

?α-螺旋

?β-折叠

?β-转角

?无规卷曲

?无序结构

三级结构

?在二级结构基础上的肽链再折叠形成的构象

?亲水基位于球体表面,疏水基位于球体内部

四级结构

?组成蛋白质的多条肽链在天然构象空间上的排列方式，多以弱键互相连接。疏水力、氢键、盐键

?每条肽链本身具有一定的三级结构，就是蛋白质分子的亚基

–球蛋白

近似球形，表面富含亲水基团，溶于水如：酶、多种蛋白质激素、各种抗体细胞质和细胞膜中的蛋白质

–纤维蛋白

蛋白质分子围绕一个纵向轴缠绕成螺旋状如：指甲、毛发、真皮、韧带等

（四）蛋白质的空间作用力

?氢键

?盐键(离子键)

?疏水键

?范德华力

?二硫键

?脂键

（五）蛋白质结构与功能的关系

?一级结构与功能的关系序列分析

?空间结构与功能的关系结构分析

空间结构与功能的关系

1）蛋白变性的特点：蛋白质变性后，生物活性丧失，溶解度下降，粘度增加。

2）可逆变性

3）不可逆变性

（六）蛋白质的生物合成

?核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，tRNA是模板与氨基酸之间的接合体。

蛋白质的合成步骤

?翻译的起始?a?a核糖体与mRNA结合并与氨基酰-tRNA生成起始复合物。

?肽链的延伸?a?a核糖体沿mRNA5?ˉ端向3?ˉ端移动，导致从N端向C端的多肽合成。

?肽链的终止以及肽链的释放?a?a核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应

三、基因与基因表达的一般概念

?基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成mRNA，翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。?基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达的最终目的。

基因的概念：基因是一段有功能的DNA片段，基因位于染色体上，基因决定生物的性状、发育、代谢和免疫状态等。

囊性纤维化

?囊性纤维化（CF）是一种侵犯多脏器的遗传性疾病。主要表现为外分泌腺的功能紊乱，粘液腺增生，分泌液粘稠，汗液氯化钠含量增高。临床上有肺脏、气道、胰腺、肠道、胆道、输精管、子宫颈等的腺管被粘稠分泌物堵塞所引起一系列症状，而以呼吸系统损害最为突出。

?

PCR

?20世纪80年代初期，PCR是由一位勇于创新的年轻分子生物学家穆利斯在加利福尼亚西特斯生物技术公司工作

期间研究出来的。

?穆利斯认使用一个极其简单的方法，即利用为人熟知且能通过商业途径获得的酶来扩增任何DNA样本，无论这个样本有多小都能被扩增到我们所需要的量。

?该技术获得1992年诺贝尔奖，它为癌症诊断和亲子鉴定翻开了新的一页，有力地推动了我们发现和克隆人类基因的进程。

PCR定义

?聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction，简称PCR）。它是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸三步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。

技术原理

1）DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

2）双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

3）在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

4）但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

工作原理

1）PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：

2）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

3）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

4）引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

5）重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

反应体系与反应条件

1）PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+) 。

2）温度控制由PCR仪完成。

PCR产物检测——电泳

电泳的定义：

依据分子或颗粒所带的电荷、形状和大小等不同，因而在电场介质中移动的速度不同，从而达到分离的技术。

测序

基因测序定义：对基因中碱基排列顺序的测定。

分子标记

1)分子标记是以生物的大分子，尤其是生物体内的遗传物质——DNA的多态性为基础的遗传标记，是DNA

水平上遗传变异的直接反映。

2)20世纪70年代Grodzicker等首创DNA限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism , RFLP)

技术，开创了应用分子标记作为遗传标记的新阶段，并开始应用于植物遗传育种的研究。随着PCR技术的

发展，又产生各种新型的分子标记，如RAPD、SSR、AFLP、小卫星DNA、STS、SSLP、CAPS、IRA、SAMPL、SSCP等。

RAPD标记

RAPD即随机扩增DNA多态性技术是Williams和Welsh两个研究小组在1990年发展起来的一种DNA遗传标记，它是建立在PCR基础之上，以随机的寡聚核苷酸（10个碱基）作为PCR的反应引物，对基因组DNA 进行扩增，由扩增产物的多态性而显示基因组的多态性的检测技术。

RAPD原理

RAPD原理基本与PCR原理相同，它的应用是基于这样的一个推理：对于不同来源DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的片段（不同来源DNA间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定来源中出现的条带就可作为该模板的分子标记。

RAPD标记的特点

①无需专门设计RAPD 扩增反应引物，也无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成

和随机选定。

②每个RAPD 反应中，仅加单个引物，就可通过引物和DNA 随机配对实现扩增，扩增无特异性；

③退火温度低，一般为36℃，这样的温度能保证核苷酸引物与模板的稳定结合，同时允许适当的错误配对，

以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，使RAPD 有较高的检出率。

④RAPD 技术简便易行、省时省力，不需要RFLP 分析的预备性工作：如同位素标记及分子杂交。RAPD 易

于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记，并可借助于计算机系统进行分析。

⑤RAPD 分析所需的DNA 样品量极少，仅需要25ng左右，这对于生物早期取样鉴定或在DNA 受限制的

情况下是十分有利的。

重要作物的巨大变革全仰仗：

20世纪80年代出现的两项新技术，即植物克隆和转基因。以及植物细胞的全能性。

植物细胞全能性：

指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。

动物细胞具备全能性吗？

1）不具备。

2）动物细胞分化程度较高，虽然每一个细胞核也具有个体的全部遗传信息，但由于不同组织细胞内营养物质不同，极大的限制了遗传信息的表达，从而导致单细胞不能再生个体。

3）动物细胞核是具备全能性的，把细胞核取出注入取出细胞核的受精卵内一样可以再生动物个体。该技术即动物克隆。

植物外源基因转化方法

根据不同转化方法过程中是否存在载体介导，可将现有转基因方法分为直接导入法和间接导入法两大类。

1外源基因间接转化法

间接转化法是指通过生物体介导，将外源基因转入植物体细胞的转化方法。根据介导生物体的不同，间接转化法又可分为农杆菌介导法、病毒介导法和细菌球质体介导法，其中应用最为广泛的是农杆菌介导法。

农杆菌介导转化

是在其Ti质粒的T-DNA区和Vir区的相互作用下完成的，其中T-DNA区是转移到植物基因组的区段，而Vir区负责对T-DNA区进行切割、转移和整合到植物基因组。

其侵染过程主要包括5个阶段，分别为：

（1）农杆菌在植物敏感细胞上吸附；

（2）农杆菌中的Ti质粒上的vir区基因被激活；

（3）T-DNA切割和T-DNA复合物形成；

（4）T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞；

（5）T-DNA整合到植物染色体上并且进行表达。

农杆菌介导法的优点

农杆菌作为一种自然界中存在的基因转化系统，在其介导转化植物受体时基因的转移具有自发性，T-DNA插入的拷贝数较少，重排程度低，其转移基因具有稳定遗传且呈孟德尔遗传的优点；此外，农杆菌介导法还具有操作简单、转化率高、嵌合体少的特点，是进行大规模转化的首选方法。

农杆菌介导法的缺点

农杆菌介导转化也存在一些缺点，比如农杆菌感染过程会对植物材料造成损伤，T-DNA整合时其边界可能会发生短截，T-DNA以串联形式整合；转移T-DNA区的两个基因未必共表达等。

2 外源基因直接转化法

?早期转基因的研究主要针对双子叶植物，农杆菌介导法均能获得较高的转化率，但在后来的研究中发现农杆菌介导法无法实现对大部分单子叶植物的转化，这可能是由于单子叶植物不是农杆菌的天然寄主造成的。因而在后来的研究中又逐渐发展了外源基因的直接转化法。

外源基因直接转化法

是指通过物理或化学的方法将外源基因导入植物细胞或原生质体，由此获得转基因植株的方法。主要包括化学刺激法、基因枪法、电击法和显微注射法等。

化学刺激法

化学刺激法是利用原生质体本身易于摄取外来物质的特性，再加以化学药剂刺激，使外源基因转入原生质体细胞的转化方法。其使用的化学药剂主要有磷酸钙、氯化钙和PEG等，其中最常用的是PEG刺激法。

PEG即聚乙二醇。PEG刺激法的原理是将原生质体细胞悬于含有DNA质粒和PEG的溶液中，首先由

PEG扰乱原生质细胞表面电荷，从而造成细胞间融合；然后质粒DNA在渗透压的作用下透过原生质膜

进入细胞内并最终随机的整合入基因组中。

基因枪法

基因枪法又称微弹轰击法，它是利用火药爆炸或高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生成植株，其中表现为转基因阳性的植株即为转基因植株。

电击法

电击法也是一种以原生质体为受体的外源基因转化技术，其原理是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上形成可逆的瞬间通道。当外源DNA附着于细胞质膜靠近电击点时，DNA分子就有可能通过小孔进入细胞内，进而整合到受体细胞的基因组上。

显微注射法

显微注射法是使用毛细微管在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞或原生质体的一种直接而完善的外源基因转移方法。在植物转基因的应用过程中，由于植物细胞的细胞壁和原生质体的弹性，通常将细胞用琼脂糖多聚赖氦酸固定，也可用吸管吸取单个细胞固定，然后将外源DNA通过特制的毛细微管注入细胞、原生质体或直接注入核内。