嗜肺军团菌荧光定量PCR检测方法的建立_张琦

了采样的效率。三是混杂物质和环境的干扰,国外的

研究发现空气中细菌和真菌等混杂物质的干扰会降低撞击法的采样效率,通过添加高效过滤网,可以提高采样效率[12]。此外环境的温湿度对流感病毒的采集效率也有一定的影响[13]

。

本实验证实了使用新型静电场采样装置采集分析流感病毒是可行性的,可以进一步改进目前的采样器,通过延长气溶胶在采样器中的停留时间,提高其采集的效率。

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?专题论著?

嗜肺军团菌荧光定量PCR 检测方法的建立

张琦1,陈晓东1,2,张宝莹3,钱乐4,司朝宗4,张秀珍2,甄世祺2,刘凡3,陈连生2

(1.南京医科大学公共卫生学院,　江苏南京　210029;2.江苏省疾病预防控制中心,　江苏南京　210009;

3.中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所,　北京　100050;

4.东南大学公共卫生学院,　江苏南京　210009)

DOI :10.3969/j.issn.1006-9070.2010.03.002

基金项目:“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAI19B04)收稿日期:2010-03-22

作者简介:张琦(1984—

),女,内蒙古赤峰人,硕士研究生在读。 【摘　要】　目的:建立嗜肺军团菌mip 基因荧光定量PCR 检测方法。方法:利用Primer Express 软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果:该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达

293copies/μl ;重复性较好,Ct 值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论:该方法快速且具有较好的特异性、

敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。

【关键词】　嗜肺军团菌;荧光定量PCR 检测;mip 基因

【中图分类号】　R -331　【文献标识码】　A 【文章编号】　1006-9070(2010)03-0003-04

Detection of legionella pneumophila by fluorescence qu antitative PCR method

Z HA N G Qi,C H EN X iao-dong,Z HA N G B ao-y ing,QIA N L e,S I Chao-zong,Z HA N G X i u-z hen,Z H EN S hi-qi,L IU Fan,C H EN L ian-sheng

(College of Public Health in N anj ing Medical Universit y,N anj ing210029,China)

【Abstract】　Objective:To establish a fluorescence quantitative PCR assay to detection Legionella pneumophila.Methods: Primers and probe were designed by Primer software,and plasmid standard,legionella pneumophila,non-legionella pneumo2 phila and other strains were used to evaluate the specificity,sensitivity and repeatability of the assay.Environmental samples were collected and detected by this assay.R esults:This assay had high specificity for detecting Legionella pneumophila but not to non-legionella pneumophila and other strains.The sensitivity of this assay was293copies/μl.The repeatability of this as2 say was high,the coesfficient of variation of Ct values was low.Five of twelves environmental samples were positive.Conclu2 sion:The fluorescence quantitative PCR provides a specific,rapid and sensitive method for quantitative detection of Legionella pneumophila.It is helpf ul for the rapid detection of environment source of Legionella pollution and emergency.

【K ey Words】　Legionella pneumophila;fluorescence quantitative PCR;mip gene

军团菌普遍存在于环境水中,受军团菌污染的气溶胶和水通过吸入会感染人体,可能引发散在的或流行性非典型肺炎,其死亡率高达15%～20%[1]。目前已确认军团菌属有52种,共72种血清型[2],但90%的军团菌病由嗜肺军团菌引起[1]。传统的标准实验方法主要依靠细菌培养、生化反应和血清学鉴定,费时较长、约10d,难以适应快速控制疫情的要求[3]。因而,建立一种快速、敏感、准确的实验室检测方法显得尤为必要。目前很多关于军团菌PCR法检测的报道,主要的目标基因包括16SrRNA、5SrRNA、23S-5S间隔区及mip基因。其中mip基因的表达产物是迄今所公认的嗜肺军团菌的主要毒力因子之一,为嗜肺军团菌所特有[4,5]。本研究根据嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,目的在于建立快速、敏感、特异的嗜肺军团菌荧光定量PCR检测方法。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株:嗜肺军团菌L P1A TCC33125、L P3(地方株)、非嗜肺军团菌(地方株)、绿脓杆菌A TCC15442、白色葡萄球菌A TCC8032、金黄色葡萄球菌A TCC6538、大肠杆菌A TCC8099、白色念珠菌

A TCC10231。

1.1.2　培养基:军团菌基础BCYE培养基(OXOID)、普通营养琼脂培养基(杭州天和微生物试剂有限公司)。1.1.3　质粒标准品:江苏省疾病预防控制中心提供以甲醛处理的嗜肺军团菌A TCC33152菌液,由上海闪晶分子生物科技有限公司合成,并测定质粒DNA浓度进行拷贝数换算。

1.1.4　引物与探针:针对嗜肺军团菌mip基因保守序列,应用Primer Exp ress软件设计特异性引物和探针,由上海闪晶分子生物科技有限公司合成,探针5’端标记报告荧光染料6-Carboxyfluorescein(FAM), 3’端标记淬灭荧光染料TAMRA,PCR产物长度为162bp。上游引物5’-GAAAA TAAA GTA2 AAA GGGGAA GCC-3’;下游引物5’-A TCAA T2 CA GAC GACCA GT GTA T TC-3’;探针5’(FAM)-A GGC GT T GT T GTA T T GCCAA GT GGT T(TAM2 RA)-3’。

1.1.5　主要试剂与仪器:DNA提取试剂盒(E.Z.N.

A.Water/Soil DNA K it,Omega公司)、RealMaster Mix(Probe)定量PCR反应体系(北京天根公司)、二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)、AB I7500型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.2　方法

1.2.1　菌种模板制备:将嗜肺军团菌及非嗜肺军团菌种于BC YE平板上,36℃、5%CO2培养3d后,挑取单个菌落,稀释,装于1ml蒸馏水的灭菌试管内,将菌液100℃煮沸10min,置于4℃冰箱备用。绿脓杆菌、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌种于普通营养琼脂平板上培养后,处理方法同上。

1.2.2　环境样本模板的制备:冷却塔水样2份,用装有少量硫代硫酸钠的灭菌玻璃瓶采集水样500ml, 0.45μm滤膜过滤后用E.Z.N.A.Water DNA K it提取核酸,置于4℃冰箱备用;采集冷却塔底泥2份、冷却塔旁及空调过滤网积尘各4份,用E.Z.N.A.Soil DNA K it提取核酸,置于4℃冰箱备用。

1.2.3　荧光定量PCR扩增体系和反应条件:总反应体系为25μl,包括2×RealMaster Mix10μl、上游引物(25p mol/μl)0.5μl、下游引物(25p mol/μl)0.5μl、探针(25p mol/μl)0.25μl、20×Probe Enhance Solution 1.25μl、模板DNA2μl、dd H2O10.5μl。反应条件为94℃预变性4min,94℃变性20s,60℃退火延伸60s,进行40个循环。

1.2.4　荧光定量PCR 方法验证:①特异性验证,2株

嗜肺军团菌、3株非嗜肺军团菌及5株其他菌株(绿脓

杆菌、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌)DNA 模板,用上述荧光定量PCR 反应体系进行检测,验证方法的特异性。②敏感性验证,将质粒标准品依次10倍稀释为2.93×109、2.93×108、2.93×107、2.93×106、2.93×105、2.93×104、2.93×103、2.93×102和2.93×10copies/μl 的9个浓度梯度,对每个浓度样品做3次重复检测,制作标准曲线。③重复性检验,取上述4个不同浓度的质粒标准品结果,计算Ct 值变异系数验证检测体系的稳定性。1.2.5　荧光定量PCR 阳性结果的判定:荧光定量PCR 检测以Ct 值<37并且扩增曲线呈S 型为阳性判定原则。其中Ct 值35～37之间的进行重复检测,2次检测均能得到良好的S 型扩增曲线方可判定为阳性。1.2.6　环境样品检测:以上述2份冷却水水样、2份冷却塔底泥、8份土样提取的DNA 为模板,进行荧光定量PCR 检测。1.2.7　数据处理:使用AB I 7500System SDS Soft 2ware 1.4进行处理分析。

2　结果

2.1　特异性　荧光定量PCR 检测2株嗜肺军团菌、3

株非嗜肺军团菌及5株其他非军团菌菌株培养物处理后,经荧光定量PCR 检测,结果见图1。其中曲线1

为A TCC33152(L P1),曲线2为L P3,其他曲线包括3株非嗜肺军团菌、5株其他菌株及dd H 2O ;从中可见本反应体系对嗜肺军团菌有良好的特异性,而对非嗜肺军团菌及其他菌株和阴性对照均为阴性结果

。

图1　荧光定量PCR 检测嗜肺军团菌的特异性

2.2　敏感性　采用荧光定量PCR 检测嗜肺军团菌,

将质粒标准品稀释成9个不同浓度梯度(浓度由高到低为2.93×109、2.93×108、2.93×107、2.93×106、2.93×105、2.93×104、2.93×103、2.93×102、2.93×10copies/μl )。结果显示,该荧光定量方法的敏感性达

到293copies/μl ,见图2。以荧光强度的对数值为横

坐标,循环数为纵坐标作图,标准曲线方程为Y =

-3.5171log (X )+54.1472,扩增效率为92.44%,R 2=0.996,见图3

。

图2　荧光定量PCR

检测嗜肺军团菌的敏感性

图3　质粒标准品标准曲线

2.3　重复性　荧光定量PCR 检测嗜肺军团菌,取10

倍系列稀释的质粒标准品中4个不同浓度梯度(浓度由高到低为2.93×106、2.93×105、2.93×104、2.93×103copies/μl ),每个浓度做3个重复试验,计算各浓度Ct 值的变异系数,分别为0.986%、1.211%、0.213%、0.377%,证实该方法具有较好的重复性,见图4

。

图4　不同浓度质粒标准品检测重复性

2.4　环境样品检测　2份环境样本经荧光定量PCR

检测嗜肺军团菌结果(阳性数/采样数)为:冷却水2/2,浓度值237.28、24.18copy/μl ;冷却塔底泥2/2,浓度值1028.17、663.48copy/μl ;冷却塔旁土1/4,浓度值74.30copy/μl ;空调过滤网积尘0/4。

3　讨论

本次研究针对嗜肺军团菌mip 基因保守序列使

用Primer Exp ress 软件设计引物和探针,经过筛选后得到最佳的引物和探针,并经过12次预实验优化最终确定反应体系,取得了较满意的结果。实验显示,本方法有较好的特异性,与对照菌株未发现交叉反应;灵敏度高,利用质粒标准品验证该方法敏感性达293cop 2ies/μl ;稳定性好,4个不同浓度每个重复3次实验,Ct 值变异系数较小;实行完全闭管式操作,减少了扩增产物的交叉污染;操作简单,无需凝胶电泳,结果判别直观明了,使用ABI7500整个过程(加样在内)仅需2h ,较培养法而言大大减少了检测时间。

集中空调冷却塔一直以来是最为关注的军团菌污染源,多次军团菌病爆发最终溯源到冷却塔。本次研究采集的冷却塔水和底泥各2份均为阳性,同时4份塔旁土中1份阳性,空调过滤网4份样品中0份阳性,与相关文献报道相类似[6～8]。同时,由冷却塔底泥、冷却水、塔旁土到空调过滤网,嗜肺军团菌浓度呈现逐级递减趋势,符合传播特点。

本研究所建立的方法,可以用于环境样本中嗜肺军团菌的快速检测,与培养法同步应用,可以克服培养法耗时过长的不足,为军团菌污染事件应急处理提供技术支持,是一种快速、敏感、特异的有效检测方法。

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?专题论著?

应用rep -PCR 微生物源方法追踪夏秋季桂五水库

粪便污染来源

李伟伟1,陈晓东2,顾玲2,丁震2,汪华2

(1.连云港市疾病预防控制中心,　江苏连云港　222003;2.江苏省疾病预防控制中心,　江苏南京　210029)

DOI :10.3969/j.issn.1006-9070.2010.03.003基金项目:江苏省“333工程”培养资金资助项目收稿日期:2010-03-22

作者简介:李伟伟(1982—

),女,江苏连云港人,医师。 【摘　要】　目的:应用重复序列聚合酶链反应(rep -PCR )微生物源追踪方法,追踪夏秋季江苏桂五水库的粪便污染来源追踪。方法:采集已知来源的人和动物粪便标本以及夏秋两季水样标本,分离并确认指示菌大肠杆菌,以BOXA1R 为引物进行PCR 扩增;用Bionumerics 4.0软件对rep -PCR 基因指纹图进行判别分析和多元方差分析并计算各源种类的正确归类率。结果:10、5、3和2分类法平均正确归类率分别为68.13%、74.76%、82.36%和86.03%。判别分析和多元方差分析结果显示

rep -PCR 基因指纹图能将已知源不同来源指示菌区分开。水样中主要粪便污染来源为人、鸡和牛。结论:建立的rep -PCR

微生物源追踪方法能较好地区分水体中指示菌的不同来源,水体标本监测显示桂五水库粪便污染来源种类多,其中人、鸡和牛相对较多,提示应对桂五水库地区加强人、家禽和家畜动物粪便的无害化管理。