细胞培养与细胞生物学常用技术

细胞培养与细胞生物学

常用技术

实验一软琼脂克隆形成 (2)

实验二细胞划痕愈合 (4)

实验三细胞活力检测 (6)

实验四细胞免疫荧光 (8)

实验五细胞转染 (12)

实验六细胞总RNA提取 (15)

实验七逆转录反应 (18)

实验八Real Time PCR (20)

实验一软琼脂克隆形成

【原理】

正常情况下，贴壁生长的细胞必须依附在固体基质上才能生长，将其悬浮于液体或半固体基质中培养则难以增殖，这种现象称为锚定依赖性生长（anchorage dependent growth）。而某些细胞在在被转化后，例如恶性肿瘤细胞，可以不依赖固体基质，在半固体（琼脂、甲基纤维素）培养基中也可增殖并形成细胞集落，这种现象称为锚定非依赖性生长（anchorage independent growth）。锚定非依赖性生长是肿瘤细胞的一种标识，也是检测恶性转化细胞较为准确的标志之一。软琼脂克隆形成技术，则是在体外水平检测肿瘤细胞和转化细胞系锚定非依赖性生长能力最常用的手段之一。该技术利用低熔点琼脂糖模拟体内细胞所处的半固体状态，并将细胞消化成单细胞，使细胞处于不贴壁及单细胞状态。经过三周左右的生长，通过比较克隆形成率，来比较不同细胞或同一种细胞在不同的处理之后的转化及锚定非依赖生长的能力。因此，软琼脂克隆形成实验是肿瘤研究领域一种重要的体外检测技术。

【材料】

1、仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、高压灭菌锅、水浴锅；

2、试剂：DMEM培养基、胎牛血清、无水乙醇、75%乙醇、PBS 溶液、0.25%胰酶溶液、低熔点琼脂糖；

3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

1、配制1.2%和0.7%的低熔点琼脂糖，高压灭菌后置于42℃水浴锅（或者恒温温箱）中，使其保持融化状态；

2、配制2x DMEM培养基（含20%FBS、2x抗生素），37℃预热；

3、将1.2%的低熔点琼脂糖胶与2x DMED培养基等体积混合，将混合液加入到6孔板中，每孔1.5mL，轻轻混匀，避免产生气泡，室温放置待其凝固；

4、取对数生长期的细胞，胰酶消化后尽量吹散细胞，制成单细胞悬液，取出10μL，细胞悬液进行细胞计数，用无血清培养基稀释细胞至1x104个/mL；

5、待下层胶完全凝固后，各取1.5mL的0.7%琼脂糖胶与2x培养基进行等体积混合，加入300μL细胞悬液，充分混匀后入6孔板中，每孔1mL（即1000个细胞/孔），每种细胞设置3个平行孔；

6、将6孔板置于CO2培养箱中孵育培养2-3周后，每孔加入1mL 0.1%结晶紫染色，室温染色10min，再用清水洗30min，镜下拍照，计数并分析克隆形成情况。

实验二细胞划痕愈合

【原理】

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫应答、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。细胞划痕愈合实验（wound healing）简称划痕实验，是最早用来研究细胞迁移的体外实验，操作简单，经济实惠，因而被广泛应用。

细胞划痕愈合的操作过程十分简单，基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。具体过程为：当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”；然后置于显微镜下连续拍照，记录划痕边缘的细胞逐渐进入空白区域，即“划痕”愈合的过程，最后根据“划痕”愈合的速率反映细胞迁移的速率。

【材料】

1、仪器：CO2培养箱、活细胞工作站、超净工作台、酒精灯；

2、试剂及耗材：DMEM培养基、胎牛血清、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、30mm直径细胞培养皿、尺子、记号笔；

3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

1、培养皿接种细胞前，先用直尺测量，并在培养皿背面做“横

线”标记，大约每隔0.5～1.0cm一条，一共5条线；

2、取处于指数生长的细胞，胰酶消化后收集细胞沉淀，细胞计数后稀释至2.5x105个/mL；

3、取背面做好标记的培养皿（直径30mm），每皿接种2mL细胞，置于培养箱培养34h；

4、取出细胞培养皿，用10μL枪头比着直尺，垂直于底面的横线划痕；

5、加入1mL PBS缓冲液，清洗细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片；

6、加入2mL无血清培养基，置于活细胞工作站下拍照24h，每小时拍一张照片；

7、根据收集图片数据分析实验结果，计数细胞迁移率。

迁移率=【（T0时划痕宽度值-Tt时划痕宽度值）/T0时划痕宽度值】x100%

实验三细胞活力检测

【原理】

最常用的细胞活力检测方法为噻唑蓝比色法（MTT法）。MTT全称为3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶可以将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，但死细胞没有此功能，因此结晶形成的量与活细胞数成正比。DMSO 能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。由于该方法灵敏度较高，而且相对比较经济，因此广泛应用于药物筛选等细胞毒性检测领域。

【材料】

1、仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、多功能酶标仪；

2、试剂：细胞培养基、胎牛血清、MTT（5mg/mL）、DMSO、75%乙醇、PBS溶液、顺铂母液

3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

一、细胞接种

1、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，吸弃培养基，PBS洗涤2次，胰酶消化后，加入培养基重悬细胞并转移至离心管中；

2、800rpm离心2min，弃上清；

3、加入3～5mL新鲜培养基重悬细胞（以25cm2培养瓶为例），吸取10μL细胞悬液，滴加至血球计数板上进行细胞计数；

4、根据细胞计数结果，将细胞浓度稀释至4x104个/mL；

5、将细胞悬液按100μL/孔加至96孔细胞培养板；

6、将96孔板置于CO2培养箱中孵育培养过夜。

二、细胞荷药

1、用新鲜培养基将5mM顺铂母液的药物浓度稀释至15μM；

2、从CO2培养箱中取出96孔板，吸弃培养基，实验组更换为上述含药物的新鲜培养基，对照组更换为新鲜培养基；

3、将96孔板置于CO2培养箱中继续孵育培养24h。

三、MTT法检测

1、从CO2培养箱中取出96孔板，吸弃培养基，每孔加入90μL 新鲜培养基及10μL 5mg/mL MTT；

2、将96孔板置于CO2培养箱中继续孵育培养4h；

3、吸弃培养基，每孔加入100μL DMSO，震荡混匀10min；

4、用酶标仪测定490nm处的吸光值（A490），计算细胞活力。

实验四细胞免疫荧光

【原理】

免疫细胞化学（immunohistochemistry），是利用抗原抗体间特异性结合的原理，同时借助特殊的标记技术，实现对细胞内目的抗原或抗体进行定位、定性或定量检测的一种技术。它不仅特异性强、灵敏度高，而且克服了传统免疫学检测技术只能定性和定量，而不能定位的缺点，可以实现定性定量的同时对目的蛋白进行精确定位，因此又被称为原位免疫检测技术。也正由于具备这些优势，免疫细胞化学技术已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等诸多领域中得以被广泛应用。

免疫细胞化学技术有多种染色方式，根据标记物的种类，分为免疫荧光法、免疫酶标法、免疫铁蛋白法及免疫胶体金发等。其中，免疫荧光法结合激光共聚焦扫描显微镜拍照技术，大大提高了检测分辨率，可以更为精确地检测抗原的细胞定位及分布。目前可选用的荧光素较多，其中较为成熟的荧光素标记物包括异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamin isothiocyanate，TRITC）、四乙基罗丹明（rhodamine，RB200）等，更有利于实现同时对两种或多种抗原进行检测，即双染和多染技术。另外，免疫荧光可以对活细胞进行染色，在流式细胞术（flowcytomitry，FCW）方面有更多的应用，因而成为最为常用的免疫细胞化学技术之一。

免疫荧光技术是先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种

荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，受激发光的照射后，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态的过程中可以发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。根据荧光素标记的位置，可以分为直接法与间接法。直接法是最早的标记方法，是利用荧光素直接标记待测蛋白第一抗体的标记方法，这种方法特异性高，但灵敏度较低，而且每种抗体均需要单独标记，十分不便且成本相对较高，因此逐渐被其他方法所替代；间接法是对直接法的改进，它不再标记直接与抗原结合的特异性一抗，而是标记与一抗结合的二抗，由于与一抗结合的二抗分子往往不是一个，因此间接法可以大大提高检测的灵敏度，与直接法相比，荧光亮度可增强3-4倍。除灵敏度高外，间接法所需要的种属间接荧光抗体，可以适用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示，大大降低了检测成本，因此成为现在最广泛应用的免疫荧光技术之一。

【材料】

1、仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、正置荧光显微镜、高压灭菌锅；

2、试剂：DMEM培养基、胎牛血清、无水乙醇、75%乙醇、PBS 溶液、0.25%胰酶溶液、4%多聚甲醛、P53一抗、FITC荧光二抗、抗荧光衰减封片剂、Triton X-100；

3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

一、准备工作

1、切片处理：将盖玻片置于浓酸浸泡过夜，自来水冲洗20遍，蒸馏水清洗5遍，高压灭菌，烘干备用；

2、细胞悬液制备：胰酶消化HepG2细胞，收集细胞沉淀，培养基重悬，制成单细胞悬液，计数后稀释至2x105个/mL备用。

二、细胞爬片

1、在6孔板孔中央滴加100μL培养基，每孔放入一张经过处理的盖玻片，使其恰好覆盖在孔内培养基上；

2、每孔缓慢逐滴加入2mL稀释后的细胞悬液，轻柔混匀；

3、将6孔板置于CO2孵箱中，培养过夜。三、免疫荧光1、取出6孔板，弃掉孔内培养基，PBS轻柔清洗3次，每次3min；2、每孔加入1mL预冷的4%多聚甲醛，4℃固定20min；3、PBS清洗3次，每次3min；

4、每孔加入1mL含0.2%Triton X-100的PBS，冰上静置10min；

5、PBS清洗3次，每次3min；

6、每孔加入1mL含1%BSA的PBS，室温封闭1h；

7、将P53一抗以1:100的比例稀释后，取出100μL滴加在封口膜上，从培养孔中取出盖玻片，用吸水纸吸去背面及细胞面边缘处的液体后，轻轻放在封口膜上，细胞面与抗体均匀接触，4℃孵育过夜；

8、取下盖玻片，置于6孔板相应孔中，PBS清洗3次，每次3min；

9、滴加荧光素二抗，37℃孵育30min（注意避光操作）；

10、PBS清洗3次，每次3min；

11、每孔加入500μL DAPI染色液，室温染色5min；

12、PBS清洗3次，每次3min；

13、取一张洁净载玻片，中心位置滴加50μL抗荧光淬灭封片剂，从6孔板中取出盖玻片，控干液体，贴有细胞的一面朝下，放置在封片液上，尽量避免气泡；14、显微镜下观察、拍照。

实验五细胞转染

【原理】

细胞转染是将外源DNA或RNA导入真核细胞，用来研究真核细胞基因功能、基因表达调控和蛋白质表达的专门技术。

根据实验目的，细胞转染技术分为两大类吗，分别为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，不整合到宿主染色体上，以游离的形式存在，一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，因此可产生高水平的表达。但由于无法复制，表达时间有限，仅持续2-4天，最终在细胞分裂过程中逐渐丢失。稳定转染则是指外源基因整合到宿主细胞染色体上，成为宿主细胞基因组的一部分，可以复制并稳定地遗传给子代细胞，形成稳定转染的细胞株。因此，瞬时转染一般用于短期研究，例如研究基于或基于产物的短期表达，基于敲出或RNA介导的基于沉默，以及蛋白质小规模表达等；稳定转染则用于需要基因长期持续的表达情况，例如大规模蛋白表达、长期药理学研究、基因治疗研究和长期遗传调控机制研究等。相较于瞬时转染，稳定转染所需要时间更长，成本更高。

细胞转染过程中，仅有部分细胞可以成功转入外源基因，这部分细胞占总细胞的百分比被称为转染效率。影响转染效率的因素很多，其中包括：细胞培养基、细胞状态、细胞密度、DNA质量、血清含量、抗生素、DNA质量（μg）/转染试剂体积（μL）比、转染方法等。一般情况下，处于指数生长中后期的细胞，生长状态越良好越容易转染；细胞密度最好控制在70%-90%之间；血清的存在会影响DNA-转

染复合物的形成；转染过程中使用抗生素可能增加细胞的死亡率；推荐DNA质量（μg）/转染试剂体积（μL）比为1:2～1:3；DNA质量对转染效率影响非常大，DNA不纯，如带少量的盐离子、蛋白、脂多糖、内毒素等都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行；转染技术较多但各有利弊，如DEAE右旋糖苷法、磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法等。目前最为常用的方法为脂质体法、病毒介导法及电穿孔法。脂质体法是利用带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，沉积于细胞表面，通过内吞作用进入细胞，这种方法几乎适用于所以细胞，转染效率高，适用于稳定转染尤其适用于一些难转染的细胞，例如原代细胞、活体细胞等，但需要考虑安全因素；电穿孔法利用短暂的高电场电脉冲处理细胞，破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔进入细胞，可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪，而且此方法对细胞损伤很大，细胞的死亡率高，每次转染需要大量的细胞和DNA。本实验采用多价阳离子脂质体介导的瞬时转染方法。

【材料】

1、仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、离心机、血球计数板、计数器；

2、试剂：细胞培养基、胎牛血清、Lipofectamine?2000、75%乙醇、PBS缓冲液、0.25%胰酶溶液、质粒（pcDNA3.1（-）空载体、pcDNA3.1（-）-P53重组载体、pEGFP-C1空载体）；

3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

一、细胞接种

1、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，吸弃培养基，PBS洗涤2次，胰酶消化后，加入培养基重悬细胞并转移至离心管中；

2、800rpm离心2min，弃上清；

3、加入3～5mL新鲜培养基重悬细胞（以25cm2培养瓶为例），吸取10μL细胞悬液，滴加至血球计数板上进行细胞计数；

4、根据细胞计数结果，将细胞浓度稀释至2x105个/mL；

5、按2mL/孔将细胞悬液加入至6孔细胞培养板；

6、将6孔板置于CO2培养箱中孵育培养过夜。

二、细胞转染

1、配制A液：2.5μg质粒DNA加入到100μL Opti-EME培养基（或无血清培养基）配成A液，上下颠倒混匀，孵育5min；

2、配制B液：将7.5μL的Lipofectamine ? 2000加至100μL Opti-EME培养基（或无血清培养基）配成B液，上下颠倒混匀，孵育5min；

3、配制C液：将A液加入B液，充分混匀为C液，室温孵育15min；

4、在孵育过程中，取出过夜培养于6孔板的HepG2细胞，弃掉培养基，每孔加入2mL新鲜培养基（不含双抗）；

5、孵育结束后，每孔加入500μL C液，逐滴多位置加入，轻轻摇动6孔板；

6、置37℃培养箱孵育；

7、孵育6小时后，更换新鲜培养基（不含双抗）。

实验六细胞总RNA提取

【原理】

利用高浓度强变性剂异硫氰酸胍迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核中的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子解离。同时，高浓度异硫氰酸胍和β-巯基乙醇还可以使细胞内的各种RNA酶失活，保护释放出的RNA不被降解。细胞裂解后的裂解溶液内除RNA 以外，还有核DNA、蛋白质以及细胞残片，通过氯仿等有机溶剂抽提、离心，可将RNA与其它细胞组份分离开来，得到纯化的总RNA。TRIzol 是一种抽提总RNA的复合试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破坏细胞，抑制细胞释放出RNA酶，适用于多种组织和细胞总RNA的提取。

【材料】

1、试剂：TRIzol、RNase-free水、氯仿、异丙醇、75%乙醇、PBS 缓冲液；

2、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

一、准备工作

1、操作人员：戴口罩、手套；

2、工作区域：实验室事先经紫外线照射过夜，实验开始前用75%乙醇擦拭台面。实验过程中不要随意接触非实验物品并尽量减少走动；

3、实验器具：用75%乙醇擦拭移液器和EP管架；低温离心机预冷；-20℃预冷的75%乙醇。

二、总RNA的提取

1、从CO2培养箱中取出实验五转染过的6孔板，倒置显微镜下观察细胞生长状态；

2、吸弃培养基，PBS洗涤2次；

3、按1mL/孔加入TRIzol试剂，使其充分接触细胞，室温静置2min；

4、用移液器轻轻吹起细胞，将细胞悬液转移至无RNase的1.5mL EP管中；

5、按0.2mL/1mL TRIzol比例加入氯仿，盖紧EP管盖，用手剧烈震荡混匀，直至溶液呈乳白色，无分相现象；

6、室温静置5min，4℃12000rpm离心15min（离心过程中，准备新的1.5mL EP管）；

7、从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分为三层，上层是透明的水相，RNA溶解在此层中；半固体状的中间层，此层含有DNA；下层为粉红色的有机相，蛋白质、多糖等物质溶解在此层中；

8、将上层溶液小心转移至新的EP管中，每个EP管中约能取出400μL（要求谨慎操作，切勿吸到中间层）；

9、往水相中加入等体积异丙醇（纯化RNA），上下颠倒EP管，充分混匀；

10、室温静置10min后，4℃12000rpm离心15min；

11、小心弃去上清，白色沉淀即为总RNA；向含有沉淀的EP管中加入1mL -20℃预冷的75%乙醇，轻轻上下颠倒，洗涤沉淀；

12、4℃12000rpm离心5min；

13、用移液器除去上清，尽量不要接触沉淀；

14、将EP管再次瞬时离心，用移液器将残存在EP管底部的少量液体除去；

15、打开EP管盖，室温放置5min干燥（时间太长，RNA不易溶解）；

16、用30μL RNase-free水溶解沉淀；

17、RNA溶液保存在-80℃冰箱中；

三、RNA质量检测

1、吸光度测定方法

①原理：核酸在260nm附近有强吸收，蛋白质在280nm附近有强吸收，因此常利用此性质，使用紫外分光光度计测定核酸溶液在260nm和280nm下的吸光度，根据A260的吸光度，计算提取的核酸收量，根据A260/A280的比值来评价提取的核酸纯度。理想的RNA 纯度A260/A280应在1.8～2.2范围内；

②步骤：按照1:50的比例，用RNase-free水稀释RNA样品；利用分光光度计测定260nm、280nm及320nm波长下的光密度，计算其A260/A280的比值和RNA浓度；RNA浓度计算公式如下：RNA浓度（μg/μL）=（A260-A320）x稀释倍数x0.04；

2、凝胶电泳方法

①原理：根据1%琼脂糖凝胶电泳（总RNA上样量1000ng左右）结果，对提取的总RNA进行RNA完整性以及是否有基因组DNA污染的评价；如果可以清晰观察到两条rRNA条带（真核生物：28S和18S；

原核生物：23S和16S），且其浓度比值大约为2:1～1:1，则RNA未降解，否则有部分降解；若观察到smear，则RNA已发生完全降解；如果观察到大于28S或23S的条带，则样品可能有基因组污染，这时可以考虑使用DNaseⅠ处理。

(完整版)分子生物学实验技术考试题(卷)库

一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。

11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合

细胞生物学常用研究方法

Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信

高中生物动物细胞培养和核移植技术教案新人教版选修3

动物细胞培养和核移植技术备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课教学目标知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。过程与方法情感态度与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯物主义观念。教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。教学用具多媒体课件课时安排1课时教学内容设计与反思板书设计:

教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。（1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养植物体细胞杂交（2）植物体细胞杂交的结果是产生了？（3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？二、讲授新课: （一）动物细胞工程动物细胞工程常用的技术手段动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。（二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程：引导学生阅读课文44--46面相关内容。

大规模细胞培养技术

大规模细胞培养技术简介大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物

(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告

一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗：硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水；冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工

(完整版)第三章细胞生物学研究方法总结

第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法分辨率：肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术（light microscopy ）（一）普通复式光学显微镜技术 a ．光学放大系统：目镜和物镜光镜照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片组成机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sinα/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备：固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm）、染色（二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1．FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2．不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。（三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2．共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。（四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ）光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微小差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。二、电子显微镜技术（electron microscope ）（一）电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数：分辨率0.2nm ，比肉眼放大有效放大倍数分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜电子束照明系统：电子枪、聚光镜基本构造成像系统：物镜、中间镜、投影镜等真空系统：用两级真空泵不断抽气记录系统：荧光屏或感光胶片成像（二）主要电镜制样技术介绍

动物细胞培养技术思考题

《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。你认为精确配制各种溶液？答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。

MDCK细胞培养基本技术方法 -2011本

MDCK细胞培养一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。三、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。（二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。（三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。

5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。

常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍

常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。固相杂交固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。斑步杂交（dot hybridization）是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA 变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显

动物细胞培养及应用发展史

细胞培养技术

细胞培养发展史及其应用（一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。（二）细胞培养技术及其历史细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。

动物细胞培养技术实验

实验十五动物细胞培养技术及其应用一．实验目的通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。四．实验方法与步骤（一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。胰蛋白酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛血清。细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,

细胞培养技术

细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。定义培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。在现代医学和生物科学研究中应用广泛优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。缺点组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。细胞类型细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。起源：细胞来自中胚层间充质组织。除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。

第三章细胞生物学研究方法总结

第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法分辨率：肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术（light microscopy ）（一）普通复式光学显微镜技术 a ．光学放大系统：目镜和物镜光镜照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片组成机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sin α/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备：固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm ）、染色（二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1． FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2．不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。（三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2．共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。（四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ）光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微小差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。二、电子显微镜技术（electron microscope ）（一）电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数：分辨率0.2nm ，比肉眼放大分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜电子束照明系统：电子枪、聚光镜基本构造成像系统：物镜、中间镜、投影镜等真空系统：用两级真空泵不断抽气记录系统：荧光屏或感光胶片成像（二）主要电镜制样技术介绍制样要求：①要求样品很薄（数十纳米） ②要求保持精细结构 1．超薄切片技术 ①固定：保持样品形态结构，甚至超微和分子水平上结构。固定剂：常用饿酸（OsO 4）和戊二醛等，另外有物理方法如高频微波。

细胞生物学实验方法与技术

第二节细胞生物学实验方法与技术细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。一、细胞培养常用方法 1、细胞原代培养（primay culture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。 2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。二、器官培养方法器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。三、放射自显影术测定放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。四、染色体分析技术染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础； 3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体

细胞培养技术

第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 ●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 ●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 ●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。二、体内、外细胞的差异和分化 1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2.分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。第二节细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应

细胞生物学技术

第二章第三章第四章电镜 1.电镜、分辨率、透射电子、二次电子、电子束、超薄切片、免疫电镜技术电镜：以电电子束为光源，电磁场为透镜，利用电子散射产生的信号进行显微成像的具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构分辨率：用于表示人眼和光学仪器能够辨别的两点之间最小距离的标志。人0.2mm，光镜0.2um。分辨率是衡量电镜性能的重要指标。透射电子：当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子。（利用透射电子信息成像的称为透射电镜）二次电子：在入射电子的轰击下,样品表面5-50 nm 深度激发出来的电子称为二次电子。（利用二次电子信息成像的称为扫描电镜）电子束：又称电子射线，电子束带负电荷，具有光的波动性、可折射性。电镜利用电子束作为“光源”成像。超薄切片：将环氧树脂包埋的组织块切成100nm以下的薄切片称为超薄切片，超薄切片经电子染色后在TEM下观察组织细胞内部的超微结构。 immune electron microscopy：免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。 2.电镜在医学领域的应用观察细胞器和组织器官的超微结构；观察病毒和细菌等；观察组织细胞超微病理结构；用于临床疾病的诊断；观察生物材料复合体及模式生物等 3. 从分辨率、放大倍率、成像信号、样品制备、图像特点和应用几方面对透射电镜和扫描电镜进行比较 TEM分辨率为0.1nm，放大倍率是100万倍，成像信号为透射电子信号成像，样品制备过程复杂，要制成50～100nm的超薄切片，图像特点为二维结构，平面图像，TEM用于观察组织细胞内部的超微结构。 SEM分辨率为0.6nm，放大倍率是80万倍，成像信号为二次电子信号成像，样品制备方法较简单，标本可大而厚，图像特点为三维结构图像，立体感较强，SEM 用于观察样品表面及其断面立体形貌。

细胞培养技术复习资料(全)题库

名词解释：细胞组织培养：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。二倍体细胞株：具有二倍体染色体数的细胞株。细胞组织培养选材：根据实验目的、观察指标确定所选组织器官。培养选材一般来自胚胎组织的培养物；比成体组织更易生存和生长。这主要是因为胚胎组织有更多的胚胎组织干细胞，它们具有更高的自我更新和多能分化能力。原代培养：一般指从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养。这种培养通常是异质性，生长缓慢，但比较能代表原组织的类型并表达原组织特性。缺点是在培养过程中会失去许多原组织的细胞。传代细胞：原代细胞生长物或细胞系生长到一定阶段，分散成单个细胞，按一定比例接种于新的培养容器内称之传代。传代细胞称之细胞系，可分为两类：有限细胞系和连续细胞系。传代形成的具有各自生物特性或标志的细胞系称之为细胞株。世代：指细胞经过一次分裂后完成后至下次分裂的过程。细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。细胞纯化：是指从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞分离和纯化得到细胞株或系。传代：也称为再培养，把一瓶培养细胞全部或分成几份再培养的过程。组织工程：组织工程是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 Density inhibition:密度抑制，由于细胞密度过大，培养液营养耗尽、代谢产物过多和生存空间消失所引起细胞增殖的抑制现象。消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。平衡盐溶液（BSS）：集缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体，兼具维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度，同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用，常用的BSS有PBS、Hanks等。清洁液：是一种不含磨蚀性物质，能迅速清除物品上污垢,分解脏污，令物品透明亮如的清洁用品。去分化：指已分化成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态。但去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态，可重新表现出分化特点。接触抑制：指细胞相互接触后失去运动（移动）的现象。细胞融合：细胞融合是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。可在自发或人工诱导下发生。它可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达相应的功能，这样的细胞称异核体，若异核体出现有丝分裂时，则可使两个不同来源的细胞核的染色体汇聚，形成合并有亲本的大核，这样的细胞称为杂种细胞或杂交细胞。转化细胞系：通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化细胞系具有长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低的特点，适于大规模工业化生产。 Stem cell:干细胞，是指一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞。