ImageJ 对Western Blot进行灰度分析

I m a g e J对W e s t e r n b l o t条带进行灰度分析

Image J软件：Windows 版本

第一步：软件安装

1.下载地址：

2.下载windows 32位带Java版本，双击软件安装。

第二步：界面介绍

1.软件界面

第三步：图片分析

1.下图为样板图片

2.导入图片：File> Open>

图片导入后，在新的窗口中打开

3.图片类型设置：Image> Type> 8 bit

4.去除图片背景：Process> Subtract Background> …

4.1Subtract Background 窗口：Rolling ball radius 设为50 pixels，勾选

light background，可选preview，点击“OK”确定

5.工具栏:选择“矩形选框”

6.最大化“”窗口，便于矩形选择，矩形选择第一个泳道

7.标记“矩形选框”为1：矩形选择后，调整矩形至合适大小，按下数字键

“1”，或者Analyze> Gels> Select Fist Lane。

8.选择“泳道2”：拖动“1”的矩形框，会出现两个矩形选框，拖动矩形框至泳

道2，调整位置，并按下数字键“2”，Image J 会自动调整大小使“矩形框

2”与“矩形框1”保持同一水平。

9.继续拖动，会出项新的“矩形选框”，调增至泳道3，并按下数字键“2”（注

意：是按下数字键“2”），重复9至6个泳道全部选择。

10.所有泳道选择后，按下数字键“3”，出现分析图谱。

11.“直线”封闭峰：工具栏选择“直线”，从起峰处至落峰处。

11.计算峰值：工具栏> Wand(tracing) tool,点下刚才封闭的区域，峰值结果出现

在新的窗口中。

计算结果：

12.其他泳道，以此类推，本文原创，

用ImageJ对Western DNA和Blot图片灰度分析

用ImageJ对W estern Blot图片灰度分析教程收集于互联网来源中生网 The good news is that even if you don't have access t o a photo editing program such as Photoshop, you can now do all the same analyses using free programs. My favorite option is the freely available ImageJ from the National Institut es of Health. The homepage for ImageJ is here: https://www.360docs.net/doc/b12677793.html,/ij/index.html wherein you can find links t o the download, document ation, additional plugins and so on. Once ImageJ is inst alled, open it up and open your scanned film file. We'll start the ImageJ section by duplicating the method outlined above for Phot oshop. 1. Open your file. 2. Under Image>Type click on 8-bit t o convert the image to grayscale. 3. Go to the menu Process>Subt ract Background. Try a rolling ball radius of 50. This removes some of the background coloration from your image. 4. Go to Analyze>Set Measurements, and click the boxes for Area, Mean Gray Value, and Int egrated D ensit y. 5. Go to Analyze>Set Scale, and ent er "pixels" in the box next t o Unit of length. 6. Go to Edit>Invert (or hit Ct rl+Shift+I) t o invert the colors on the image. Now the dark areas are light, and the light areas are dark. As outlined above, this has the benefit of making the measured values for bands increase with increasing prot ein expression. 7. Choose the F reehand Selection tool from the t ool palette. 8. Draw a line around the boundary of your first band. As above, you need to use your own judgement about

ImageJ对WesternBlot进行灰度分析

Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件：Windows 版本第一步：软件安装 1.下载地址：https://www.360docs.net/doc/b12677793.html,/ij/download.html 2.下载windows 32位带Java版本，双击软件安装。第二步：界面介绍 1.软件界面第三步：图片分析 1.下图为样板图片 2.导入图片：File> Open> Sample1.jpg 图片导入后，Sample1.jpg在新的窗口中打开

3.图片类型设置：Image> Type> 8 bit 4.去除图片背景：Process> Subtract Background> …

4.1Subtract Background 窗口：Rolling ball radius 设为50 pixels，勾选light background，可选preview，点击“OK”确定 5.工具栏:选择“矩形选框”

6.最大化“Sample1.jpg”窗口，便于矩形选择，矩形选择第一个泳道 7.标记“矩形选框”为1：矩形选择后，调整矩形至合适大小，按下数字键 “1”，或者Analyze> Gels> Select Fist Lane。 8.选择“泳道2”：拖动“1”的矩形框，会出现两个矩形选框，拖动矩形框至泳道2，调整位置，并按下数字键“2”，Image J 会自动调整大小使“矩形框2”与“矩形框1”保持同一水平。 9.继续拖动，会出项新的“矩形选框”，调增至泳道3，并按下数字键“2” （注意：是按下数字键“2”），重复9至6个泳道全部选择。 10.所有泳道选择后，按下数字键“3”，出现分析图谱。

imagej荧光定量方法

1、安装后首先打开ImageJ： 2、 3、 4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。因此我们 5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK 点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages 6、量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK 7、只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK 在弹出来的界面点击OK 9、 10、记录数据并计算：结果中的Area为选择范围的面积，如果是测量的是细胞的话就是细胞在图中的面积；IntDen就是所选范围的IOD （光密度的总和）。结果界面中的数据可以复制到Excel等软件中进行计算。（/pixel）用IntDen的数值除以Area的数值得出来的就是这张图片中细胞的平均光密度，以这张图片的数据为例，即：同法测量多张图的平均光密度值后就可以进行半定量比较。以下附上分别应用Image-Pro Plus及ImageJ对五张图片进行分析的结果对比：从结果的对比看来ImageJ与IPP（Image-Pro Plus）的分析结果是基本一致的

用imagej进行WB定量分析

ImagJ是一款简单的图像处理与分析软件，可以用来进行WB定量分析。一、利用ImagJ对WB条带进行灰度分析 1、File——》open 打开WB片子 2、把图片转化成灰度图片 image——》type——》8-bit 3、消除背景影响 process——》subtract background 选择50基本可以 4、设置定量参数 analyze——》set measurements，点击面积，平均密度和灰度值及Integrated Density 5、设置单位 analyze——》set scale ，在“unit of length”的方框里输入“pixels” 6、把图片转换成亮带，Edit——》invert 7、选择Freehand Selection，尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值当测定完所有条带，选结果中的“Edit ”的“SelectAll”，然后复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析 8、复制数据IntDen进行分析二、利用ImagJ对WB条带进行密度分析 1、File——》open 打开WB片子 2、如条带不正，需修正 image——》transform——》rotate 调节angle值，直到条带水平为止 3、选中矩形选项，圈中第一个条带，然后analyze——》gels——》select first lane（快捷键ctrl+1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，analyze——》gels——》select second lane（快捷键ctrl+2），最后analyze——》gels——》plotlanes 4、选中直线工具，将开口的波峰关闭 5、选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值 6、以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值为相对密度 The protocol of imageJ for quantitative analysis of Western blotting: - open an image - transfer the image to 8-bits image → type: 8 bits - Process → substract background 50 - analyze → set measurements: pick area, mean gray value, integrated density. - analyze → set scale, fill “unit of length” with “pixels” - switch the image to bright bands edit → invert - freehand selection, choose the target area on the im age (e.g. a band), type a “m” for measurement, then we get the result from a new window. - after measuring all of the bands, pick the “edit” of the result window. “select all”, copy the integrated density values to excel to analyze.

western blot条带分析

近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。 Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。再无，则压过夜。共3张片，根据每次结果调整。其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因- - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1 显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2 信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3 --- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4 - - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5 -- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物*注6 高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7 ---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8 --- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9 --- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足- - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10 ---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长- - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高- - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12

westernblot详细图解

检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

westernblotting蛋白质印迹实验的流程

实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。 2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第

一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。（5）将96孔板取出后用酶标仪测定OD570nm值。（6）根据标准品的OD570nm值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算得到待测样品的蛋白质浓度。蛋白质变性（1）根据预计将要上样的蛋白质样品质量（25μg-50μgμg，是蛋白质而定），取适量体积的蛋白质样品于预冷的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液（体积约为蛋白质样品体积的25%），通过调节上样缓冲液的体积将各样品混合液的终体积调节至相仿。用封口膜将离心管封口，7000r/min离心点离样品混合液3s，使其混合均匀。（2）将放置样品混合液的架子置于盛有适量dd H2O的磁盘中，用电磁炉加温至100℃，煮沸5min。点离样品，使其混合均匀。

WesternBlot结果条带分析

W e s t e r n B l o t结果条带分析 Revised final draft November 26, 2020

W e s t e r n B l o t结果条带全面分析 1.空白原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。 2.高背景原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。 3.非特异性条带原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗 4.条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡 5.出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法：封闭结束之后要洗。 6.条带拖尾原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。 7.出现非均一性背景原因：膜可能曾经干过解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。 8.某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。 9.条带呈哑铃状原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用 10.最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔其他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。（4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。（5）整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好（6）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。（7）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（8）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。

imageJ中文开发教程

ImageJ开发教程（苑永超整理，仅供参考，勿作商业用途）目录一、ImageJ简述 (2) 二、ImageJ内部结构 (3) 三、ImageJ通过插件扩展功能的方法 (4) 三、插件编辑、编译、运行与部署 (6) 四、主要的包介绍 (8) 五、重要类方法介绍 (10) 1、创建图象和图象栈 (10) 2、创建图象处理器 (11) 3、载入和存储图象 (11) 4、图象参数 (11) 5、操作像素 (11) 6、图象转换 (12) 7、直方图与图象统计量 (12) 8、点运算 (12) 9、滤波器 (13) 10、几何运算 (13) 11、图形运算 (14) 12、显示图象和图象栈 (14) 13、图象栈上的操作 (15) 14、感兴趣的区域 (16) 15、图象属性 (17) 16、用户交互 (17) 17、插件 (18) 18、窗口管理 (19) 19、其他函数 (19) 六、学习资源 (20)

ImageJ官网（https://www.360docs.net/doc/b12677793.html,/ij/index.html）上有英文的用户手册和教程，以及一些例子。本教程主要是为看英文比较累的朋友提供一些快速的入门。如果想在ImageJ上开发自己的图象处理算法，建议先熟悉java编程知识。本教程基本不对ImageJ菜单中提供的各种文件操作、图象编辑、图象处理、图象分析等功能作详细介绍，请读者自行探索；也不准备介绍数字图象处理的各种算法和操作，本文假定读者是图象处理方面的专业人士，本教程的重点是如何进行二次开发，如果不特别指出，文中的部分内容和例子都为ImageJ软件包自带或采自相关书籍（如《数字图像处理-java语言描述》），中文注释是后加的。一、ImageJ简述图象处理的流程无外乎就是打开图象数据文件，将图象数据加载到内存，然后对该内存中的图象数据进行一系列处理（分割、检测、滤波、合成、识别、显示等等），最后可能还需要将处理结果保存成某种格式的文件。对于一般的用户来说，类似ACDsee之类的傻瓜式的软件足够了。但是科学人士除了希望有广泛的、成熟的处理算法库可以直接调用外，一般还希望开发自己的特有的图象处理算法、特有的图象处理步骤、甚至特有的交互过程。ImageJ就是这样的工具软件。 ImageJ是基于Java的，ImageJ在设计上实现了一个可以扩展的基本框架，开发人员可以通过其提供的接口来扩展图象处理功能。ImageJ提供了很多现成的功能，这些功能可以通过菜单来调用，也可以调用相应的类的方法的API。用户只要按照接口要求开发好自己的处理模块，并按照要求部署和配置，Image就可以自动加载和调用。 ImageJ是完全开源和免费的，特别适合教学和科研。其关键的特征有： 1、在菜单上集成了一系列的交互式工具，用于创建、加载、编辑、分析、处理、保存图象，支持常见的图象文件格式。目前，ImageJ主菜单上的集成的主要功能： ! File: 打开、保存、创建新的图象文件。 ! Edit:图象的编辑和绘制操作。 ! Image:图象的修改、转换、几何操作。 ! Process:图象的点运算、滤波器、以及多幅图象之间算法操作。 ! Analysze:对图象数据进行统计分析、用直方图或其他格式显示出来。 ! Plugin:编辑、编译、执行、管理用户自己定义的插件。 2、提供简单的插件机制，帮助开发人员专注于自己的图象处理过程的开发，从而扩展ImageJ的功能。 3、提供宏语言或javascript脚本以及解释器，可以通过组合现有的函数，来实现客户化的处理过程。这种方式不需要用户具有Java知识。此外还有一些使用其他脚本语言扩展的方式。用户要想在ImageJ的基础上扩展自己的图象处理功能、进行二次开发，需要了解Image内部结构。

WB灰度值测定

Image J测到了WB条带灰度值关于用Image J量化westernblot条带灰度值，在网上一直盛传着两种操作方法，然鹅～小伙伴们却一直不确定到底哪种才是正确的测量灰度方法，甚至将灰度与光密度弄混淆。今天咱们一起就这个机会学习下，请先看看你是用以下那种方法测量灰度值？以下是两种方法的具体操作。方法一:1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先把条带摆正)2、把图片转化成灰度图片：Image→type→8-bit 3、第一个矩形工具→选上所有条带 4、analyze→Gels→select first lane→Gels→plot lanes（在这第四步也可以分开选取，如：框选第一个条带→analyze→Gels→select firstlane→将第一个框拖移到余下条带→Gels→select nextlane） 5、选中直线工具，将开口波峰关闭

6、选中魔棒工具（正数第七个），点击波峰，就得出所有area值。方法二 1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先条带弄正) 2、把图片转化成灰度图片：Image→type→8-bit 3、扣除背景：Process→Subtract Background→50pixels 并勾选Light Background 5、设定参数：Analyze→set measurement→勾选Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density 6、Analyze→set scale→unit of length选项里改为pixels，确定

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法类似方法2 Northern Blot 杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

imagej荧光定量方法

1、安装后首先打开ImageJ： 2、打开要分析图片：File>open（热键为Ctrl+O） 3、转换成8bit的灰度图：Image>Type>8-bit 4、黑白反转（因为对于光密度（OD）来说越白数值越小，纯白为0；越黑数值越大，纯黑理论上是无限大。因此我们需要将上一步所转换的灰度图进行黑白反转，不然的话测出来的数值就会荧光越亮反而数值越小）：Edit>Invert（热键为Ctrl+Shift+I） 5、校正光密度（软件默认为测量灰度，因此我们要改为更加适用的光密度，其中原理不是一两句话能说得清的，这里忽略）：Analyze>Calibrate 在弹出来的界面的Function选择Uncalibrated OD，并下界面左下方勾选Global calibration，然后点击右下角的OK 点击OK后会跳出校正后的光密度曲线：如不勾选Global calibration，光密度的校正只对这张图片有效，一般分析都要分析多张图片，所以需要勾选，勾选后在打开另一图片时会提示是否将此校正应用于所有图片，不勾选Disable Global Calibration，勾选Disable these Messages

6、选择测量单位（一般选择象素，如有明确的比例，也可以选择相应单位）：Analyze>Set scale 点击后在弹出的界面里点击中间的click to Remove Scale，并勾选下面的Global（同样的，如不选Global这个测量单位的选择只对这张图片有效），最后点击OK 7、选择测量项目：Analyze>Set Measurements 在弹出界面中选择我们需要测量的项目Area、Integrated density，并勾选下面的Limit to threshold （这个选项是指只测量我们选中的范围，如不勾选侧会测量整张图片数据），选择后点击OK 8、选择测量域值：Image>Adjust>Threshold（热键为Ctrl+Shift+T）滑动弹出界面中间的滑块选择适合的域值，以使的你图片中的细胞或待测目标刚好全部被选中，选好之后点击右下角的Set 在弹出来的界面点击OK

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；

SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提

western-blot条带分析及解决方法

*注1其具体问题有二：一是背景较高，二是没有条带?形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色，周围因背景H R P较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到

条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。 *注2其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄，压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态，是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象，可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整，荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。 *注3这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。 *注4提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单，在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积（平方毫米）乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。（见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章），超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限，而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．

4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

image_j的中文使用方法-值得借鉴哈

ImageJ这套软件可以自动帮你你计算细胞数，也可以定量分析DNA电泳或是Western blot条带。 step 1.首先打开软件后，开启图档 ImageJ这套软件可以自动帮你你计算细胞数，也可以定量分析DNA电泳或是Western blot条带。 step 1.首先打开软件后，开启图档

step 2.请先做校正，选择Analyze底下的Calibrate选项，再选择校正的模式，使用Uncalibrate OD，再按ok 按下ok之后会出现校正的图形

Step 3.在要分析的第一条(first lane)加上一个长型框(工具列第一个选项)，再按下Analyze/Gels/select first Lane快速键(Ctr+1)，此时框架中会出现一个号码1，之后可以移动框架到第二个lane再选择Analyze/Gels/select second Lane快速键(Ctr+2)，当然可以一直加下去，最后按Analyze/Gels/plot Lanes快速键(Ctr +3)。

Step 4.分析以后会出现图型表示你刚选择的框内的影像强度，此时可以看到有几个比较高的区段，就是我们想定量的band，使用直线工具(工具列第五个选项)先将图形中高点为有band的区域和没有band的区域分开再，使用魔术棒工具(工具列第八个选项)点选要分析的区域。 Step 5.当我们点选分析时，在result的对话视窗会出现分析的数据，依序点选就会出现每个band的值。

注：当我们选择分析的条带也可以是横向选取，就可以只比较相同大小的DNA 的含量，同样也可以应用在western blot或其它类似实验条带的分析上。使用ImageJ 分析图像中的颗粒数 [https://www.360docs.net/doc/b12677793.html,] 原创教程，转载请保留此行 1，到本站资料下载-实用小工具栏目下载 ImageJ 并安装。 2，打开ImageJ并打开要分析的图片。请看演示图片。 3，把图像二值话或者设定阈值。选择Image - Adjust - Threshold... 根据提示设定你需要的阈值。这一步非常重要，关系到结果的正确性。设定阈值的标准就是把是颗粒的地方都突出出来。示例中颗粒都被染成了红色。