BIO-RAD双向电泳中文手册
Proteomics
Bio-Rad蛋白质组双向电泳实验操作手册 ProteomeWorks TM System
双向电泳实验流程
z样品制备（Sample preparation）
z固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）
z第一向等电聚焦（IEF）
z胶条的平衡（IPG strip equilibration）
z第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） z凝胶的染色及检测（Detection/Staining）
z PDQuest软件分析（Software analysis）
z质谱鉴定（Protein identification）
目 录
第一章 实验材料
1．1 IPG预制胶条及载体两性电解质
1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂
1．3 试剂盒及其试剂
1．4 化学试剂
1．5 蛋白质Marker
1．6 染色试剂
1．7 注意事项
第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 1 溶液的配制
2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制
2. 3 操作方法
2. 4 注意事项
第三章 双向电泳
3. 1 溶液配制
3. 2 操作步骤
3. 3 注意事项
附录1 双向电泳完整的操作步骤
附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置 附录3 细胞样品的一般处理步骤
附录4 组织样品的一般处理步骤
第一章 实验材料
1．1 IPG预制胶条及载体两性电解质
（一）IPG预制胶条（美国Bio-Rad公司），-20℃冰箱保存
cm 163-2000 IPG预制胶条 pH 3-10，7
，nonlinear（NL） 163-2002
cm
IPG预制胶条 pH 3-10， 7
cm 163-2001 IPG预制胶条 pH 4-7，7
cm 163-2003 IPG预制胶条 pH 3-6，7
cm 163-2004 IPG预制胶条 pH 5-8，7
cm 163-2005 IPG预制胶条 pH 7-10，7
IPG预制胶条 pH 3-10，17cm 163-2007
cm，nonlinear（NL） 163-2009 IPG预制胶条 pH 3-10， 17
IPG预制胶条 pH 4-7，17cm 163-2008 IPG预制胶条 pH 3-6，17cm 163-2010 IPG预制胶条 pH 5-8，17cm 163-2011 IPG预制胶条 pH 7-10，17cm 163-2012 IPG预制胶条 pH 3-10，18cm 163-2032 IPG预制胶条 pH 3-10， 18cm，nonlinear（NL） 163-2033 IPG预制胶条 pH 4-7，18cm 163-2034 IPG预制胶条 pH 3-6，18cm 163-2035 IPG预制胶条 pH 5-8，18cm 163-2036 IPG预制胶条 pH 7-10，18cm 163-2037 IPG预制胶条 pH 3-10，11cm 163-2014 IPG预制胶条 pH 3-10， 11cm，nonlinear（NL） 163-2016 IPG预制胶条 pH 4-7，11cm 163-2015 IPG预制胶条 pH 3-6，11cm 163-2017 IPG预制胶条 pH 5-8，11cm 163-2018 IPG预制胶条 pH 7-10，11cm 163-2019 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，17cm
163-2020
163-2021 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，17cm
IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，17cm
163-2022
163-2023 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，17cm
163-2038 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，18cm
163-2039 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，18cm
163-2040 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，18cm
163-2041 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，18cm
163-2024 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，11cm
163-2025 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，11cm
163-2026 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，11cm
163-2027 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，11cm
IPG预制胶条 pH 3.9-5.1，7cm 163-2028 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9，7cm 163-2029 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7，7cm 163-2030 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3，7cm 163-2031 （二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4℃冰箱保存Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，10ml 163-1112 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，25ml 163-1113 Bio-Lyte 3/5 Ampholyte，20%，10ml 163-1132 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，10ml 163-1142 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，25ml 163-1143 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，10ml 163-1152 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，25ml 163-1153 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1162 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1163 Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml 163-1172 Bio-Lyte 8/10 Ampholyte，20%，10ml 163-1182 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1192 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1193 （三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad公司），4℃冰箱保存100×ReadyStrip Buffer，for pH 7-10 IPG Strips，1ml 163-2093 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，100×，1ml 163-2094
163-2095 100×ReadyStrip Buffer，for pH 6.8-8.3 IPG Strips，1ml
100×ReadyStrip Buffer，for pH 5.5-6.7 IPG Strips，1ml
163-2096
163-2097 100×ReadyStrip Buffer，for pH 4.7-5.9 IPG Strips，1ml
163-2098 100×ReadyStrip Buffer，for pH 3.5-5.1 IPG Strips，1ml
1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂
Protein Assay Kit I，bovine γ-globulin
standard 500-0001
standard 500-0002 Protein Assay Kit II，BSA
Protein Standard I，bovine γ-globulin，1
bottle 500-0005
500-0006 Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450ml
bottle
500-0007 Protein Standard II，bovine serum albumin，1
standard
500-0121 RC DC Protein Assay Kit I，bovine γ-globulin
500-0122 RC DC Protein Assay Kit II，BSA
standard
1．3 试剂盒及其试剂
ReadyPrep
Extraction
Kit 163-2100 Sequential
Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml 163-2101
163-2102 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1，1vial
163-2103 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2，1vial
163-2104 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3，1vial
Kit 163-2105 Starter
ReadyPrep
2-D
ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106
DTT 163-2107 ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I，with
BufferII
Equilibration
163-2108 ReadyPrep
Starter
Kit
Iodoacetamide，30g 163-2109
E.coli Protein Sample，lyophilized，2.7mg
163-2110 ReadyPrep Overlay Agarose，50ml 163-2111 1．4 化学试剂
尿素Urea，250g 161-0730 尿素Urea，1kg 161-0731
Resin 142-6425 AG 501-X8（D）Mixed
Bed
CHAPS，1g 161-0460 CHAPSO，1g 161-0465 Triton X-100，500ml 161-0407 DTT（Dithiothreitol），1g 161-0610 DTT（Dithiothreitol），5g 161-0611
Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml 163-2101 溴酚蓝（Bromophenol Blue），10g 161-0404 矿物油（Mineral Oil），500ml 163-2129 SDS，25g 161-0300 SDS，100g 161-0301 SDS，1kg 161-0302 Tris，100g 161-0715 Tris，500g 161-0716 Tris，1kg 161-0719
Iodoacetamide，30g 163-2109 低熔点琼脂糖，25g 161-3111
161-0717 甘氨酸，250g
甘氨酸，1kg 161-0718
甘氨酸，2kg 161-0724
丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，100g 161-0100 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，500g 161-0101 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg 161-0103 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg 161-0107 丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg 161-0108 甲叉双丙烯酰胺（Bis），5g
161-0200 甲叉双丙烯酰胺（Bis），50g 161-0201
161-0202 PDA（Piperazine Diacrylamide），10g
161-0203 PDA（Piperazine Diacrylamide），50g
过硫酸氨（Ammonium Persulfate），10g 161-0700
161-0754 过硫酸氨（Ammonium Persulfate），100g
TEMED，5ml 161-0800
TEMED，50ml 161-0801 甘油国产或Sigma 硫尿Sigma
1．5 蛋白质Marker
2-D SDS-PAGE Standards，500μl
161-0320
161-0303 SDS-PAGE Standards，high range，200μl
SDS-PAGE Standards，low range，200μl 161-0304
161-0317 SDS-PAGE Standards，broad range，200μl
Polypeptide SDS-PAGE Standards，200μl 161-0326 Precision Protein Standards，unstained，1500μl，150 applications 161-0362
Precision Protein Standards，prestained，500μl，50 applications 161-0372
161-0325 Kaleidoscope Polypeptide Standards，500μl
Kaleidoscope Prestained Standards，broad range，500μl 161-0324
161-0309 Prestained SDS-PAGE Standards，high range，500μl
Prestained SDS-PAGE Standards，low range，500μl
161-0305 Prestained SDS-PAGE Standards，broad range，500μl 161-0318 IEF Standards，pI range 4.45-9.6，250μl 161-0310 1．6 染色试剂
Coomassie Brilliant Blue R-250，10g
161-0400
161-0406 Coomassie Brilliant Blue G-250，10g
IEF Gel Staining Solution，1L 161-0434 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit 161-0435
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，1L 161-0436
161-0437 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，4×1L
161-0438 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，1L
Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，4×1L 161-0439 Bio-Safe Coomassie Stain，1L 161-0786 Bio-Safe Coomassie Stain，5L 161-0787 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，200ml 170-3126 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，1L 170-3125 SYPRO Ruby Protein Gel Stain，5L 170-3138 Silver Stain Kit 161-0443
Kit 161-0450 Plus
Silver
Stain
1．7 注意事项
1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。尽量选用进口试剂。
2.双向电泳中使用MilliQ水（电导小于1μS）。
3.所有包含尿素的溶液加热温度不超过30℃，否则会发生蛋白氨甲酰化。
详细订货信息请参考BIO-RAD中英文目录
第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
2. 1 溶液的配制
30% 聚丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺 150g
甲叉双丙烯酰胺4g
MilliQ水500ml
滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/L Tris碱 pH8.8
Tris碱 90.75g
MilliQ水400ml
用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4℃冰箱保存。
0.5mol/L Tris碱 pH6.8
Tris碱 12g
MilliQ水120ml
用1mol/L HCl调pH至6.8，加MilliQ水定容至200ml。4℃冰箱保存。
10% SDS
SDS 10g
MilliQ水100ml
混匀后，室温保存。
10% Ap
Ap 0.1g
MilliQ水1ml（用时加水溶解）
溶解后，4℃冰箱保存。
10×电泳缓冲液
（1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）
Tris碱30g
甘氨酸 144g
SDS 10g
MilliQ水1L
混匀后，室温保存。
2×SDS-PAGE上样缓冲液
0.5M pH6.8 Tris碱 2.0ml
SDS 4.0ml
10%
甘油 2.0ml
1% 溴酚蓝0.05ml
MilliQ水定容至10ml
DTT 0.154g（用时现加）
2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制
参见附录1。
2. 3 操作方法
1. 将玻璃板洗净、晾干、固定。
2. 按照实验要求，配制不同浓度的分离胶。将分离胶注入玻璃板夹层中，上部用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓缩胶。
3. 配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。
4. 将待分析鉴定的蛋白质样品，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃水浴3-5分钟（插入冰浴冷却后加样）。
5. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，小心拔去上样梳，然后用注射器洗干净加样孔，检查一下电路连通状况（注意正负及），然后关闭电源。用微量加样器分别吸取待分析样品，根据蛋白质浓度和加样孔体积决定加样量。
6. 加样完毕后，接通电源，起始时用的低电流或低电压，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流（或电压），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
7. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
8. 染色。
2. 4 注意事项
1. 玻璃板一定要清洗干净，否则在染色时会有不必要的凝胶背景。
2. 过硫酸铵（Ap）要新鲜配制。40%的过硫酸铵储存于冰箱中只能使用2-3天，低浓度的过
硫酸铵溶液只能当天使用。
3. 蛋白质从浓缩胶部分到分离胶部分转移为避免点脱尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行（场强小于10V/cm）。
4. 用Mini Protein 3电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为5mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到10-15mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为50-75V/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到150-200V /gel。用Protein II电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到20-30mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为75-100V /gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到300-400mA/gel。
第三章 双向电泳
3. 1 溶液配制
水化上样缓冲液（I）
尿素8M 4.805g
CHAPS 4% 0.4g
DTT 65mM 0.098g（现加）
0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）
Bio-Lyte
10μl（1% 溴酚蓝）溴酚蓝 0.001%
MilliQ水定容至10ml 分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液（II）
尿素7M 4.2g
硫脲2M 1.52g
CHAPS 4% 0.4g
DTT 65mM 0.098g（现加）
0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）
Bio-Lyte
溴酚蓝 0.001%
10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml 分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液（III）
尿素5M 3.0g
硫脲2M 1.52g
CHAPS 2% 0.2g
0.2g
SB
3-10 2%
DTT 65mM 0.098g（现加）
0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）
Bio-Lyte
10μl（1% 溴酚蓝）溴酚蓝 0.001%
MilliQ水定容至10ml 分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液母液
尿素6M 36g
SDS 2% 2g
25ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl）
pH8.8
0.375M
Tris-HCl
甘油20% 20ml
MilliQ水定容至100ml
分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液I
胶条平衡缓冲液母液10ml
DTT 0.2g
充分混匀，用时现配。
胶条平衡缓冲液II
胶条平衡缓冲液母液10ml
碘乙酰胺0.25g
充分混匀，用时现配。
低熔点琼脂糖封胶液
低熔点琼脂糖 0.5% 0.5g
Tris 25mM 0.303g
甘氨酸 192mM
1.44g
SDS 0.1% 1ml（10% SDS）
溴酚蓝 0.001% 100μl（1%溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml
加热溶解至澄清，室温保存。
30% 聚丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺 150g
甲叉双丙烯酰胺4g
MilliQ水500ml
滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/L Tris碱 pH8.8
Tris碱 90.75g
MilliQ水400ml
用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4℃冰箱保存。
10% SDS
SDS 10g
MilliQ水100ml
混匀后，室温保存。
10% Ap
Ap 0.1g
MilliQ水1ml（用时加水溶解）
溶解后，4℃冰箱保存。
10×电泳缓冲液
（1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）
Tris碱 30g
甘氨酸 144g
SDS 10g
MilliQ水1L
混匀后，室温保存。
3. 2 操作步骤
（一）第一向等电聚焦（用自制的电泳上样缓冲液，17cm的胶条，pH 4-7）
1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。
2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5μl，充分混匀。
3. 从小管中取出400μl水化上样缓冲液，加入100μl样品，充分混匀。
4. 从冰箱取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），于室温放置10分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液
产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。
10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
（二）第二向SDS-PAGE电泳
1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。
3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
4. 配制胶条平衡缓冲液I。
5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
7. 配制胶条平衡缓冲液II。
8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
20.进行染色（按照伯乐染色试剂盒上的操作步骤）。
（三）等电聚焦程序设置
7cm胶条
12-16小时（20℃）主动水化
水化 50V
S1 250V 线性30分钟除盐
S2 500V 快速30分钟除盐
S3 4000V 线性3小时升压
S4 4000V 快速 20,000伏小时聚焦
S5 500V 快速任意时间保持
z选择所放置的胶条数。
z设置每根胶条的极限电流。（30-50μA/根）
z设置等电聚焦时的温度。（20℃）
11cm胶条
12-16小时（17℃）主动水化
水化 50V
S1 250V 线性30分钟除盐
S2 1000V 快速30分钟除盐
S3 8000V 线性4小时升压
S4 8000V 快速 40,000伏小时聚焦
S5 500V 快速任意时间保持
z选择所放置的胶条数。
z设置每根胶条的极限电流。（50μA/根）
z设置等电聚焦时的温度。（20℃）
17cm胶条
水化 50V
12-16小时（20℃）主动水化
S1 250V 线性30分钟除盐
S2 1000V 快速1小时除盐
S3 10000V 线性5小时升压
S4 10000V 快速 60,000伏小时聚焦
S5 500V 快速任意时间保持
z选择所放置的胶条数。
z设置每根胶条的极限电流。（50-70μA/根）
z设置等电聚焦时的温度。（20℃）
3. 3 注意事项
（一）等电聚焦
1. 配好的尿素储液必须马上使用，或用mixed-bed离子交换树脂，清除长时间放置时尿素溶液中形成的氰酸盐，预防蛋白质的甲酰化。
2. 将水化上样缓冲液分装后再储存于-20℃。用时，只要解冻需要量，其余继续储存。水化上样缓冲液一旦溶解不能再冷冻。
3. 将水化上样缓冲液加入蛋白样品中，终溶液中urea的浓度需≥6.5M。
4. 等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质，它能够帮助蛋白质溶解。两性电解质的选择取决于IPG胶条的pH范围。下图可提供参考。
IPG pH Range Bio-Lyte Ampholyte(Stock)
Range Conc.(w/v)
Sample Solution Volume
Per 5ml per50ml
3-10 3-10 40% 25ul 250ul
4-7 4-6 40% 12.5ul 125ul
5-7 40%
12.5ul
125ul
3-6 3-5 20% 25ul 250ul
4-6 40%
12.5ul
125ul
5-8 5-8 40% 25ul 250ul
7-10 7-9 40% 12.5ul 125ul
8-10 20% 25ul 250ul
5. 下表显示的是通常推荐使用的双向电泳第一向蛋白上样量。因为样品和样品之间存在差异，所以这种上样量仅提供参考。对于窄pH范围的IPG胶条，需要比宽pH范围的IPG胶条上更多的样品，这是因为pI值不在此范围内的蛋白质在等电聚焦的过程中会走出胶条。单pH范围IPG胶条的上样量是通常的4-5倍还多，这样就可以很好的检测低丰度的蛋白质。
IPG胶条的长度分析型的上样量
（银或SYPRO Ruby染色）
制备型的上样量（考马斯亮蓝染色）
7 cm 10-100ug蛋白 200-500ug蛋白11cm 50-200ug蛋白 250-1,000ug蛋白
17cm 100-300ug蛋白 1-3mg蛋白
6. 样品溶液的上样体积见下表。这样就可以使胶条溶胀至它们原来的厚度（0.5mm）。胶条最少需要经过11小时的溶胀。即使看上去所有的缓冲液都已经被吸收，也一定要确保胶条在槽中溶胀充分的时间。只有在IPG凝胶的孔径已经溶胀充分后，才可以吸收大分子量蛋白质，否则大分子量蛋白质无法进入胶条。
上样体积
ReadyStrip TM IPG胶
条的长度
7 cm 125ul-250ul
11cm 185ul-370ul
17cm 300ul-600ul
7. 如果在等电聚焦过程中，聚焦盘中还有很多的溶液没有被吸收，留在胶条的外面，这样就会在胶条的表面形成并联的电流通路，而在这层溶液中蛋白质不会被聚焦。这就会导致蛋白的丢失或是图像拖尾。为了减少形成并联电流通路的可能性，可以先将胶条在溶胀盒中进行溶胀，然后再将溶胀好的胶条转移到聚焦盘中。在转移过程中，要用湿润的滤纸仔细地从胶条上吸干多余的液体。
8. 带上手套用镊子去除IPG胶条上的保护层。将IPG胶条仔细的置于溶胀缓冲液上，胶面朝下，确保整个胶面都能被浸湿。
9. 在样品溶液中加入痕量的溴酚蓝对观察溶胀过程很有帮助。在覆盖矿物油之前，可以让胶条先吸收1小时的液体。IPG胶条上一定要覆盖矿物油，否则缓冲液会蒸发，使得溶液浓缩，导致尿素沉淀。作为防止缓冲液蒸发的预防措施，矿物油必须缓缓地加在每个槽内，确保完全的覆盖住每一根胶条。
10. 下面的表格给出了建议使用的IPG胶条运行的总volt-hours。这仅提供参考，不同的样品需要的volt-hours不同。当聚焦过程无法达到最高电压时，只要最后能达到总的volt-hours，且7cm胶条电压不低于3000伏，11cm胶条电压不低于5000伏，17cm胶条电压不低于7000伏，也能对样品进行充分的聚焦。
最高电压建议的Volt-Hours
ReadyStrip IPG胶
条的长度
7 cm 8,000V 8,000-10,000V-hr
11cm 8,000V 20,000-40,000V-hr
17cm 10,000V 30,000-60,000V-hr
11. 为使样品进入胶的效率增加，采用50V低电压溶胀；继续以低电压梯度（200V，500V，1000V各一个小时）进行电泳，最后达到10000V进行聚焦。
12. 处理预制IPG胶条时，一定要始终带着手套。注意预防角蛋白污染。
13. 水化上样缓冲液的成分由不同的样品决定。
14. 每根胶条蛋白质的总上样量由特定的样品，胶条的pH范围，及最终的检测方式决定。
下表是进行银氨染色时的蛋白质上样参考。
ReadyStrip7cm 11cm 17cm
3-10 5-100ug 20-200ug 50-300ug
4-7 10-150ug 40-200ug 80-300ug
3-6 10-150ug 40-200ug 80-300ug
5-8 10-150ug 40-200ug 80-300ug
7-10 20-200ug 50-300ug 100-300ug
15. 所有包含尿素的溶液加热温度不超过30℃，否则会发生蛋白氨甲酰化。引起蛋白质pI 值的偏移。
16.主动水化过程，会帮助大分子量的蛋白质进入胶条，但会丢失部分小分子量蛋白。
17.当样品中含盐量较高时，建议选用慢速升压。当样品中含盐量一般时，选用线性升压。当样品中含盐量很少时，可以选用快速升压，这样可以节省聚焦时间。
18.虽然仪器中每根胶条的极限电流可以设为99μA/根。但一般7cm胶条的极限电流不超过30μA/根，17cm胶条的极限电流不超过50μA/根，最好也在30μA/根以下。
19.可以在聚焦盘或水化盘的两端电极处搭上盐桥，这可以帮助除盐。但需注意的是，盐桥必须是湿润的但水不能太多，必要时需用滤纸吸去多余的水份。保持盐桥与电极的紧密接触。
20. 程序设置中的除盐步骤，可根据具体情况进行设置，如果样品中含盐量较高可设置多步除盐，并加长除盐时间。但这种方法只能除去很少量的盐离子，所以最好是在上样前，对样品进行除盐处理。
（二）胶条的平衡
1.不同长度的胶条，选用不同体积的胶条平衡缓冲液。可参考下表。
胶条的长度7cm 11cm 17cm 胶条平衡缓冲液I 2.5ml 4ml 6ml
胶条平衡缓冲液II 2.5ml 4ml 6ml
2. 从冰箱中取出得胶条一定要先解冻。
3. 胶条平衡缓冲液I和胶条平衡缓冲液II都要现配，因为DTT和碘乙酰胺在室温的半衰期很短。
4. 平衡过程导致蛋白丢失约5%-25%，还会使分辨率降低，平衡30分钟时，蛋白带变宽40%，所以平衡时间不可过长。如果不经平衡，把等电聚焦凝胶直接放在第二向凝胶上会导致高分子量蛋白的纹理现象，并且等电聚焦凝胶会粘在SDS胶上。缩短平衡时间可以减少扩散，但同时会减少向第二向的转移。所以平衡时间要充分长（至少2×10分钟），但也不要超过（2×15分钟）。
5．平衡缓冲液包括Tris-HCl（pH8.8），SDS（2%），高浓度尿素（6M）和甘油（20%）提高蛋白的溶解度并减少电内渗。第一部加入DTT（1%）是为了使蛋白去折叠；第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的DTT（银染过程中，DTT会导致电脱尾）。
电泳操作方法
XXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法 文件编号XXXX-02 制定部门研发部 版本A/0 页码1/3 生效日期2014/4/9 一、目的 建立SDS-PAGE电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性，保证电泳的安全性、有效性。 二、范围与权责 适用于本公司的所有成品以及中间体的分析，由化验员负责采样检测。 品控主管负责审核。 三、原理 SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw为分子量；X为迁移率；k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 四、实验仪器及试剂 1.DYCZ-24DN 双垂直电泳仪 2.DYY-8C 电泳仪电源 3.STS-2A 脱色摇床（水平） 4.标准蛋白Marker 5.平皿：直径150mm 6.TEMED:四甲基乙二胺 7.DTT:二硫苏糖醇 8.储存液 ①2M Tris-HCl缓冲液：称取24.2g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至8.8， 待室温，加蒸馏水至100ml。 ②1 M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至6.8， 待室温，加蒸馏水至100ml。 ③10%SDS溶液：称取10g SDS ，加蒸馏水溶解至100ml。 ④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸馏水，混合均匀。 ⑤1%溴酚蓝：100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌至完全溶解，水相针式过滤器过滤除去聚 合的染料。 9. 工作液 ①A液：30%丙烯酰胺储存液，丙烯酰胺是一种神经毒素，可通过皮肤被人体吸收并富集。操 作时要避免皮肤接触，并带合适的口罩于通风橱中进行。 ②B液—分离胶缓冲液：取75ml 2M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸馏水，混 合均匀，4℃保存数月。 ③C液—浓缩胶缓冲液：取50ml 1M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，，加46ml蒸馏水，混 合均匀，4℃保存数月。 ④10%APS：称取1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解后，水相针式过滤器过滤分装到EP管中，
电泳漆超滤设备说明书
电泳漆超滤设备系统 操作说明书 第一部分系统概述 本处理系统采用用户厂内电泳漆溶液为原液，采用超滤的核心工艺进行浓缩分离处理，达到回收原液中的电泳漆的目的。 超滤系统和反冲洗系统的操作设计，以手动操作的方式为主。所有水泵和阀门通过旋扭开关或者现场打开、关闭的方式进行操作。 本操作说明书提供整个系统的运行和维护指导，包含下列附件： 1．工艺流程图。 2．机架、管路图。 这些附件文件是操作说明书的必要组成部分，操作过程中请仔细阅读各单体单元的操作说明书。 第二部分超滤系统的投运 本系统为手动投运。 电泳漆膜元件使用前必须注意的事项： 1、使用前要把膜中的保护液冲洗干净，以免污染原液。 2、膜元件使用压力不超过0.15M pa（1.5公斤压力），最佳使用压力为0.08~0.13 M pa(1.0~1.3公斤压力)，膜元件反冲压力不超过0.15 M pa(1.5公斤压力)，最佳反
冲压力为0.12~0.14 M pa(1.2~1.4公斤压力)；(注意此压力为进水压力)。超滤液流量控制是在规定的压力和流速的前提下，调节浓缩口的阀门即可。 3、考虑电泳漆回收超滤膜的使用寿命，防止出现难恢复的堵塞，尽量降低漆液浓缩倍数，以漆液恢复到能用的程度即可。 1、工艺过程 清洗系统 原液精密过滤器出水 2、袋式过滤器 过滤原液中的固体悬浮物,保证超滤系统进水条件的要求,延长设备的使用寿命。 3、超滤（UF）系统 本系统使用的超滤膜是本公司生产的电泳漆专用超滤膜EUF90。主要用于电泳漆的浓缩回收利用。 系统正常运行时，包括超滤出水和浓缩液回流两个部分。打开阀F1、F3、F4、F5、F8,启动原水泵。通过调节F5、F8可以控制渗透液跟浓缩液的比例。 通常情况下，系统保证F1、F3、F4、F5、F8完全开启，每支EUF-90的超滤出水量为80L-100L/小时左右，该出水量为正常情况。 系统运行时，应保证精密过滤器的压力在0.15Mpa以下，超滤膜进口端压力在0.13Mpa以下，超滤膜进口端压力越低，对膜的坑污染能力越强，使用寿命会增长。
胶内酶切及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定操作步骤
蛋白质肽谱制备 1．凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。 ★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色 ★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒 2．凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。 ★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。 ★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤： ①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min ②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机） 3．凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min. 4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。 ★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。）5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。 6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。 7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。（冻干的肽段放-20度冰箱保存） 8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。） 9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。待干，再点0.5ul基质，上质谱。 溶液配制 1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中 2．脱色液配方乙腈：50mMNH4HCO3=1:1 3. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中 4．55mmol/L烷基化溶液：称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中 5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug -20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。) 6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.01ug于25mMNH4HCO3溶液（2ul稀释50倍=100ul） 7．肽提取液I:5%TFA(v/v)水溶液 8．肽提取液II: 乙腈：5%TFA=1:1
琼脂糖凝胶电泳标准操作流程
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合
对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）；加样缓冲液（6x）：溴酚黄；电泳缓冲液（1×TAE）；溴化乙锭（EB）； 3、仪器及器具 （1）移液器、吸头、锥形瓶 （2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。 （3）紫外透射仪、微波炉、电子天平 四、操作步骤 1.器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。 2.配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）倒入锥形瓶中，摇匀并
附双向电泳完整的操作步骤第一向等电聚焦1从冰箱中取-20
附：双向电泳完整的操作步骤 （一）第一向等电聚焦 1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。 2. 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。 3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。 4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。 5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。 7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。 8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。 （二）第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水（没有milliq的话ddh2o也行，注，水云深浪按）、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。 3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。 4. 配制胶条平衡缓冲液I。 5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 7. 配制胶条平衡缓冲液II。 8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。 11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。 16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤 水化上样( 被动上样) 1. 从冰箱中取出IPG 胶条，室温放置10min。 2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。 3. 用镊子轻轻撕去IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。 4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。 5. 放置30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。 6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化11~15h。 第一向等电聚焦 1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5~8μl 润湿。 2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。 3. 将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。 4. 在每根胶条上覆盖2- 3ml 矿物油。 5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，- 20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10 分钟，使其溶解。 第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ 水冲洗。 3. 配制胶条平衡缓冲液I 4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cmIPG)平衡缓冲液I ，在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 6. 配制胶条平衡缓冲液II 。 7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。 9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。 10. 在100ml 量筒中加入TGS 电泳缓冲液。 11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。 13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。 14. 用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到面胶。
电泳实验步骤
电泳实验细节 实验步骤操作要点： ① 每组将2只50 mL 、2只100 mL 容量瓶，3只200ml 烧杯洗净待用。 ② 用100ml 的容量瓶准确配制0.10 mol/L 的KI 、AgNO 3各100 mL 待用，并配置0.010 mol/L 两种溶液各50 mL 备用。 ③ 用0.010 mol/L 的KI 和AgNO 3分别配制0.005mol/L 的KI 和AgNO 3新鲜溶液100 mL 待用。 ④ 在洗净的200 mL 烧杯中准确移入0.005 mol/L 的KI 26.0 mL ，在搅拌条件缓缓滴入22.0 ml 左右的0.005 mol/L 的AgNO 3，直至形成透明晶莹的AgI 溶胶。 ⑤ 将制备好的溶胶沿洗净的电泳管中央细管缓缓加入，使溶胶高度与电极管口插入的电极头部同高（图二中刻度6）。 ⑥ 沿电泳管的管壁（图中2）滴入0.005mol/L 的KNO 3辅助液，并且使辅助液要高出铂片约2 cm （图中刻度5），将滴加完KNO 3的溶液静置8-10分钟，观察辅助液与胶体间有无界面，无界面则重做。 ⑦ 打开电源之前,检查电源粗调旋钮是否在零位,若不在:一定要调至零点,然后再打开电源;再分别调节粗调 、细调两个旋钮,使电压稳定在160伏，电泳一段时间，使负极一端界面下降2.0 cm （即图中刻度5到刻度6）,记下移动所用时间（s ）.注意:关闭电源时, 电压粗调旋钮也必须调至零点,方可关掉电泳电源开关。 ⑧ 用导线测量两电极铂片间溶胶的长度。 相关公式：)]/(/[t /h 43002 L V E ）（πηζ?= h ：2cm ,E=81 ,V=160V , η：在试验温度下水的黏度80，L ：胶体的长度 ，t ：上升所用时间。
车架电泳线设备说明
车架底漆线设备说明 一．.基本要求 1．设计依据 根据山东凯马公司提供的车间尺寸，厂房建筑图有关工艺资料。 2．生产纲领 年生产车架总成10万辆份。 3．输送方式 采用积放链加升降葫芦方式输送。 4．产品特点 车架的最大外形尺寸 l×b×h，mm：7600×1200×400 车架的最大质量：800 kg 工件最大表面积：25 m2 5．工作制度和年时基数 工作制度和年时基数：251天，双班制。 6．设计原则和主要工艺说明 a. 车架总成采用阴极电泳涂装工艺，耐盐雾试验腐蚀≥500h；漆膜厚度控制在 25±5μm。 b. 根据产品的特点及生产纲领，确定涂装生产线采用步进式生产方式，工件进行组挂后进入前处理及电泳设备。 c. 表调前和阴极电泳工艺槽材质采用碳钢，其他采用不锈钢槽，并设有排风系统。 7．工艺流程 工艺流程表
二．设备叙述 1．输送方式 方案一：积放链加挂电动葫芦 采用“积放链加挂电动葫芦”的输送方案——使工件在前处理电泳工位改为步进式横向移动输送。这种组合是将积放链的水平运动与电动葫芦的垂直运动叠加，即：积放链负责工件前行或停止，而电动葫芦负责工件垂直升降。方案可将积放链使工件方便停止、存放的优势与电动葫芦使工件灵活升降的特点相结合，最大限度的满足工艺要求。 a.纲领分析 本车架电泳涂装线生产纲领为100000辆/年。按6分钟/件的节拍式生产，每挂3件，每小时可生产30件；若按双班制，设备负荷90%计算，全年3810小时可年生产电泳车架102870个。完全满足纲领要求。 “积放链加挂电动葫芦”输送方案还具有如下优势：
1）电动双轨悬挂输送系统，其厂房占地面积大于积放链，其原因是：尽管在工位上方都是横向输送工件，但积放链的载物车回程却是纵向移动，不需很宽的距离。 2）积放链加挂电动葫芦造成本远小于其它步进式输送。 3）若积一台电动葫芦故障可推到检修线上检修，不会全线停线，而采用程控行车一台故障全线停产。 4）输送设备简介 根据工艺需要全线设载物车十三台。载物车采用四车组结构形式。其中前承载组，由前后小车加承载梁组成一组承载小车，后承载小车同样由前后小车加承载梁组成后承载小车；在前后承载梁之间增加平衡承载梁。此结构形式可保证单组承载小车组运行过程平稳可靠、并能使安装在承载梁上的集电装置平稳取电。在平衡承载梁两端下方各悬挂一只额定负荷为2吨的电动葫芦，两葫芦水平相距3500㎜。电动葫芦单速起升，升降速度6m/min。 设备启动前，十台载物小车均停在单轨返回线的积放段上，组成载物车的前后小车以及与之连接的平衡承载梁为纵向排列。
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解（蛋白质提取） 一、试剂配置： PBS配方 氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g 氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g 磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g 加水至1L配好后进行高压灭菌。 Washing buffer（500mL）配方 Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g 蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g 加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22μm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH） 裂解储液配方（细胞）： 尿素(MW 60.06) 7M 4.2g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g CHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解储液配方（组织）： 尿素(MW 60.06)5M3g 硫脲(MW 76.12) 2M1.52g
CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g Tris（MW 121.1）40mM 0.048g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解液： 裂解液储液 100uL IPG buffer（pH可选） 2% 2uL Pi 2uL NucLease mix（100×） 1uL PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL Pi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装 考马斯亮蓝G-250： 考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g 95%乙醇 4.7% 50ml H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。 二、实验准备： 1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）； 2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃； 3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在 固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝 胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。 实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶
毛细管电泳操作手册
毛细管电泳操作手册 一.毛细管紫外检测器简介 分高压电源（左侧）与毛细管检测主机（右侧）（紫外检测器）。 1.高压电源 设置高压电源分离电压范围在0-30 kV，最高设置不能超过25 kV，参考文献中如若提及分离电压在30 kV，务必不要将本高压电源也设置在30 kV。 2.毛细管检测主机 主机分毛细管系统、进样系统、和紫外检测系统。
a.毛细管系统主要包括：缓冲池、冲洗器、毛细管、高压电极。 缓冲池是两个高约3.5 cm 的玻璃瓶，用于乘装运行缓冲液。 冲洗器包括弹簧压力器和2.5 mL的医用注射器，注射器中乘装与缓冲池中一样的运行缓冲液，依靠弹簧压力将运行缓冲液推入毛细管中。 毛细管主要用的是未涂层的50 μm口径石英毛细管，有效长度在50 cm左右。 高压电极的作用是将高压电源产生的高压传输到两个缓冲池中形成电回路。 b.进样系统为一可伸缩的高度进样杆，一般进样升到最高点，所产生的高度差提供0.5 psi 的进样压力。 c.紫外检测系统提供各个波长的紫外光，可根据所做物质的紫外吸收最大波长进行手动 调节。
二.毛细管电泳的日常维护以及注意事项 1.毛细管每次使用之前必须检查正负铂丝电极是否断裂——用手指轻轻挑动电极； 2.毛细管电泳使用完毕后一定要将干燥硅胶置入主机内，如若变红，须烘箱干燥后再放入； 3.毛细管主机内部不能用水清洗，只能在关机状态下用酒精浸泡的脱脂棉擦拭，或用小毛 刷扫除主机内部的灰尘； 4.非正常情况下不要将紫外检测器的暗池打开，以免损坏紫外光接收器； 5.高压电源与主机非正常情况下不要轻易移动位置； 6.实验中手法保持轻盈，毛细管较易折断，主机窗门轻开轻关； 7.实验结束后一定要将高压电源和主机的插头都拔掉，也不要将试验样品留在主机内部的 样品架上，要保持主机内部无任何附加的化学试剂； 8.下雨天或者潮湿天气不要开机，高压电源对湿度比较敏感，湿度较大的情况下开机可能 会使高压电源击穿，造成仪器损坏； 9.寒暑假实验室无人的情况下要将毛细管主机及高压电源用干净的实验服盖住，门窗关 好，保持实验室无人的状态下也干燥； 10.若仪器长时间不用，须定时在不插电关机状态下将毛细管冲洗一次，以免毛细管堵塞。
蛋白质组学操作规程蛋白质组学样品制备规程01P1
第一部分蛋白质组学操作规程 一、蛋白质组学样品制备规程（01 ） P1. 双向电泳样品缓冲液选用的基本原则 P3. 细胞样品制备（分步）操作规程 P4. 细胞总蛋白提取操作规程 P5. 螺旋藻组织蛋白质提取方法 P6. 嗜热菌蛋白质提取方法 P7. TCA- 丙酮沉淀法样品制备操作规程 P9. 植物材料可溶性蛋白的双乙法制备流程 P10. 动物细胞的样品制备 P10. 动物组织的样品制备——胃 P11. 肺癌组织样品制备 P12. 食管癌样品制备 P13. 羊绒/毛蛋白提取 P13. 大鼠海马组织蛋白提取 P14. 使用Cibacron Blue 3GA Agarose 去除小鼠血浆/血清中的白蛋白P15. E.Coli 样品制备方法 P15. 微生物细胞样品制备操作规程 P16. 去除血浆/血清中的白蛋白和Ig-G P17. 植物根蛋白提取方法 P17. 2D-LC鼠肝样品shotgun消化实验路线 P18. 小鼠肝组织蛋白质提取方法 P18. 小鼠肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P25. 人肝蛋白质组织提取方法 P27. 人肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P27. 丙酮丁醇菌蛋白质提取方法（选用嗜热菌蛋白质提取方法） P27. 嗜碱菌蛋白质提取方法（尚在摸索阶段） P27. 脑脊液蛋白质提取方法 二、蛋白质定量标准操作规程（02 ） P1. 改良的Bradford 法测定蛋白质含量 P3. Lowry 法（DC 试剂）测定蛋白质含量 P5. Lowry 法测定蛋白质含量（自配试剂） P7. 安玛西亚定量试剂盒使用方法 P8. 利用微板（96 孔板）定量测定蛋白质浓度 P9. BIO-RAD PROTEIN ASSAY 使用方法P10. BCA Protein Assay Kit 使用操作规程 三、蛋白质电泳及凝胶染色操作规程（03） P1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 P3. 固相pH 梯度-SDS 双向凝胶电泳实验操作程序
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程1
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项： 1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
琼脂糖加样时候注意事项： 1、用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。 2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。 4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。 6、电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA 带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。 7、在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。 8、如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。
JY300C电泳仪的使用说明
一、设置 /设置状态： 2、按“↑”键或“↓”键，可修改闪动位置； 3、按“ENT”键，选择电压U、电流I、功率的设置换挡。 二、输出 1、在停机/设置状态下按“RUN/STOP”键，使电泳仪输出； 2、液晶屏幕显示输出电压、电流、功率、运行累计时间。 三、停机 1、在运行状态下按“RUN/STOP”键，返回停机/设置状态； 2、如果定时时间到，显示“END”并自动停机，按“RUN/STOP”键，返回停机/设置 状态。 四、编辑 在停机/设置状态下连续按“EDIT”键即可进入编辑状态中的： →程序储存状态“SA VE[X]”按“EDIT”键 →程序选择状态“LOAD[X]”按“EDIT”键 →定时设置状态“XX:XX”按“EDIT”键 →编辑选择状态“QUIT” 1、在“SA VE[X]”程序储存状态下： a)按“↑”或“↓”键，可选择0~9储存程序编号； b)按“ENT”键，使程序储存并返回停机/设置状态； c)按“EDIT”键，放弃程序储存，进入程序选择状态。 2、在“LOAD[X]”程序选择状态下： a)按“↑”或“↓”键，可选择0~9储存程序编号； b)按“ENT”键，使程序调出并返回停机/设置状态； c)按“EDIT”键，放弃程序储存，进入定时设置状态。 3、在“XX:XX”定时设置状态下： a)按“↑”或“↓”键，可选择定时时间； [注]如果定时设置为00:00，即定义为“无定时” b)按“ENT”键，将所有设置参数储存并返回停机/设置状态； c)按“EDIT”键，放弃定时设置，进入编辑选择状态。 4、在“QUIT”编辑选择状态下： a) 按“ENT”键退出编辑，返回停机/设置状态； b) 按“EDIT”键，重复进入编辑状态。
电泳法
电泳法 朱莹分析化学S1******* 摘要：电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象，电泳不仅作为一种现象，而且作为一种技术方法得到不断发展。从界面分离到各种区带电泳，开辟了混合物的电泳分析的可能性。电泳不仅适用于蛋白质[1、2]、核酸[3]、糖[4]等生物大分子的分离分析，而且也能用于氨基酸[5]、手性药物[6]、维生素[7]、有机酸[8]的分离分析。毛细管电泳在分离机理和液相色谱之间有互补性，已越来越多地替代HPLC法用于有关物质的检测。本文详细介绍了电泳法的基本概念、分类及应用。 关键词：电泳、毛细管电泳、实际应用。 一、电泳法的基本原理 电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresis technique）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister）[9]。 物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子）。不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。 在两个平行电极上加一定的电压(V)，就会在电极中间产生电场强度(E)。 在稀溶液中，电场对带电分子的作用力(F)，等于所带净电荷与电场强度的乘积： F=q·E 这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即： F’=6πrηυ 式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时：F = F’， ∴q·E = 6πrηυ 电泳迁移率(m)是指在单位电场强度(1V/cm)时带电分子的迁移速度： 所以， m=υ/E=q/6πrη 这就是迁移率公式，由上式可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。 由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，如：待分离生物大分子的性质、缓冲液的性质、电场强度、电渗、持介质的筛孔。 二、电泳法的分类 原则上按电泳的原理来分，现在有三种形式的电泳分离系统：即移动界面
凝胶电泳操作步骤
琼脂糖凝胶电泳 （一）材料 （二）试剂 1、1*TAE 2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。 3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。 4、RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。 常使用，深黄色应弃用。 波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度 溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷 缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面； 3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。
4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由 围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。 5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色 条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。 （二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做） 配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至60?C，加入5mL的5x甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷 却30分钟后使用。 甲醛变性胶RNA样品的制备：1μL RNA，5?甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲 的EB。 步骤： 4．小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。 步骤 1.称量琼脂糖，转入耐热广口瓶内，加TAE用微波炉熔化。 2.用胶布封住电泳槽两端，插入梳子，平放于水平台上。 3.凝胶冷却到50°C-60°C（手能触摸的温度）后倒入电泳槽。 4.凝胶凝固后撕下胶布，直接（带上梳子）转移到电泳槽中。 5.加电泳缓冲液至充分没过凝胶。拔梳子时应谨慎。 6.阴极（黑色）一般位于右侧，阳极（红色）一般位于左侧。 7.DNA样品中加入点样缓冲液，混合均匀。然后小心加入到凝胶孔中。DNA 样品；6*点样缓冲液=5:1 8.恒压电泳（6cm*9cm、0.7%凝胶用80-100V电泳1h。溴酚蓝迁移到33%-66%
PAGE电泳操作说明
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、制胶 本实验室常用40ml 体系胶浓度9% NH基团中的氢原子被甲基替换而得。工作原理在于TEMED可以催化过硫酸铵或核黄素产生自由基，从而引发聚合反应，促进聚丙烯酰胺凝胶的形成。 根据不同情况TEMED和过硫酸铵可适量加减。 以上的各组分按顺序加入（TEMED最后加入），充分的摇匀后用玻璃棒引流到两块 玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口处插入梳子，此步骤要选择合适的梳子，且插入时要尽量缓慢，防止气泡的产生，影响点样，若有漏出要及时的补加聚丙烯酰胺溶液，后用夹子将下面和两边夹紧防止漏胶，放在室温下让其凝结15min以上。 制胶时底板(不带缺口)和盖板(带缺口)与胶接触的那一面以及梳子齿要保证干净，没有灰尘、胶颗粒等，制胶前一般会用酒精擦拭玻璃板表面和梳子齿。 凝固后上电泳仪前将夹子、胶条、梳子卸掉用水冲洗上样孔将残胶冲掉同时赶走气泡。 二、电泳 PCR 扩增产物由非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)垂直电泳分离检测。稳定功率20W(电压200V±)，电泳时间一般1.5h，可根据产物片段大小适当调整。 1.预电泳，待凝胶聚合后，将梳子拔出，在电泳槽内加入 1×TBE，预电泳10分钟 2.上样，预电泳后，将PCR产物和loading buffer 3.5ul混合，用移液枪吸取5ul 混 合液轻轻地加入点样孔，尽量的减少加样时间，以防样本弥散。 3.接上电源进行电泳， 电泳槽和玻璃板要用夹子夹紧，否则漏缓冲液会让整个条带跑歪。 功率过高会使温度升高导致玻璃板炸裂，同时注意环境温度，天热时开空调或风扇散热。 三、染色 本实验采用银染法 1.电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉胶条。 2．在托盘中加入固定液100ml/块胶。将整版胶小心放入溶液中（要没过胶），水平摇床上摇2min。 3.加入1ml 20% 硝酸银溶液，8—10min。后倒掉溶液，加清水洗一次。 4.托盘中加入显影液100ml/块胶，于摇床震荡至显色。 5.将洗干净的凝胶放在保鲜膜上包好，以备统计带型和照相。