SDS-PAGE电泳具体步骤

SDS电泳具体步骤

一、清洗玻璃板

1、洗洁精轻轻擦洗

2、自来水冲

3、蒸馏水冲

4、筐里晾干

5、梳子用水洗

二、配胶

材料：玻璃板、梳子、架子、枪（100-1000、20-200、2-20）、DDW、30%Arc-Bis、Tris(pH8.8)、Tris(pH6.8)、10%SDS、10%AP、TEMED。

1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧

2、配分离胶

3、加入玻璃板中

4、加入乙醇1ml

等待０.5小时

5、用注射器吸出乙醇，

6、用水冲洗分离胶3次，第4次最后(加入AP、TEMED前)再用注射器吸出

7、配浓缩胶

8、将玻璃板加满

9、放入小梳子

等待０.5小时

三、上样

材料：蛋白、marker、针筒、电泳槽、电泳液、枪（2-20ul）

1、把玻璃板取下，放入小架子，固定于电泳槽（大玻璃板朝外），拔梳子，（若只有一块胶，对面用塑料板）

2、将小架子加满电泳液，标记位置，用针筒抽电泳液通膜

3、根据要求上样蛋白（如海马），最外侧加马克，用2-20ul枪

四、电泳

1、放入电泳盒中，盒中加少量电泳液，放上盖子

2、开电泳机

电压先60V，马克到达分离胶后调制110V，等待约2小时

五、转膜

材料：6张滤纸、1张PVDF膜（根据分离胶剪，无水甲醇中浸泡1min~2min）、转膜夹、转膜缓冲液

1、取胶，将浓缩胶轻轻刮去，去掉多余的分离胶，

2、将裁好的胶、浸过甲醇的PVDF膜和滤纸放入转膜缓冲液中，10min左右，

3、黑色板在下面，纸—胶—膜—纸（注意赶走气泡）

4、转膜夹放入电泳槽，放满转膜缓冲液，外面放冰块，加满水

等待120分钟，电压100V

六、免疫反应

材料：丽春红、TBST、5%牛奶、一抗、二抗

1、取出一小盒，加入少量丽春红，（用完回收）

2、把膜取出，扔掉胶，依次放丽春红——TBST，（摇床上)

3、膜剪成小条带，放入方格盒，放入TBST（摇床），几分钟后放入5%牛奶中封闭抗原（摇床）

等待1小时

4、配一抗：配5%的牛奶（5g牛奶，加TBST至100ml），将抗体放入牛奶中。

5、包一抗：将膜放入盛有抗体的5%的牛奶中，摇床上1小时

6、4℃冰箱中过夜

7、第2天，取出膜，TBST中洗，10分钟X3次

8、加入二抗，封膜，摇床上，1.5—2h

七、化学发光

准备材料：黄色枪头、20-200ul枪、剪刀、镊子、保鲜膜、板、solution、reagent、小盒中的膜

1、取出膜，TBST中洗，10分钟X3次

2、膜放入盒中

3、加solution、reagent至膜上，（A：B=1：1，约60ul）

4、膜放入保鲜膜上包好

5、膜放入板上进屋

6、剪胶片放在膜上下，夹在板里，

等待1小时

7、胶片先放入显影液中

8、胶片先放入定影液中

9、用水冲洗干净