分子生物学考试知识点研究生

名词解释

1、沉默子(silencer)：某些基因的负性调节元件，能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。

2、启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合，并启动转录的特定DNA序列。至少包括一个转录起始点以及一个以上的功能组件。

3、复制子（replicon）：是从一个DNA复制起点开始的DNA复制区域，是独立完成复制的功能单位

4、终止子(terminator T)：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。

5、增强子(enhancer)：指远离转录起始点、决定基因的时间和空间特异性、增强启动子转录活性的DNA序列。其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。

6、操纵子：每一个由若干个结构基因及其上游的调控序列组成的转录区段，共同组成一个转录单位。一个操纵子只含一个启动序列（promoter）及数个可转录的编码基因。

7、结构基因：基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列。大多数真核生物结构基因的DNA

序列由编码序列和非编码序列两部分组成。

8、重复基因：指染色体上存在多数拷贝基因。重复基因往往是生命活动最基本，最重要的功能相关的基因。

9、断裂基因：编码序列中间插入的无编码作用的碱基序列。

10、重叠基因：指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。

11、管家基因：在生物体中有些基因的表达在生命的全过程中都是必需的．是维持细胞最低功能所必不可少的基因．在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，这些基因称为管家基因。

12、跳跃基因（jumping gene）:转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（jumping gene）。是那些能够进行自我复制，并能在生物染色体间移动的基因物质。

13、假基因(pseudogene)：一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。

14、密码子:信使RNA分子中每相邻的三个核苷酸编成一组，决定多肽链上一个氨基酸或一种信号，称为密码子或三联体密码。

遗传密码特点：1.方向性；2.连续性；3.简并性；4.通用性；5摆动性

15、反密码子：是位于tRNA反密码环中部、可与mRNA中的三联体密码子形成碱基配对的三个相邻碱基。在蛋白质的合成中，起解读密码、将特异的氨基酸引入合成位点的作用。

16、通用密码：指在大部分生物中都编码相同氨基酸的一类遗传密码子，是生物界普遍采用的遗传密码。

18、副密码：tRNA 分子上决定其携带氨基酸分子的区域称为。

19、单顺反子(monocistron)：即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链。

20、基本转录因子(general transcription factors)：是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA(mRNA、tRNA及rRNA)转录的类别。

21、特异转录因子(special transcription factors)：为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。

22、微小RNA (microRNA, miRNA)：是一大家族小分子非编码单链RNA，长度约20~25个碱基，由一段具有发夹环结构，长度为70~90个碱基的单链RNA 前体(pre-miRNA)经Dicer 酶剪切后形成。

23、反义DNA：人工合成的与待封闭基因的某一区段互补的正常或者化学修饰的DNA片

段，用来抑制或者封闭这一基因表达。

24、反义RNA：是指核苷酸序列与其调控的RNA序列互补的RNA序列。

25、核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交。

26、顺式作用元件(cis -acting element)：一般说来，调节序列与被调控的编码序列位于同一条DNA链上，称为顺式作用元件。

27、反式作用因子(trans-acting factor)：调节序列远离被调控的编码序列，实际上是其他分子的编码基因，只能通过其表达产物来发挥作用，这些蛋白质分子称为反式作用因子。28、第一信使：细胞间的信息物质，是由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称，包括蛋白质和肽类（如生长因子、细胞因子、胰岛素等）、氨基酸及其衍生物（如甘氨酸、甲状腺素、肾上腺素等）、类固醇激素（如糖皮质激素、性激素等）、脂酸衍生物（如前列腺素）、气体（如一氧化氮、一氧化碳）等。

29、第二信使：细胞内的信息物质，第一信号物质经转导刺激细胞内产生的传递细胞调控信号的化学物质，包括无机离子（Ca2+）、脂类衍生物（如DAG、IP3）、核苷酸（如cAMP、cGMP）、信号蛋白分子等。

30、第三信使：细胞核内的信息物质，负责细胞核内外信息传递的物质，又称为DNA结合蛋白，是一类可与靶基因特异序列结合的核蛋白，能调节基因的转录。如立早基因(immediate-early gene)的编码蛋白质。

31、自身磷酸化：当配体与单跨膜螺旋受体结合后，催化型受体(catalytic receptor)大多数发生二聚化，二聚体的酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)被激活，彼此使对方的某些酪氨酸残基磷酸化，这一过程称为自身磷酸化。

简答题

1、

2、什么是基因？基因的本质是什么？基因的特点是什么？

（1）基因：负责编码RNA或一条多肽链的DNA片段，是染色体或基因组的一段DNA 序列，包括编码序列（外显子）、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列（内含子）。

（2）基因的本质：基因是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。

（3）基因的两个特点：

<1>、能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；

<2>、基因能够“变异”，变异基因中一小部分会导致疾病，另外的绝大多数是非致病

变异。

3、什么是肽核酸？主要应用有哪些？

肽核酸（第三代反义核苷酸药物）是指在特定的肽链上连接不同的碱基，形成肽核酸，能与其互补的DNA或RNA特异性结合，从而抑制或者封闭基因表达。

主要应用有：

○1为基因分析提供了更好的手段；

○2在细胞或者亚细胞水平上对基因表达进行定性和定量研究；

○3用于病毒、肿瘤、遗传病的基因治疗；

○4将反义RNA作为一种探针，用于对病毒基因的复制、转录及表达水平进行定性和定量研究，探究病毒的致病机理。

4、DNA突变有哪几种类型？DNA损伤修复类型？

突变类型有：错配、缺失、插入、重组或重排。

损伤修复类型有：直接修复、切除修复、重组修复、SOS修复

5、什么是癌基因？细胞癌基因？病毒癌基因？抑癌基因？

(1)癌基因(oncogene):细胞内控制细胞生长和分化的基因，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。

(2)病毒癌基因(virus oncogene,V-onc)：存在于病毒基因组中的癌基因，它不编码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用，但可以使细胞持续增殖。

(3)细胞癌基因(cellular-oncogene, C-onc)：存在于生物正常细胞基因组中的癌基因，或称原癌基因(proto-oncogenes , pro-onc) 。未激活的癌基因，促进正常细胞生长、增殖、分化、发育。

(4)抑癌基因(cancer suppressive gene, anti-oncegene):抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。

细胞癌基因的特点：广泛存在于生物界中；基因序列高度保守；作用通过其产物蛋白质来体现；被激活后，形成癌性的细胞转化基因。

病毒癌基因v-onc 与细胞癌基因c-onc的差别

1. v-onc通常丢失c-onc两端的某些序列

2. v-onc没有内含子

3. v-onc外显子与同源的c-onc也有微小差别

4. v-onc出现碱基取代或缺失较c-onc常见

抑癌基因的作用：

<1>其编码产物起着抑制细胞增殖信号转导，负性调节细胞周期，抑制细胞增殖的作用;<2>与癌基因是相互制约，相互协调;<3>抑癌基因的丢失，会导致肿瘤的发生抑癌基因：p53基因-基因组的监护人（guardian）、基因卫士

编码一个转录因子TF。p53突变存在于多种癌（肺癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌等）。50-60%的癌与p53的突变有关。

p53的作用：激活某些特殊基因的表达，其中最重要的是P21蛋白。监视基因是否有突变。

6、RNA技术与反义RNA技术在抑制RNA表达上有何特点？

影响相应基因的表达。反义RNA有三种方式：（1）反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和（或）编码区，引起翻译的直接抑制或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶3的敏感性增加，导致mRNA不稳定，容易被酶水解；（2）反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列上游非编码区结合，引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变，阻止核糖体的结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能；（3）反义RNA直接作用于靶mRNA 的转录。

7、siRNA 和miRNA的差异比较

siRNA miRNA

前体内源或外源长双链RNA 诱导产生

内源发夹环结构的转录产物

结构双链分子单链分子

功能降解mRNA 阻遏其翻译

靶mRNA

结合

需完全互补不需完全互补

生物学效应

抑制转座子活性和病毒

感染

发育过程的调节

8、与RNA

DNA作为遗传物质的优点：（1）DNA可以精确地自我复制，传递遗传信息。使亲代与子代间保持遗传的连续性。（2）双螺旋的双链结构保证了遗传物质的稳定，如果某些碱基因为一些原因突变，生物体就可以根据另一条链的信息来修复这个突变。所以DNA的稳定性要高于RNA和蛋白质，可以使生物保持遗传的稳定。(3)、胞嘧啶（C）脱氨变成尿嘧啶（U），在RNA中不能修复，而DNA可以碱基互补配对进行修复。

9、RNAi技术的原理及其应用？

主要应用：

○1抑制转座子活性和病毒感染；

○2进行基因敲除；

○3基因治疗（HIV感染、肝炎病毒感染及肿瘤等）

10、基因敲除相关知识点

（1）定义：基因敲除（gene knock out）又称基因剔除，或基因打靶（gene targeting）是指通过DNA定点同源重组，定向改变基因组中的某一特定基因，使机体特定基因失活或缺失，从而研究此基因的功能的一种分子生物学技术。

（2）基因敲除的基本程序：

打靶载体的构建；

打靶载体导入ES细胞：重组置换；

基因敲除ES细胞注射入胚泡；

胚泡植入假孕小鼠的子宫中。

（3）重组子的筛选与鉴定

如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞

常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法，

其中应用最多的是PNS法。

正向筛选法可分为无启动子筛选法、无增强子筛选法和无polyA筛选法。

正负双向筛选系统（ positive and negative selection，PNS）含有正负选择基因各一个，正向选择基因多为neo基因，插入载体的同源序列中；负向选择基因常用HSV-tk基因，置于同源序列的外侧。同源重组时，载体的同源区发生重组，同源区以外部分将被切除，所以在同源重组时，tk基因将被切除而丢失。而在随机整合时，所有序列均保留。

胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。在同源重组时，细胞对 G418和GANC都有抗性，随机整合时只对G418有抗性，而对GANC敏感，细胞将被杀死。未进行任何方式整合的细胞则被G418杀死。

用G418作正筛选，可得到含有neo基因的细胞株，然后再用丙氧鸟苷做负筛选，淘汰含有tk基因的细胞株，就得到不含tk基因的同源重组细胞株。

PCR筛选法

其原理是通过在目的突变基因序列中引入特定的PCR引物序列，利用 PCR方法直接检测转化细胞的 DNA结构，然后根据特定扩增 DNA片段的有无,来鉴别中靶阳性细胞克隆。

11、DNA序列分析方法有哪些？原理？

（1）化学裂解法：基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5′末端，经放射

自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。

（2）双脱氧链末端终止法：也称为DNA链末端合成终止法，以DNA合成反应为基础，掺入ddNTP，反应便停止。

（3）DNA自动化序列分析：采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。

12、mRNA和tRNA结构特点及功能

（1）mRNA：成熟的mRNA由氨基酸编码区和非编码区构成，5'-末端的帽子(cap)结构和3'-末端的多聚A尾(poly-A tail)结构。AUG被称为起始密码子；从AUG 开始，每三个核苷酸为一组编码了一个氨基酸，称为三联体密码(codon)，决定肽链终止的密码子则称为终止密码子位于起始密码子和终止密码子之间的核苷酸序列称为开放阅读框(open reading frame, ORF)，决定了多肽链的氨基酸序列。

（2）tRNA：是蛋白质合成中氨基酸载体

转运RNA（tRNA)在蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体, 将氨基酸转呈给mRNA。由74～95核苷酸组成；tRNA具有三叶草形二级结构以及倒L三级结构。二级结构含有：氨基酸臂、DHU环、反密码环、TψC环和附加叉。

tRNA的3'-末端都是以CCA结尾。3'-末端的A与氨基酸共价连结，tRNA成为了氨基酸的载体。不同的tRNA可以结合不同的氨基酸。tRNA的反密码子环上有一个由三个核苷酸构成的反密码子(anticodon)。tRNA上的反密码子依照碱基互补的原则识别mRNA上的密码子。

13、什么是核酸杂交？影响杂交的因素有哪些？类型有哪些？检测对象有哪些？

（1）概念：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。

（2）影响因素：核酸分子的浓度与长度；温度；离子强度；甲酰胺作用；核酸分子的复杂性；非特异性杂交反应。

DNA。（2）Northern 印迹法（Northern bolting）：检测RNA。（3）Western 印迹法（Western bolting）：检测蛋白质

14、何为探针？特点是什么？

（1）探针(probe)：是一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

DNA探针：是最常用的核酸探针，长度在几百bp以上的双链或单链cDNA片段（通常400—500bp）

RNA探针：放射性或非放射性标记的RNA分子，用于探测与之互补的DNA或RNA 链，RNA探针通常通过克隆相应DNA在体外转录合成而制备（通常400—500bp）寡核苷酸探针：一般有17-50个核苷酸组成，可以是寡聚脱氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸

(2)探针的特点：<1>高度灵敏性；<2>不影响碱基配对的特异性；<3>不影响探针分子的主要理化性质；<4>对酶促反应活性无影响或影响不大；<5>检测方法具有高度灵敏性和高度特异性。

15、PCR基本原理？过程？与体内复制有哪些不同？

(1)基本原理：是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

(2)过程：变性——退火——延伸循环具体步骤：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

○3、引物的延伸：DNA模板――引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为

反应原料，靶序列为模板，按照碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与DNA链互补的半保留复制，重复循环变性――延伸――退火三个过程就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板

(3)区别：

反应所需基本成分不同:PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。体内复制体系：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白。

反应过程不同：PCR:①模板DNA的高温变性②模板DNA与引物的低温退火(复性)③引物的适温延伸。体内复制：解旋酶解开双链、单链DNA结合蛋白维持单链结构、聚合酶链接。反应温度是体内适宜温度。

（4）PCR 技术的特点：1、高度灵敏性；2、高度特异性；3、样品广泛的适应性；4、操作简单。

常见的PCR技术：

1、不对称PCR技术；

2、反向PCR技术；

3、多重PCR技术；

4、引物标记PCR技术；

5、实时PCR技术。

（1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物，其最佳比例一般是0.01∶0.5μM。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究。

（2）反向PCR (reverse PCR) 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

（3）多重PCR 在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或检测缺失设置内对照。用于检测特定基因序列的存在

或缺失。

（4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断。可同时检测多种基因成分。（5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增。

（6）PCR固相分析法可用于基因芯片的制作

（7）原位PCR 原位聚合酶链式反应（In Still PCR，Is－PCR）是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR 扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。

（8）逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等。

（9）荧光定量PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR 产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。

PCR技术在医学上的应用 1. 目的基因的克隆2. 基因的体外突变3. DNA和RNA 的微量分析4. DNA序列测定5. 基因突变分析

16、如何设计引物？基本原则？

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

基本原则：（1）在高度保守区,与非扩增区无同源性。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）3’端为关键碱基；5’端无严格限制。

17、基因表达调控知识点

（1）基因表达(gene expression)：基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。

（2）按对刺激的反应性，基因表达的方式分为：组成性(基本)表达、诱导或阻遏表达

<1>某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。

<2>管家基因较少受环境因素影响，在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，这类基因表达被视为组成性基因表达(constitutive gene expression)。

<3>在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因(inducible gene)。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。

<4>如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因(repressible gene)。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。

（3）基因表达调控的意义：

以适应环境、维持生长和增殖

以维持细胞分化与个体发育

（4）基因表达调控呈现多层次和复杂性

转录水平的调控：转录激活、转录起始;

转录后水平的调控：转录后加工、运输、mRNA降解;

翻译水平的调控：翻译的起始;

翻译后水平的调控：翻译后的加工、转运、多肽链的分解.

（5）基因转录激活受到转录调节蛋白与启动子相互作用的调节

基因表达的调节与基因的结构、性质，生物个体或细胞所处的内、外环境，以及细胞内所存在的转录调节蛋白有关。

（一）特异DNA序列决定基因的转录活性

（二）转录调节蛋白可以增强或抑制转录活性

（三）转录调节蛋白通过与DNA或与蛋白质相互作用对转录起始进行调节

（四）RNA聚合酶与基因的启动序列/启动子相结合

○1、原核/真核启动子与RNA聚合酶活性

RNA聚合酶与其的亲和力，影响转录。

○2、调节蛋白与RNA聚合酶活性

一些特异调节蛋白在适当环境信号刺激下表达，然后通过DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性

（6）基因的表达过程包括复制、转录、翻译。因此在各个水平的作用均可影响基因的表达，但是转录水平的影响因素最明显。

（7）影响因素：<1>表观遗传学，甲基化、乙酰化、磷酸化等等；<2> 所处环境，细胞因子、生长因子等等的刺激；<3> 胞内转录因子等等

18、基因诊断概念、特点及常用方法？

概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

特点：针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强

常用方法：

限制性内切酶酶切(rescriction enzyme digestiton)

聚合酶链反应(PCR)

基因芯片(gene chips)

基因测序(DNA sequencing)

核酸分子杂交(hybridization)

19、基因治疗概念及基本方法？

概念：目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

基因治疗的基本方法

基因矫正(gene correction)

基因置换(gene replacement)

基因增补(gene augmentation)

基因失活(gene inactivation)

几种常见的基因失活技术

反义核酸技术：反义核酸( antisense nucleic acid）：根据碱基互补的原理，用人工合成或生命有机体合成的特定互补的DNA 或RNA片段(或其化学修饰的衍生物）与目的序列结合，通过空间位阻效应或诱导Rnase 酶活性，在复制、转录、剪切、mRNA转运及翻译等水平上，抑制或封闭目的基因的表达。

核酶技术

三链技术

干扰RNA技术

20、基因克隆重要的工具酶

(1)限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE):是识别DNA的特异序列, 并在识别位点切割双链DNA的一类内切酶。

作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA

(2)DNA聚合酶最常用的DNA聚合酶有以下4种

（1）DNA聚合酶Ⅰ（全酶）。DNA聚合酶Ⅰ是

个具有3 种酶活性的多功能性酶。包括：5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性、5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性、3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性

DNA pol Ⅰ应用：常用来催化DNA缺口平移反应、制备高比活性DNA探针、cDNA第二条链的合成、对DNA3突出末端进行标记、DNA序列分析。

（2）DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段。用途：<1> 补齐双链DNA的3ˊ末端；

<2>用标记碱基补齐3ˊ末端<3> 用于cDNA克隆中第二股链的合成；<4> DNA序列分析。（3）Taq DNA聚合酶。作用特点：1）Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围70 75℃，2）95℃以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。（4）T4 噬菌体DNA聚合酶。

（3）逆转录酶：具有以下3种酶活性：（1）以单链RNA为模板, 合成cDNA单链；（2）具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA；（3）以DNA为模板，催化合成cDNA双链。

逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。

（4）T4DNA连接酶：（1）催化双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。（2）修补带有缺口的双链DNA分子（5）碱性磷酸酶：能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。用途：

⒈制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。

⒉用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。（6）末端转移酶：将标记或未标记的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。

（7）Taq DNA聚合酶

21、转座子相关知识点

(1)转座子(transposon 或transposable element)：是基因组内相对独立的、可移动的DNA序列。它们不必借用噬菌体或质粒的形式就可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，这个过程称为转座（transposition）。

(2)特性：○1、是基因组的正常成分，不以独立的形式存在（如噬菌体或质粒DNA）。○2、转座的发生不依赖于转座子和靶位点之间任何的序列同源性，在基因组内由一个部

位直接转移到另一个部位。○3、转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的。

（3）转座子共同特点：①两端有ITR；②转座后靶位点重复是正向重复；③编码与转座有关的蛋白质；④可在基因组中移动。

22、G蛋白的结构特点和作用是什么？

是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，由、、三个亚基组成。有两种构象：非活化型；活化型。α亚基具有多个活化位点，其中包括可与受体结合并受其活化调节的部位、与βγ亚基结合的部位、GDP或GTP结合部位以及下游效应