分子生物学技术实验指导2009版
分子生物学实验指导2009年9月19日修订
实验一质粒DNA的制备
[原理]
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中，大小在1—200kb之间，它们为双链闭环状的DNA分子。质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达其携带的遗传信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，离开宿主细胞就不能存活，而寄主在没有质粒存在时是可以正常生长的。质粒可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，其控制的许多生物学功能通常是对宿主细胞的补充。因此，可以认为质粒是一种寄生性的自主复制子。
质粒在细胞内的复制一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松驰控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，因此，染色体不复制时，其也不复制；后者在整个细胞周期中随时都可以复制；通常，前者在细胞内只含1个或几个质粒分子，而后者在细胞里有许多拷贝，一般在20个以上，甚至多达数千个。
在基因工程中，通常使用的是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而人工构建的质粒，称为质粒载体，其带有一个或多个选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有若干个限制性核酸内切酶识别的位点（多克隆位点）。由于去掉了天然质粒中的大部分序列，一般不含转移所必需的基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的转移。常用的质粒载体有PUC18/19、PBR322、PGEM—32、PKK223—2等，其大小一般为2—5kb，由于其分子小，因此便于操作。
分离纯化质粒DNA主要是利用宿主染色体与质粒之间的差异来进行的，如染色体DNA 分子量比质粒DNA大得多，又如染色体DNA在提取过程中大多断裂成线状分子而质粒DNA为共价闭合环状结构。
分离纯化质粒DNA包括三个基本过程：
1、培养细菌使质粒大量扩增；
2、收集和裂解细菌，并去掉蛋白质和染色质DNA；
3、分离纯化质粒DNA。
目前质粒DNA制备大致有三种，1、碱裂解法，2、煮沸法，3、去污剂裂解法。
碱裂解法
将细菌悬浮于葡萄糖等渗溶液中，经EDTA处理，可破坏细菌细胞壁和细胞外膜，阴
离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）或Triton x-100处理使细胞崩解，经碱处理可使氢键断裂、破坏碱基配对，使细菌线状染色体DNA和质粒DNA变性，加入乙酸钾后质粒DNA 迅速复性为可溶性质粒DNA，小分子RNA也呈可溶状态，而变性的染色体DNA、高分子RNA以及K+/SDS/细胞膜复合物缠绕附着在细胞壁碎片上，冰浴后易沉淀，可离心去除，而质粒DNA及细菌中的可溶性蛋白质、核糖核蛋白体和tRNA等留在上清中。通过加入蛋白水解酶和核糖核酸酶可以分解之。通过碱性酚（pH8.0）或酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)或氯仿-异戊醇等有机溶剂除去蛋白质、氯化锂沉淀RNA和残存的蛋白质、再用乙醇等有机溶剂沉淀DNA，即得纯化的质粒DNA。
[器材]
1、台式高速离心机
2、涡旋器
3、摇床（干热振荡培养箱）
4、手提式高压消毒锅
5、微量进样器
6、移液器
7、1.5ml Eppendorf管
8、100ml三角烧瓶
9、水浴锅
[试剂]
1、LB( Luria—Bertani)培养基: 950ml去离子水中加入胰蛋白胨10克、酵母提取液5克、
NaCl 10克，摇荡至溶解，用5N NaOH（约1.6 ml）调pH至7.5，用去离子水定容
至1000ml，15磅/英寸2高压灭菌20分钟（LB培养基不能反复高压）。
2、氨苄青霉素（Ampicillin ,Amp）母液：10 mg/ml水溶液,-20℃冰箱贮存，备用。
3、LB-AMP液体培养基: 在100 ml LB培养基中加入氨苄青霉素（10 mg/ml）母液0.5
ml。
4、LB固体培养基：在LB培养基中加1.4%琼脂粉，经高压灭菌制备LB固体培养基。
5、LB-AMP固体培养基（含氨苄青霉素50ug/ml）：在100 ml LB培养基中加1.4g琼脂
粉，经高压灭菌后冷却至55℃,加入氨苄青霉素（10 mg/ml）母液0.5 ml ,制备LB-AMP
固体培养基。
6、1 mol/L Tri-HCl Buffer ：800 ml水中加Tris 121.1 g 、浓HCl( pH 8.0时42ml、pH 7.6
时60ml、pH 7.0时70 ml)，用水定容至1L。
7、1 mol/L EDTA: 800 ml水中加EDTA-Na2-2H2O 372.2 g 、NaOH 约20g ，调pH至
8.0 ，用水定容至1L，高压。
8、GTE缓冲液[50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·Cl(P H8.0),10mmol/L EDTA]：高压灭
菌15分钟，贮存于4℃冰箱备用。注意：GTE缓冲液不可反复灭菌。
9、TE缓冲液[ 10 mmol/L Tris·Cl (P H8.0), l mmol/L EDTA ]：每100ml 蒸馏水加１.
０ml 1 mol/L Tris·Cl(pH8.0), 200 μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。
10、3mol/L乙酸钾溶液：29.5ml冰乙酸加KOH颗粒调至pH4.8，加双蒸馏水定容
至100ml。不必高压灭菌，室温下贮存。
11、无水乙醇和70%乙醇。
12、10% SDS
13、异丙醇
14、Tris饱和酚
15、氯仿
16、NaOH—SDS溶液：10mol/L NaOH 20 μl, 加双蒸馏水880μl，10% SDS 100μl ,
新鲜配制。
17、2μg/μl Rnase：用TE Buffer稀释。
[实验步骤]
1、将含有PUC-tem质粒的菌种接种于LB-AMP固体培养基上，37℃培养过夜。
2、挑取菌落接种到5ml LB-AMP液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长期备用。
3、取1.5ml对数生长期的菌体于Eppendorf管中，在台式离心机上8000rpm离心30
秒钟收集菌体。
4、弃上清，将Eppendorf管倒置在吸水纸上，吸干溶液。
5、加100μl GTE缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置5分钟。
6、加入200μl新鲜配制的NaOH—SDS溶液，颠倒混匀10次，然后置冰浴5分钟。
7、加入150μl预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5分钟。
8、在4℃下于台式高速离心机12000 rpm离心5分钟，并将上清移至另一支新
Eppendorf管中。
9、加入2μg/μl Rnase溶液 2 μl，37 ℃ 30 min。
10、加等体积酚、氯仿抽提一次，12000 rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新
Eppendorf管中。
11、加等体积氯仿抽提一次，12000 rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新Eppendorf
管中。
12、加0.6倍体积异丙醇，置冰浴3 0 min ，12000rpm离心10分钟, 弃上清。
13、沉淀用70%乙醇0.5 ml洗一次,弃上清，室温放置10分钟，挥干乙醇。
14、用30 μl TE溶解沉淀的DNA，置4℃保存，（不要吹打，放置10分钟后自然溶解）。质粒示意图：
实验二质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
[原理]
琼脂糖凝胶（agarose gel）电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的最常用的方法。不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离从100bp至60kb的DNA片段。在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，迁移速率越慢；而且还与DNA分子构型有关，对于分子量相同而构型不同的DNA分子来说，迁移速率为负超螺旋构型分子>线状构型分子>开环状构型分子。
质粒DNA在电泳体系中带负电向正极移动，由于质粒DNA有三种存在形式，（1）共价闭环DNA（covalently closed circμlar DNA，ccc DNA），常以负超螺旋构型存在；（2）开环DNA（open circμlar DNA，oc DNA），质粒DNA双链中有一条链发生一处或多处断裂形成缺口，可以自由旋转从而消除了张力，形成松驰的环状分子；（3）线状DNA（linear DNA），质粒DNA的两条链在同一处断裂而形成线状分子；因此，在电泳时，同一质粒的不同构型有不同的迁移速率，从而得到分离，从阳极至阴极分别为共价闭环DNA、线状DNA和开环DNA。
由于低浓度的荧光染料溴化乙锭(ethidum bromide，EB)会嵌入到DNA分子的碱基对中形成荧光复合物，在紫外线激发下发射荧光，其强度与DNA的含量成正比（肉眼观察可检出0.05-0.1 ug的DNA）。
因此，DNA在含有EB的琼脂糖凝胶中电泳结束后，可在紫外灯下观察质粒DNA在凝胶中的位置和含量。
[器材]
1、稳压稳流电泳仪
2、小平板电泳槽
3、紫外检测仪
4、照相机（带快门线及黄色滤光片）
5、黑白胶卷
6、微量进样器
7、移液器及吸嘴
8、胶带
9、Eppendorf管
10、眼科镊子
11、手术
[试剂]
1、TAE缓冲液
（1）贮存液：50×TAE：每升溶液中含242克Tris，57.1毫升冰乙酸，100毫升0.5mol/L EDTA(pH 8.0)。
（2）工作液：1×TAE
2、10×上样缓冲液：0.25%溴酚兰—40%（W/V）蔗糖水溶液。
3、1.0%琼脂糖：称1.0克琼脂糖，加100毫升1×TAE缓冲液，加热溶解。
4、10mg/ml溴化乙锭贮存液：1克溴化乙锭（溴化乙锭为核酸的荧光染色剂，有强烈的
诱变性和中度毒性，使用时需戴手套）用100毫升重蒸水溶解，避光保存。
[实验步骤]
1、准备小平板电泳槽，取出平板，用胶带封口，放回槽内，并插上样孔梳，调节上样孔
梳，使上样孔梳底部与凝胶模底板的距离为0.5-1.0mm。
2、将用1×TAE缓冲液配制的1.0 % 琼脂糖凝胶置微波炉或沸水浴加热使之熔化，冷却至
60℃后加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5ug/ml，混匀。
3、将琼脂糖凝胶趁热倒入平板达3—5毫米厚，静止40分钟让其完全凝固。
4、去掉平板两端的封口胶带，将凝胶随凝胶模一起放入加有足量的1×TAE缓冲液电泳槽
中（缓冲液浸没过凝胶面2—3毫米），小心拔出样孔梳。
5、取5μl质粒DNA，加入1 μl 6×上样缓冲液，混合后用微量进样器小心加入样品孔。
6、以靠近上样端接负极，另一端接正极，接通电源，以5v/cm（该距离为电泳槽两电极间
的距离，非凝胶自身的长度）的电压电泳30—60分钟。
7、电泳结束后，带上保护手套，倾去电极缓冲液，取出凝胶置透明薄膜上，在紫外灯下观
察电泳结果，并照相（光圈5.6、B门暴光2-5分钟）记录结果。
附表：
含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围
琼脂糖含量线性DNA分子的有效分离范围
[% （W/V）] （KB）
0.3 5 - 60
1 - 20
0.8 - 10
0.9 0.5 - 7
1.2 0.4 - 6
1.5 0.2 - 3
2.0 0.1 - 2
实验三质粒DNA的酶切、目的片段的纯化回收
[原理]
质粒DNA分子中含有限制性核酸内切酶的识别序列，如PUC质粒DNA含一个多克隆位点，在这个位点上具有EcoRI、BamHI、HindⅢ等十余种限制性核酸内切酶的识别序列，因此，在有关的限制性核酸内切酶的作用下，质粒DNA的环状结构可被切开，从而使之从共价闭环状或开环状转变为线状DNA。通过非酶切的质粒DNA及DNA分子量标准(mark)对照电泳可以鉴定分离纯化的质粒DNA。而且可以通过在紫外灯下切取含质粒DNA的凝胶，经高速离心或透析可回收质粒DNA片段。
[器材]
1、水浴锅
2、小平板电泳槽
3、电泳仪
4、Eppendorf管
5、微量进样器
6、移液器及吸嘴
7、透析袋
8、胶带
[样品]
PUC-tem载体和纯化的目的基因。
[试剂]
1、10×酶解缓冲液：购于供应酶的厂家。
2、限制性核酸内切酶EcoRI，Hind III
3、入DNA分子量标准
4、1.0 % 琼脂糖凝胶
5、-20℃预冷无水乙醇
6、TAE缓冲液
[实验步骤]
一、质粒DNA的酶切
1、质粒DNA酶切反应液的准备:在Eppendorf管中依次加入
双蒸水15 μl
10×酶切缓冲液 3 μl
质粒DNA 10 μl
EcoRI 酶液（10u/μl） 1 μl
Hind III 酶液（10u/μl） 1 μl
2、将装有上述反应液的Eppendorf管于37℃水浴保温1小时。通过72℃水浴15 min
终止反应，该反应液作为样品Ⅰ
3、以样品Ⅰ、未酶切质粒DNA样品和入DNA mark样品同时进行1.0 % 琼脂糖凝胶
电泳。
4、电泳结束后紫外灯下观察结果并照相。
二、电泳鉴定
以样品Ⅰ、未酶切质粒DNA样品和入DNA mark样品同时进行1.0 % 琼脂糖凝胶电泳(取5μ样品，与1μl6*载样缓冲液混匀)，经1%琼脂糖凝胶（含0.5ug/ml溴电泳30分钟，电压为5V/cm。在紫外灯下观察扩增的DNA片段，鉴定待检标本中DNA片段。
三、PCR 产物纯化
1、按300ul Binding Buffer I/100ul PCR 产物的比例加入Binding Buffer I，混匀；
2、把混合液转移到套放于收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟，6000rpm离心1
分钟；
3、倒掉收集管中的废液，加500ul Wash Solution到UNIQ-10柱中，8000rpm室温离心
1分钟；
4、重复步骤3一次；
5、倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，12000rpm室温离心15秒；
6、将UNIQ-10柱放入一新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30ul Elution Buffer或水
（pH>7.0），室温或37℃放置2分钟。
7、2000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段。
8、电泳检测回收的DNA片段。
注意：
⑴、Dnase、酚、SDS和高浓度的EDTA严重影响酶切效果，应避免污染。
⑵、DNA纯度对酶切消化非常重要，蛋白质、RNA影响酶切。
⑶、不同限制性内切酶缓冲液主要差别在于其所含NaCl浓度。当要用两种或两种以上酶酶切DNA时，如果这些酶在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时酶切；如果这些酶要求不同，则按下列方法进行：a: 先用低离子强度的缓冲液中活性最高的酶消化DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续温育。B: 用一种酶消化DNA后，以酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，将DNA复溶后再用第二种酶消化DNA。
⑷、内切酶在50%甘油中-20℃是稳定的，但甘油影响酶切效果，故酶的加入量不能超过反应总体积的十分之一。
实验四DNA片段的连接
[原理]
质粒DNA与目的基因的DNA经同一种或两种限制性核酸内切酶消化后，产生具有相同的粘性末端或平末端的DNA片段，在DNA连接酶及ATP存在时，具有相同末端的DNA 片段之间能重新生成磷酸二酯键，从而使DNA片段相互连接。
[器材]
1、冷冻恒温水循环仪
2、Eppendorf管
[材料与试剂]
1、T4 DNA连接酶(5U/μl)
3、EcoRI、Hind III 、质粒DNA 双酶切的质粒DNA
4、目的DNA片段（EcoRI、Hind III 双酶切）
5、5×T4 DNA连接酶缓冲液
[实验步骤]
1、连接反应混合液的准备：在Eppendorf管中依次加入：
a、2.0 μl经EcoRI、Hind III 双酶切的质粒DNA
b、4.0 μl目的DNA片段
c、2 μl 5 × T4 DNA连接酶缓冲液
d、1 μl T4 DNA连接酶
e、1 μl 重蒸水[1]
2、将Eppendorf管放入16℃水浴中过夜，反应产物用于转化。
注[1]：载体与目的基因的摩尔数之比应约为1：3-5 。当目的基因浓度过高（过低）时，可通过增加（减少）重蒸水和减少（增加）目的基因的加入量来调节。
实验五感受态细胞的制备和重组DNA的转化
[原理]
在水浴条件下，用0.1mol/L CaCl2溶液悬浮活化的E.coli DH5α菌，使其细胞膜的通透性增大而成为感受态细胞。当外源的重组质粒DNA与感受态细胞混合后在冰浴中孵育后，外源的重组质粒DNA就有可能进入感受态细胞内，并通过自我复制实现遗传信息的转移，使感受态细胞出现新的遗传性状，即感受态细菌的转化。不同程度稀释的转化反应液涂布于含抗生素、IPTG 和X—Gal的平板上，以37℃培养过液，平板上白色菌落即为已转化的感受态细菌。
[器材]
1、冰浴
2、离心机
3、恒温培养箱
4、摇床
5、721分光光度计
6、培养皿
7、Eppendorf管
[材料与试剂]
1、体LB培养基。
2、固体LB培养基。
3、蓝白斑试验培养基: 100ml液体LB培养基中加入1.4g琼脂粉，经高压灭菌后置55℃
水浴，恒温后加入IPTG 50 μl、X-Gal 50μl，氨苄青霉素（10 mg/ml）母液0.5 ml，混匀制平板。
4、0.1mol/L CaCl2溶液：
5、IPTG（异丙基—β—D—硫代半乳糖苷）：96mg/ml水溶液，-20℃保存。
6、X—Gal（5—溴—4—氯—3—吲哚—半乳糖苷）: 48mg/ml 二甲基甲酰胺溶液，-20℃
避光保存。
7、连接反应混合物
8、E.coli DH 5a菌株
[实验步骤]
一：感受态细胞制备
1、从新活化的E.coli DH 5a菌平板桃取一单菌落，接种于3—5ml LB液体培养基中，
37℃振荡培养12小时左右，至对数生长期。
2、上述菌液以1:50量接种于100ml液体培养基中，扩大培养至A600nm=0.7（振荡培养
2小时左右）。
3、培养液在冰浴中冷却片刻后，取1.5 ml菌液用1.5 ml 有盖离心管0—4℃ 4000 rpm
离心10分钟收集菌体。
4、去上清，用0.6ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴放置15—30分钟
5、0—4℃下4000rpm离心10分钟收集菌体。
6、倾去上清，加入0.2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，置于冰浴30分钟后
待用，或加15~20%的二甲亚砜置- 40℃保存备用。
二：重组DNA的转化
1、上述Eppendorf管中加入5 μl连接反应混合物（当用纯的质粒DNA时，加1 μl即
可），轻轻摇匀，冰浴中放置30分钟。
2、再于42℃水浴中保温3分钟，然后迅速在冰浴中冷却3—5分钟。
3、加入500 μl LB液体培养液，摇匀后于37℃温浴3 0分钟。
4、将上述转化反应原液及用LB液体培养液稀释适当倍数的反应液，并各取
0.1ml分别涂于含氨苄青霉素、IPTG和X—Gal的平板中（LB固体培养基）。
5、待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37℃培养过液，观察菌落。
注意：1：转化实验必须在低温中进行，温度波动严重影响转化效率，所有的试剂均应冰浴，细菌始终保持在4℃以下。
2：转化实验须做下列对照：
⑴用已知量的质粒DNA标准制备物转化感受态细胞，作为阳性对照。
⑵未加任何质粒DNA的TE 缓冲液转化感受态细胞，作为空白对照。
实验六重组子的筛选和鉴定
[原理]
挑取数个在上述含抗生素、IPTG和X—Gal平板上生长的白色菌落，经固体培养基扩大培养后的各个克隆分别抽提质粒DNA，用EcoRI单酶切及EcoRI和Hind III双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定含重组子的克隆，扩大培养并保存重组子。
[器材]
同实验一及实验二
[试剂]
1、质粒DNA提取试剂同实验一
2、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳试剂同实验二
3、限制性核酸内切酶EcoRI及Hind III
4、EcoRI 酶解缓冲液：同实验三
5、Hind III 酶解缓冲液：同实验三
6、入DNA分子量标准
[实验步骤]
1、在含抗生素，IPTG和X—Gal的平板上随机挑出数个白色菌落，分别在固体培养基上扩大培养。
2、对经扩大培养的各个克隆，分别刮取菌体（留下小部分待用）抽提质粒DNA。
3、将抽提得到的质粒DNA各分成三份，处理如下：
a、用EcoRI酶切
b、用EcoRI、Hind III 双酶切
c、不酶切（待用）
4、将经上述处理后的样品和入DNA分子量标准一起跑电泳（1.2%琼脂糖凝胶）
5、分析电泳图谱，鉴定含重组子的克隆，扩大培养后保存之。
实验七逆转录-聚合酶链反应-斑点杂交法检测细胞因子mRNA
[原理]
斑点杂交（enzyme linked sandwich hybridization）的基本原理是：设计一个与待测细胞因子mRNA的RT-PCR产物的一条DNA单链互补的用生物素标记的探针，探针与该DNA 链杂交，通过亲合素-生物素的亲合作用使检测探针与亲合素-辣根过氧化物酶结合。杂交后，加入亲合素-辣根过氧化物酶结合物及其底物，显色。
[器材]
1、DNA扩增仪
2、台式离心机
3、低温高速离心机
4、恒温水浴箱
5、旋涡混匀器
6、点样器
7、移液器（连续可调）
8、Eppendorf管(0.5ml)及tip头
[试剂]
1、人外周血单个核细胞的分离
①淋巴细胞分离液
②生理盐水（0.9%氯化钠溶液）
③白细胞稀释液：100ml 1%冰醋酸中加10g/L美蓝3滴。
2、总RNA提取
①DEPC处理水
②异丙醇（分析纯）
③70%乙醇
3、逆转录-聚合酶链反应
①AMV逆转录酶
②RNasin(20-40U/ul)
③随机引物
④脱氧核苷三磷酸（dNTP）
⑤逆转录缓冲液（5×）
⑥Taq DNA聚合酶
⑦TNF-α引物
⑧PCR缓冲液（10×）
⑨MgCl2(25mmol/L)
4、斑点杂交
①20×SSC
②封闭液：
③50×Denhardts：
④预杂交液/杂交液：
⑤洗涤液I：
⑥洗涤液II：
⑦洗涤液III：
[实验步骤]
一、人外周血单个核细胞的分离
1、用塑料吸管吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管。
2、取抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀后，用塑料吸管吸取稀释抗凝血沿管壁缓
慢加于淋巴细胞分离液上面（每人2管）。
3、将试管置离心机中，室温，2000rpm，20min。
4、用塑料吸管吸去最上层的血浆，再吸取单个核细胞层，加生理盐水至离管口1cm，
混匀后离心，2500rpm，5min。
5、去上清液，再次加生理盐水0.5ml ，转入1个Eppendorf管中，2000rpm，5min。
6、留细胞沉淀于Eppendorf管用于下一步的总RNA提取。
二、单个核细胞中总RNA抽提纯化：异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法
1、在留有细胞沉淀的Eppendorf管中依次加入500μL变性液、100μL氯仿/异戊醇(49/1)，
置旋涡混合器上混匀，冰浴15min。
2、4℃12000rpm，离心15min。吸取上层水相转入Eppendorf管中，加等体积异丙醇，
-20℃，0.5h。
3、4℃12000rpm，离心15min，倾去上层异丙醇，加入500μL 70%乙醇进行洗涤。
4℃12000rpm，10min，倒去70%乙醇，留沉淀真空烘干。
4、用10μL DEPC处理水溶解RNA，-20℃保存，备逆转录之用。
三、逆转录
1、按下列组成调制反应液：
样品总RNA 1.75μl
逆转录酶 1.0μl
随机引物 1.0μl
脱氧核苷三磷酸（每种dNTP各10mmol/L） 1.0μl
逆转录缓冲液（2×）5μl
RNasin(20-40U/ul) 0.25μl
DEPC处理水补至10μl
阴性对照用DEPC处理水代替RNA模板，其余成份相同。将上述反应成份加于
0.5ml Eppendorf管，混匀，简短离心。
2、42℃60min。90℃变性5分钟。逆转录产物于4℃保存。
四、PCR扩增
1、按下列组成调制反应液：
cDNA模板3μL
TNF-α引物（25umol/L） 1.0μL
脱氧核苷三磷酸（每种dNTP各2.5mmol/L） 1.0μL
PCR缓冲液（10×） 3.0Μl
Taq 1U
蒸馏的去离子水补至30μL
以逆转录阴性对照取代cDNA模板作为PCR阴性对照，将上述反应成份加于
0.5ml Eppendorf管，混匀，短暂离心，加入30μL石蜡油。
2、扩增: 94℃5min，然后按以下条件进行热循环：94℃45s，56℃30s，72℃30s,循环30
次。最后72℃延伸5分钟。
五、酶联杂交检测FGF-RT-PCR产物
1、PCR 产物变性：将PCR 产物用双蒸水1：8稀释后置沸水浴保温10分钟，取出后
立即置冰浴，5分钟后加等体积20×SSC，冰浴待用。
2、尼龙膜预处理：将尼龙膜放在用双蒸水上浸湿尼龙膜几秒钟后，置20×SSC溶液中
室温平衡5分钟（硝酸膜需1h）。
3、真空点样器处理：用0.1mol/L NaOH 清洗，水洗凉干。
4、将膜置真空点样器中，每孔加10×SSC 200 μl ，用较小负压抽干后再每孔加10×SSC
200 μl ，继续抽干。
5、点样：在真空点样器中，每孔加变性的PCR 产物100μl ，用较小负压抽干后每孔
加10×SSC 200 μl ，再继续抽干。
6、DNA交联：取出尼龙膜，室温干燥后置120℃烤箱中烤15分钟（硝酸膜置80℃烤
箱中烤2h）。或用紫外线交联仪(也可用透射紫外线灯)照射3分钟，将DNA交联到
尼龙膜上。
7、将3 ml预杂交液加入塑料试管中（按每cm2膜加0.20 ml预杂交液计算），置摇床
上42℃预杂交1小时。
8、打开塑料试管，吸弃预杂交液，加入用预杂交液稀释的20ng/ml寡核苷酸探针，混
匀后置摇床上摇动，42℃杂交1小时。同时，将洗涤液I、洗涤液II 置42℃预温。
9、洗涤：小心倒出杂交液，加5 ml预温的洗涤液I，轻轻振摇1分钟后取出杂交膜，
将杂交膜置另一塑料试管中，再加5 ml预温的洗涤液I，在42℃洗膜3次，每次5
分钟。再用洗涤液II 42℃洗膜2次，每次5分钟。取出杂交膜，置另一塑料试管
中（保持膜湿润，勿干燥）。
10、封闭：用封闭液37℃封闭15分钟，弃去封闭液。
11、加5 ml用封闭液1000倍稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，37℃ 30分钟。
12、洗涤：用洗涤液III洗涤4次，每次2分钟。
13、显色：用DAB显色液在暗处显色15分钟后，弃去DAB显色液，用水洗3次，每
次2分钟，观察结果。
[注意事项]
1、操作过程中均应当戴手套，以免手上的DNA污染样品。
2、尼龙膜的机械强度高于硝酸纤维素膜，但本底也高于硝酸纤维素膜。
3、20nt的寡核苷酸探针1nmol约等于6.60μg。
4、杂交特异性随洗脱温度升高、洗涤液盐浓度降低而增加；一般洗脱温度比杂交温度
高5-10℃，具体温度由预实验决定。洗涤液用量：每cm2膜1-2ml。
实验八逆转录-聚合酶链反应-微板酶联夹心杂交检测细胞因子
mRNA
[原理]
逆转录聚合酶链反应-酶联夹心杂交法（reverse transcription -polymerase chain reaction-enzyme linked sandwich hybridization）的基本原理是：利用逆转录酶催化dNTPs聚合成与细胞因子mRNA模板互补的单链DNA（即cDNA），以cDNA为模板在PCR反应系统中扩增cDNA，然后通过酶联夹心杂交法检测RT-PCR产物从而间接检测细胞因子mRNA。
酶联夹心杂交（enzyme linked sandwich hybridization）的基本原理是：设计两个与待测细胞因子mRNA的RT-PCR产物的一条DNA单链的不同区域互补，两个探针与该DNA链杂交，称为夹心杂交。其中一个探针5’端用氨基修饰，可与DNA结合微孔板表面包被的特殊基团（N-oxysuccinimide esters, NOS）发生共价结合，然后捕获待测细胞因子mRNA的RT-PCR产物，称为捕获探针；另一个探针称为检测探针，其5’端、3’端均用生物素标记，通过亲合素-生物素的亲合作用使检测探针与亲合素-辣根过氧化物酶结合。夹心杂交后，加入亲合素-辣根过氧化物酶结合物及其底物，显色，测量吸光度，根据吸光度值的大小对TNF-α mRNA进行半定量分析。
[器材]
1、DNA扩增仪
2、台式离心机
3、低温高速离心机
4、恒温水浴箱
5、旋涡混匀器
6、酶标仪
7、移液器器（连续可调）
8、DNA-Bind 微板
9、Eppendorf管(0.5ml)及tip头
[试剂]
1、人外周血单个核细胞的分离
⑧淋巴细胞分离液
分子生物学实验
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
建立一个分子生物学实验室所需的仪器
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
分子生物学实验
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳 一、目的 掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。 二、原理 1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH 12.0- 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的 质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。 2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、实验材料、仪器、试剂 （1）菌种：大肠杆菌DH5α （2）分子生物学试剂 10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。 50×TAE电泳缓冲液: 24.2g Tris 5.71g 冰乙酸 10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学实验课程教学大纲
分子生物学实验课程教学大纲 课程名称：分子生物学（Molecular Biology） 课程编号：1313072215 课程类别：专业课 总学时数：68实验时数：18 学分：3.5 开课单位：生命科学学院生物综合教研室 适用专业：生物技术 适用对象：本科（四年） 一、课程的性质、类型、目的和任务 分子生物学实验是生物技术专业一门必修的专业课，涵盖了分子与细胞生物学的许多内容，并与结构基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学、生物医学、分子病毒学、 分子免疫学等学科有着重要的联系。分子生物学实验课程教学以理论课教学为基础，理论与 实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设本课程的目的是使学 生掌握分子生物学实验设备的操作方法，使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养 学生的动手能力和科学研究能力，为学生学习生命科学中的其他相关课程作好基础准备。同 时也使学生具备分子生物学基本的实验技能，学会发现问题和解决问题的能力，为毕业后从 事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。 本课程的任务是通过实验教学，使学生了解和初步掌握分子生物学实验技术的基本原理 和方法，教学内容包括植物基因组DNA的提取、琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增目的基因 及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在实验内容和方法、技术上进行合理安排，力争让学生在有限的 课时中尽可能多地了解和掌握现代分子生物学基本理论和有关实验的基本方法和技术原理，并尽可能多地引进、介绍新的、先进的实验方法和技术，以开阔学生视野，提高学生的动手 能力和创造性思维能力，培养高素质的生命科学人才。 二、本课程与其它课程的联系与分工 学习和研究分子生物学的目的在于阐明生命活动的化学物质基础，并与其它学科配合，来揭示生命活动的本质和规律。《生物化学》、《细胞生物学》和《遗传学》是先修课程。 三、课程内容及教学基本要求 [1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”； 实验一植物基因组DNA的提取 植物基因组DNA的提取的目的及原理[1]；植物基因组DNA的提取的实验步骤及操作方 法[3]； 作业：提取的DNA呈褐色的原因及解决办法？ 实验二琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤[1]，琼脂糖电泳的实验方法[3]； 作业：琼脂糖凝胶电泳中电压如何设置？ 实验三聚合式酶联反应（PCR）扩增目的基因
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 2 实验二质粒DNA的提取 3 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9 实验八 RNA提取与纯化 11 实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15 实验十一感受态细胞的制备及转化 16 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18 实验十三 DNA分析——Southern杂交 19 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取
实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到 1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养 基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物
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分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分子生物学实验技术实验内容
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
分子生物学试验设计
分子生物学
利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法 1 研究背景 烟碱是影响烟叶品质和安全性的最主要的因素之一，是烟草栽培和烟草制品消费者追求的主要目的物，也是烟草具有商品价值的根本所在。烟碱合成的第一步是腐胺到N-甲基腐胺的转化，由腐胺-N-甲基转移酶(PMT)催化，而腐胺-N-甲基转移酶(PMT)是合成烟碱过程中的关键限速酶。目前，国内外鲜有将烟碱的快速积累跟烟碱合成关键酶的转录水平直接对应起来的报道。研究表明，打顶后可导致烟草中烟碱的快速积累。所以利用烟草打顶可以增加烟碱生物合成的特点，选择参与烟碱合成的关键酶腐胺-N-甲基转移酶(PMT)，利用半定量RT-PCR检测PMT基因表达变化；同时结合上部烟叶烟碱含量的测定结果，比较两者的变化是否成正相关。这种方法的建立有利于通过检测烟碱合成关键基因的表达来分析烟草中烟碱生物合成情况，增强了检测不同大田管理措施影响烟碱合成的力度。 2 材料与方法 2.1 试验材料 试验材料为普通烟草栽培种K326。烟苗培育采用漂浮育苗法，烟苗长到4叶时，用作水培试验，烟苗管理按常规的溶液培养方法进行。烟苗水培65d时打顶，于打顶后24 h时取样，取烟株的上部叶和根系进行试验。 2.2 测定烟碱含量 烟碱含量的测定采用王瑞新(2003)的紫外分光光度法。每个样品5个重复，数据分析采用student,t检验，显著水平为P<0.05。 2.3 RNA提取 提取打顶烟草和不打顶烟草根部总RNA，总RNA提取后，分别测260nm、280 nm处的吸光值，计算A260/A280的值，估计总RNA的纯度，通过A260的值对总RNA进行定量。在l％琼脂糖凝胶上检测总RNA的提取质量。 2.4 RT-PCR法检测PMT表达变化 取等量打顶处理和不打顶烟株的总RNA，用RT-PCR法检测PMT基因的表达变化。 3 预计结果 3.1 烟碱含量的测定 与对照相比打顶后烟碱含量显著上升 3.2 RNA电泳检测 总RNA提取后，经检测RNA样品纯度好，并没有发生降解，可用于cDNA 第一链的合成。 3.3 PMT引物和内参引物进行分管PCR