转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文

转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文

1 转基因小鼠技术概述

自其诞生以来的30多年里，转基因动物技术经过世界各国生物学家们的不懈努力，已经成为一项非常成熟的技术手段，极大的促进了相关生命科学领域研究进展，至今已经取得了辉煌的成就并且在不断得到改进和发展[2]。转基因技术运用于动物育种的研究始于70年代，经过近30多年的研究和不断发展，取得了突破性进展。1974年Jaenish和MintzIZI[3]通过微注射法向移植前的小鼠注射SV40病毒DNA，后在实验小鼠部份细胞中检测到该病毒的DNA，首次成功获得转基因小鼠，虽然该转基因小鼠传代的几率小。随着科学技术的不断进步，在1976年，Jaenish又通过反转录病毒感染小鼠的胚胎，将目标基因组整合到实验鼠中得到了能传代的转基因小鼠；1980年,Gordon等[1]首先用受精卵原核注射法,将疱疹病毒基因SV40DNA段和PBR32DNA段分别注射到小鼠原核期的胚胎中,获得了相应的转基因小鼠。1982年美国科学家Palmiter将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵后，获得了首批被称为“硕鼠”的转基因动物[4]。1985年，Hanahan等将SV40T抗原基因与大鼠胰岛素启动子(RIP)体外整合后导入小鼠早期胚胎细中，构建了SV40T抗原基因转基因小鼠，在小鼠体检测到特异性T抗原，T抗原表达时间的早晚影响转基因小鼠对T抗原的免疫应答：胚胎早期表达T抗原的小鼠对SV40T抗原发生免疫耐受，胰腺组织正常；胚胎晚期表达T抗原的小鼠体产生抗自身胰岛B细胞的抗体，出现自身免疫性糖尿病[5]。近年来，随着现代分子生物学和转基因动物技术的日臻完善，转基因小鼠及其他转基因动物逐渐成为现代医学及其他学科研究中的一个十分重要的工具。

纵观此间发展历程，转基因动物带来的不仅仅是一种全新的药物生产模式，极大地降低生物药品的成本和投资风险，为人类社会带来了新的经济增长点，如今的动物乳腺反应器生产的药物占所有基因工程药物的95％，带来了巨大经济效益，潜藏巨大的市场价值，相信随着应用的不断革新，其必将逐渐形成具有高额利润的新兴产业。另一方面，转基因动物技术在构建诊断和治疗人类疾病的动物模型等方面发挥了巨大作用。作为新生的前沿科技，在转基因动物的发展过程中也存在着一定的问题，需要科学工作者的不断探讨，但无可否认，转基因动物正以它特有的、潜在的优势蓬勃发展，相信随着理论和技术的不断完善，转基因

动物及其相关的产品必将进入真正的产业化和市场化阶段，为人类的生产和发展起着推动性的作用。作为全新的疾病研究平台，转基因动物也将为人类疾病研究提供便捷的研究条件，不断推进疾病研究，为人类健康作出前所未有的贡献。

2 转基因小鼠构建技术

2.1 转基因小鼠构建主要过程

转基因小鼠构建主要过程分为三步:第一步，明确实验动物在特定专业研究中的利害，根据研究需要建立相应的稳定繁育系统，按实验的动物质量标准进行遗传学、微生物学、饲养管理等方面的标准化。第二步，利用分子生物学技术制备目的基因，构建基因载体，再用转基因技术将该外源目的基因转入受精卵。第三步，分析评估含外源基因鼠的优缺点、生理生化特性及预测或解释外源基因在鼠体系统中的表型，用实验动物繁育技术(包括回交、侧交、杂交等)建立生物学性状限定的基因工程动物[6]。基因工程小鼠实验动物标准化的过程主要包括：首先，质量控制是标准化的基础，其中遗传、微生物和标准品系的保种育种是质量控制的核心。遗传质量标准按动物用途，选择各种近交系，利用杂交、回交等技术建立具有稳定遗传背景的小鼠品系，用PCR等技术测定外源基因的整合状况。微生物质量标准控制按微生物种类限定要求，用剖腹产技术和屏障饲喂技术分别产生无菌(GF)鼠、悉生鼠及SPF鼠。保种育种是转基因小鼠能保存及推广应用的关键，目前多采用胚胎冷冻保存鼠种或精子冷冻保种技术。其次，对工程鼠具有的优点和缺陷、生物学功能或疾病模型特性等详细资料登记注册，建立管理信息系统是基因工程鼠推广应用的前提，最后，还得建立并提供相关的繁育技术，如体外授精(IVF)、合子低温保存、胚胎移植、胚胎分割及保姆鼠等辅助繁育技术，这样才能保证基因工程鼠的广泛应用[7]。

2.2 构建转基因小鼠的主要技术

2.2.1 原核显微注射法

该方法是制作转基因动物应用最广、效果最好的方法，由美国人Cordon所发明。加州大学医学院The Ping Lin博士早在1966年即利用小鼠受精卵原核显微注射技术，系统地研究了微注射不同量外源物质(石蜡油、牛Y一球蛋白溶液)对小鼠胚胎受体移植后的分裂、发育的影响程度，并预见该技术用于研究小鼠或

其它种类哺乳动物胚胎分化及遗传效应具有潜在价值[8]。直到1980年，随着分子生物学技术的迅速发展，Gordon等[1]首先用受精卵原核注射法,将疱疹病毒基因SV40DNA段和PBR32DNA段分别注射到小鼠原核期的胚胎中,获得了相应的转基因小鼠后，该项技术在建立人类疾病动物模型，加速哺乳动物育种进程、研究真核生物(主要是哺乳动物)基因表达调控机制，以及在哺乳动物特异组织(如血液、乳腺)系统生产人的药用蛋白等方面，展示了广阔的应用前景。

该方法通过将外源基因或体外构建的目的基因在显微操作仪下用极细的微吸管直接注射到处于原核期的受精卵原核中，再将注射后的受精卵体外培养数小时后移植到母畜体，从其后代中获得转基因动物。通过该方法可以把较大片段的重组DNA注入原核，获得的转基因动物能有效地表达外源基因，是获得转基因动物最可靠的方法。Palmiter等[4]人于1982年首次采用该技术成功地将人的生长激素基因，导入小鼠受精卵的雄原核中，并获得整合及表达该外源DNA的超级转基因“硕鼠”后，新型“硕鼠”比普通对照小鼠生长速度快2-4倍，体型大一倍，开创了显微注射技术用于培育转基因哺乳动物的里程碑。随后，Hammer等[5]又应用该方法相继获得了转基因兔、转基因绵羊、转基因猪，Roschlau、Ebert等[9]利用该技术获得转基因牛及转基因山羊。此外，采用该项技术，除了培育转基因哺乳动物之外，朱作言等人于1986年育成了转基因鱼及转基因鸡[10]，这也间接证明显微注射方法在培育转基因动物上的广阔前景。但该法成本较高、转基因效率较低，只能在受精卵的原核期进行转基因操作，而且导入的外源基因为单位点、多拷贝整合，这样的整合方式容易导致外源基因首尾相连，给整合位点的克隆带来困难，不利于研究基因的结构、功能及表达调控，同时，该方法只能使DNA 量增加，不能删除或在某个位点修饰，而且整合有较大的随机性，也不能定点整合。当外源基因被注入到原核后，可以插入到受体染色体基因组任何一个的部位，完全随机，基因的表达和遗传稳定性得不到保证[11]。

2.2.2 体细胞核移植法

图1 细胞核移植法生产转基因动物的基本流程。 Fig..1 The basic process of production of transgenic animals using nuclear transfer.

哺乳动物体细胞核移植研究的蓬勃发展始于 “Dolly ”羊的诞生。1997年，英国Roslin 研究所的Wilmut 等[12]利用成年绵羊乳腺上皮细胞作为核供体，成功获得了体细胞克隆绵羊“Dolly ”，拉开了动物体细胞克隆的帷幕。同时，相对其他哺乳动物而言，小鼠由于其繁殖周期短、材料来源比较容易，成为重要的模式实验

动物。

如今，

已经

利用卵丘细胞、雄性小鼠尾尖细胞、ES 细胞、卵泡上皮细胞、尾尖成纤维细胞、转基因ES 细胞、未成熟支持细胞、颗粒细胞、胎儿成纤维细胞、未成熟神经细胞和已分化的神经细胞以及10.5 d 胚胎的原生殖细胞等多种细胞成功克隆了小鼠，并且把核移植技术和胚胎干细胞技术相结合也获得了来源于T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和嗅觉神经元的克隆小鼠，另外小鼠的再克隆研究也获得了成功，得到了第6代再克隆小鼠 [13]。伴随克隆技术的不断发展，利用携带外源基因的培养细胞进行核移植的方法逐步建立。该技术主要包括两个步骤:首先，将外源基因插入体外培养的动物体细胞染色体的特定位点。然后，筛选出阳性克隆，通过特定的移植手段（常用的有：“Honolulu ”法、连续核移植法、电融合方法、二倍体-四倍体嵌合体法）[14]将阳性克隆移植到去除细胞核的卵细胞中，产生重构胚胎，再将重构胚胎移植到动物母体中，从其后代获得携带目的基因的个体。优点：减少受体动物的数目，不需要受体母畜承担非转基因胚胎，表现出强大的生命力；事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞的筛选，简化了转基因动物生产的许多环节，节约了人力。但目前，该技术还不成熟，很多技术细节还有待完善和提高。

2.2.3 反转录病毒载体法

图2 反转录病毒法生产转基因动物的流程。

Fig. 2 The process of production of transgenic animals using retrovirus method.

该方法主要利用反转录病毒LRs(长末端重复序列)区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因插入反转录病毒的基因组中，病毒感染寄主细胞后，外源基因就被整合到受体基因组中。具体方法是在动物早期胚胎的培养液中加入载体病毒，或将胚胎与病毒细胞共培养，还可以把载体病毒注入囊胚腔中获得转基因动物。1974年，Jaenishch等[3]将SV40病毒 DNA注入小鼠胚腔中，获得了体有SV40 DNA 整合的转基因小鼠。1975年，Jaenish用小鼠(Moloney)白血病毒(MoMLV)作为载体，将外源基因导入小鼠胚腔中，发现病毒转染的小鼠胚胎可以发育成携带病毒基因的小鼠，MoMLV可在成年小鼠体重新被激活，使小鼠发生白血病。1998年，Bremel等将逆转录病毒直接注入卵母细胞中获得了转基因牛。体细胞核移植技术是研究细胞核-质关系的重要手段[15]。由于小鼠是重要的模式动物,其遗传背景相对较清楚，因此具有更加重要的意义。该方法是目前应用较成功的一种转基因方法，操作简单，能有效将目的基因以单拷贝形式插入宿主染色体，基因表达效率较高。但该法成功率较低，产生的转基因动物多为嵌合体，病毒载体构建复杂，转入的外源基因大小收到限制，容易发生转入病毒自身基因的复制表达。

2.2.4 胚胎干细胞介导法

图3 胚胎干细胞法生产转基因动物的流程。

Fig. 3 The process of production of transgenic animals using embryonic stem cell method.

经过20多年的发展,动物转基因技术在其多样性和实用性方面均取得了显著的进步。尤其是随着近几年发展的几项新技术,使转基因动物的研究发生了历史性的飞跃。通过生殖干细胞介导的转基因技术、对胚胎干细胞以及体细胞等进行基因打靶的定点整合转基因技术、RNA干扰介导的基因沉默技术以及诱导多能干细胞(iPS)技术，大大提高了转基因动物制备效率,使基因表达的精确调控成为现实。胚胎干细胞(ES细胞)是指囊胚期的细胞团中尚未进行分化的细胞，这种细胞具有类似癌细胞的无限繁殖和高度分化潜能，将目的基因转入ES细胞后将其重新导入囊胚或对转入外源基因的ES细胞进行克隆，可培育出转基因个体[16]。1986年，Roberoton等利用携带neo基因的逆转录病毒载体转化小鼠的ES细胞，将转化后的ES细胞注入小鼠的囊胚中，获得了有neo基因表达的转基因小鼠。此后，Piedrahita等于1988年从猪胚胎中获得了干细胞克隆系，Stirce和Srtethenko等1996年获得了牛的胚胎干细胞，为转基因在动物上的定点整合开创了新的领域。利用该方法，外源基因的整合率较高，但产生的转基因动物均为嵌合体，不易建立ES细胞系[17]。所以，目前其应用受到限制。

2.2.5 精子载体法

图4 精子载体法生产转基因动物的流程。

Fig. 4 The process of production of transgenic animals using sperm carrier method.

精子载体法是一种直接用精子作为外源DNA载体的基因转移方法，将精子直接与外源DNA混合培养，利用共孵育法、电击法、脂质体法等方法促进外源DNA 与动物精子结合使外源基因进入精子头部，精子与卵子结合后能直接发育成转基

因动物，但外源基因的整合率比较低。1989年，Lavitrano等[18]首次报道用精子作为载体进行转基因获得了转基因小鼠。十年后，Anthony等[19]改进了这种方法，他先用去垢剂、冻融或冻干等损伤小鼠精子的外膜，使外源DNA可穿过外膜，吸附于膜，接触到高密度的精子DNA，然后将精子注入M II期的小鼠卵子中，获得表达外源基因的胚胎，再将桑葚胚或囊胚移至假孕母鼠的子宫，从其后代群体中获得携带外源基因的小鼠。该方法利用精子的自然属性，克服了人为机械操作给胚胎造成的损伤，整合率较高，成本较低，但转基因效果不稳定，无法早期验证修饰事件。

2.2.6 电脉冲法

电脉冲法又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜，运送到细胞核。目前，在动物中电脉冲法主要用来转化胚胎干细胞。

2.2.7 其他方法

除上述几种常用的转基因方法外，人们为了一些特殊需要还探索出一些其他方法，如畸胎细胞介导法、受体介导法、染色体片段显微注射法、高效微弹法等，但这些方法均因不太成熟而未被广泛使用。

3 转基因小鼠应用

3.1 人类疾病小鼠模型

近年来，随着分子遗传学和转基因技术的不断发展和完善，转基因小鼠与生命科学研究的关系越来越密切，比如利用转基因技术构建的转基因小鼠作为疾病模型，在疾病机理研究还是在药物筛选方面都比传统的动物模型更省时、省力。许多种转基因小鼠模型的不断建立，已经为神秘的生命科学研究提供了十分便捷的研究平台。

3.1.1 肿瘤疾病模型

该技术在肿瘤研究中主要用于创建转基因的肿瘤小鼠模型。转基因小鼠技术