文档图位克隆原理及应用
位克隆技术的原理及其在分离玉米基因中的应用刘朝显2010.11.3 2 内容摘要图位克隆技术的基本原理1 图位克隆的技术环节 2 图位克隆在分离玉米基因中的应用 3 一. 图位克隆技术的基本原理 1. 图位克隆（Map-based cloning）: 定位克隆（position cloning）,1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出。正常遗传学 2. 基本原理：根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，通过染色体步移(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。 3 3. 图位克隆技术的优越性与局限性优点：不需要事先了解目的基因的表达产物，这为克隆许多有重要经济价值的农作物基因提供了有效的手段，因为这些基因的产物大多都是未知的。缺点：基因组中的重复序列导致染色体步移困难，甚至将步移引入歧途。 4 一. 图位克隆技术的基本原理 4. 图位克隆示意图 5 一. 图位克隆技术的基本原理M1 M2 Gene 连锁标记的筛选M1 M2 Gene 初定位M3 M2 Gene 精细定位M3 M4 M5 M6 M7 M8 合成探针筛选基因组文库转基因功能验证BSA，NIL 300左右5000左右二. 图位克隆的技术环节 6 1.定位群体的构建⑴亲本选择原则:选择高度纯合，遗传差异大，DNA多态性丰富的亲本（实现基因精细定位的重要前提）可选用多个亲本进行多态性筛选⑵定位群体的组配：基因的定位是基于分离后代中交换单株出现的频率大小而实现的，因此组配一个遗传信息多群体大小适中的分离群体尤其重要。BC1,F2 非永久性群体群体类型RIL,DH，NIL 永久性群体 2. 初定位(玉米：100-350株) 近等基因系（near-isogenic line,NIL ）法: 近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体, 这可通过连续回交的途径获得。由于NILs 的遗传组成特点, 一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近。7 二. 图位克隆的技术环节Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants wi t h large genomes. Tanksley et al.1995 8 二. 图位克隆的技术环节集团分离分析法（bulked segregant analysis, BSA）: 将分离群体中研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病) 分成2组，将每组内一定数量的植株DNA等量混合，形成2个池，这2 个池仅在目标性状(如抗病性)上有差异。利用分子标记技术寻找2 个池的扩增谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因连锁。9 Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes. Tanksley et al.1995 10 M1 M2 二.
图位克隆的技术环节P1 P2 F1 P2 BC1 初定位示意图Recombinant 1 Recombinant 2 Marker I Marker II Target gene 3. 精细定位（玉米4000株）11 二. 图位克隆的技术环节MarkerI MarkerIII MarkerV MarkerVI MarkerIV MarkerII Target gene 上游交换单株下游交换单株 4. 构建高质量、容易操作的大片段基因组文库在基因的图位克隆技术中，高质量的基因组文库的构建也是克隆成功的关键。 YAC: 插入片段大（100-2000Kb）,加速染色体步移; 嵌合情况严重，遗传不稳定，插入片段内部重排或者缺失，插入片段分离难，转化效率低。BAC：片段插入一般在150Kb左右。嵌合现象少，以大肠杆菌为寄主，转化效率高，提取容易，用途广泛。柯斯质粒文库：兼具了质粒和λ噬菌体两方面的特性插入片段最大可达45kb。 12 二. 图位克隆的技术环节 5. 鉴定目标基因利用与目标基因连锁的分子标记筛选基因组文库（PCR 反应或者菌落杂交），鉴定阳性克隆，并进行亚克隆测序，预测基因，确定候选基因。候选基因的确定：（1）比较候选基因序列在野生型与突变型之间的差异，确定在二者之间变异的cDNA 序列; （2）证实候选基因的时空表达模式与目标性状的表现相同; （3）转化候选基因，进行遗传互补实验，这是最直接、最终鉴定基因的方法。13 二. 图位克隆的技术环节三. 图位克隆在分离玉米基因中的应用1992 年应用图位克隆技术首先在拟南芥中成功分离基因ABI3和FAD基因。随后利用图位克隆技术又成功的从拟南芥、水稻、大麦、玉米和番茄等植物中克隆到了多个基因。随着测序技术的发展，拟南芥、黄瓜、水稻、玉米、高粱、大豆等植物的基因组测序已经完成，海量的SSR、SNP、In/Del、CAPS、dCAPS分子标记大大促进了图位克隆的速度。14 15 三. 图位克隆在分离玉米基因中的应用Vgt1 (Vegetative to generative transition 1) Toward positional cloning of Vgt1, a QTL controlling the transition from the vegetative to the reproductive phase in maize PMB. 2002 tga1 (teosinte glume architecture) The origin of the naked grains of maize. Nature. 2005 ramosa2 ramosa2 Encodes a LATERAL ORGAN BOUNDARY Domain Protein That Determines the Fate of Stem Cells in Branch Meristems of Maize
The Plant Cell 2006 R TCS (rootless concerning crown and seminal roots) The maize R TCS gene encodes a LOB domain protein that is a key regulator of embryonic seminal and post-embryonic shoot-borne root initiation The Plant Journal.2007 spi1 (sparse inflorescence1) sparse inflorescence1 encodes a monocot-specific YUCCA-like gene required for vegetative and reproductive development in maize PNAS.2008 bde (bearded-ear) bearded-ear Encodes a MADS Box Transcription Factor Critical for Maize Floral Development The Plant Cell 2009 ts1 (tasselseed1) tasselseed1 Is a Lipoxygenase Affecting Jasmonic Acid Signaling in Sex Determination of Maize Science. 2009 Tsh1 (tassel sheath) A Conserved Mechanism of Bract Suppression in the Grass Family. The Plant Cell 2010 ……三. 图位克隆在分离玉米基因中的应用? sparse inflorescence1 encodes a monocot-specific YUCCA- like gene required for vegetative and reproductive development in maize (Paula Mc Steen et al. PNAS.2008) ?玉米突变体基因Vg1 (Vestigial glume)的图位克隆16 17 Position cloning of spi1 Mutant Phenotype 18 spi1 Alleles : The spi1-ref allele was identified in a Mutator transposon mutagenesis screen. spi1-125 and spi1-E914 were obtained from the R escue Mu population spi1–01-008–16 was originally identified in an EMS screen 19 Materials Materials 20 F2 population (spi1 :spi1 210 mutants) Mutant (spi1–01-008–16) × B73 F1 F2 Methods The spi1–01-008–16 mutant was initially mapped to chromosome 3 by linkage to the SSR marker umc2008. 21 Methods 22 spi1 Encodes a YUCCA-like Flavin Monooxygenase Thanks for your attention!
【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
克隆技术简介
克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。
连续调图像阶调复制的原理
连续调图像阶调复制的原理 连续调图像的明暗层次（阶调），在印刷品上可以通过两种方法来表现。一种是利用墨层厚度的变化，如凹版印刷。一种是利用网点覆盖率，如凸版印刷、平版印刷、孔版印刷等。 一、网点对图像阶调的传递 图3－1中的（A），是一张用制版照相机拍摄的连续调阳图底片，用它晒制出PS版（平版），经过印刷，得到了如图3－1中的（B），底片上的明暗层次全部丢失了，只有黑白之别，这 PS版的和度片中间调相对应的感光层，在晒版时，得不到足够的光量发生光化学反应，显影时被冲掉，形成图像的基础被破坏而造成的。
图3－1 网点对阶调的传递 为了把原稿上图像的明暗层次再现出来，必须制作出加网的阳图或阴图底片，将图像分割成许多不连续的点子，再转晒到印版上，而后用来印刷。印张上单位内，点子的总面积大，则油墨覆盖率高，反射光线少，吸收光线多，使人感到阴暗；印张上单位面积内，点子的总面积小，油墨复盖率低，反射光线多，吸收光线少，给人以明亮的感觉，这样原稿图像的浓淡层次，在印张上便可得到再现。 原版上的眯，中网技术形成的，叫做网点。在凸版、平版、孔版等印刷中，网点是构成连续调图像的基本印刷单元。通过图像处理，在印刷品上由这种图像单元与空白的对比，达
到再现连续调的效果。 二、网点的特性 在印刷图像处理中，按照加网的方法，分为AM网点和FM网点。 （一）ATM网点 ATM网点是传统的最常用的网点，也叫调幅网点。一般是在照相机上，利用网屏或在电子分色要上，通过网点发生器，用激光束进行电子加网形成的。 网屏有玻璃网屏和接触网屏，如图3－2所示。由于网屏的网孔呈现有序的排列，因此，形成的网点在空间的分布不仅有规律，而且单位面积内网点的数量是衡定不变的，原稿上图像的明暗层次，依靠每个网点面积的变化，在印刷品上得到再现。对应于原稿墨色深的部位印刷。 玻璃网屏 接触网屏 图3－2 品上网点面积大，接受的油墨最多；对应于原稿墨色浅的部位，印刷品上网点面积小，接受的油墨量少，这样便通过网点的大小反映了图像的深浅。 1．网点覆盖率
基因图位克隆的策略与途径
基因图位克隆的策略与途径 拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物，具有基因组小(125 Mbp ) 、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。同时，拟南芥属十字花科(Cruciferae),具有高等植物的一样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，专门是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活紧密有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。 基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有生命活动的基础。不论 要揭示某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第一将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 用该方法分离基因是按照目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA 序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了(图1)。
数字图像处理
数字图像处理(MATLAB版) 实验指导书 (试用版) 本实验指导书配合教材和课堂笔记中的例题使用 姚天曙编写 安徽农业大学工学院 2009年4月试行
目录 实验一、数字图像获取和格式转换 2 实验二、图像亮度变换和空间滤波 6 实验三、频域处理7 实验四、图像复原9 实验五、彩色图像处理10 实验六、图像压缩11 实验七、图像分割13 教材与参考文献14
《数字图像处理》实验指导书 实验一、数字图像获取和格式转换 一、实验目的 1掌握使用扫描仪、数码相机、数码摄像级机、电脑摄像头等数字化设备以及计算机获取数字图像的方法； 2修改图像的存储格式；并比较不同压缩格式图像的数据量的大小。 二、实验原理 数字图像获取设备的主要性能指标有x、y方向的分辨率、色彩分辨率（色彩位数）、扫描幅面和接口方式等。各类设备都标明了它的光学分辨率和最大分辨率。分辨率的单位是dpi，dpi是英文Dot Per Inch的缩写，意思是每英寸的像素点数。 扫描仪扫描图像的步骤是:首先将欲扫描的原稿正面朝下铺在扫描仪的玻璃板上，原稿可以是文字稿件或者图纸照片；然后启动扫描仪驱动程序后，安装在扫描仪内部的可移动光源开始扫描原稿。为了均匀照亮稿件，扫描仪光源为长条形，并沿y方向扫过整个原稿；照射到原稿上的光线经反射后穿过一个很窄的缝隙，形成沿x方向的光带，又经过一组反光镜，由光学透镜聚焦并进入分光镜，经过棱镜和红绿蓝三色滤色镜得到的RGB三条彩色光带分别照到各自的CCD上，CCD将RGB光带转变为模拟电子信号，此信号又被A/D变换器转变为数字电子信号。至此，反映原稿图像的光信号转变为计算机能够接受的二进制数字电子信号，最后通过串行或者并行等接口送至计算机。扫描仪每扫一行就得到原稿x方向一行的图像信息，随着沿y方向的移动，在计算机内部逐步形成原稿的全图。扫描仪工作原理见图1.1。
《图像处理及制版原理》复习重点
《图像处理及制版原理》复习重点 1.图像的定义和分类； 2.网点的类型和特点； 3.调幅：网点面积率、加网线数、网点形状、网线角度的概念； 4.调频：网点直径、综合积分面积率； 5.网点特性对图像复制的影响：网点传递、网线角度安排、龟纹和玫瑰斑的区 别、MD方程、网点扩大的类型和相关因素； 6.阶调和层次概念、层次曲线、曲线数据值和斜率(导数)的意义； 7.分色概念、分色方法基本类型(密度法/色度法)、UCR/GCR概念、相同和差异； 8.中性灰平衡的概念； 9.RIP的任务和作用； 10.图像数字化概念、采样定理； 11.图像输入设备(扫描仪/数字相机)的类型、特点、工作原理、光电转换器件的 类型； 12.扫描分辨率、数字相机的分辨率：扫描分辨率或图像采集像素数与印刷尺寸 关系的计算、像素面积的计算、数字相机像素数与图像质量的关系； 13.图像像素数、图像数据量的计算(按图像色彩模式、像素行列数等)； 14.图像灰度阶调分布类型（高调、低调、中调、高低调）、分布频率的计算； 15.图像层次曲线处理的查找表(LUT)方法； 16.JPEG图像压缩的基本方法和手段； 17.色彩管理的目的和基本原理、色彩传递偏差的来源（输入设备和印刷过程）、 色域压缩/剪裁的几种方式（可感知、相对色度、绝对色度）； 18.记录设备的类型、工作原理概述、计算机直接制版与激光照排技术的差别； 19.电子雕刻机的基本工作原理、凹版类型及其网穴特点； 20.记录分辨率、记录光斑尺寸； 21.记录网点图像的层次级数与记录分辨率、加网线数的关系； 22.滚筒型记录设备输出速度的计算。 23.记录网点面积率误差的补偿的基本方法（不要求计算）； 24.数字调幅加网的基本原理、RTS与超细胞加网技术的特点。
拟南芥的图位克隆技术
拟南芥基因的图位克隆技术 浙江大学生命科学学院徐冰 浙江杭州310029 1 国内外研究现状 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。 从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。 图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002） 图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。 目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中
基因克隆技术的研究进展_钟军
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.360docs.net/doc/c010464752.html,
基因图位克隆的策略与途径拟南芥
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
图位克隆基因研究进展
图位克隆基因研究进展 宋成标 摘要图位克隆是在不清楚基因产物结构和功能的情况下，根据基因在染色体上都有稳定的基因座实现的。随着各种分子标记技术和高质量基因组文库构建技术的发展，图位克隆现已经成为分离生物体基因的一种常规技术。本文主要概述了图位克隆的一般步骤，包括目的基因的初步定位、精细定位和遗传做图、染色体步行和登陆及利用功能互补实验鉴定目的基因。最后，对图位克隆技术存在的局限和发展前景作了初步的分析。 关键词图位克隆, 分子标记, 精细定位, 基因组文库 Abstract Map-based cloning is based on the functional genes have their particular gene locus on chromosomes,when we know about the structure and function of gene products unclearly.With the rapid development of molecular marker technologies and constructing high quality genomic library technologies, map-based cloning had already become a common bio—technique for gene isolation. This article summarized mainly the processes of the map-based cloning in principle,including first-pass mapping of candidate gene、fine scale-mapping and building genetic map、chromosome walking or landing and finally complement experiment for identifing candidate gene. Finally the problems and the prospects in the map-based cloning are analyzed Keywords Map-based cloning, Molecular marker, Fine maping, Genomic library 从遗传学观点来看，基因克隆有两条途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表型突变去进行，如传统的功能克隆及近年来迅速发展的表型克隆；反向遗传学途径是根据被克隆的目的基因在染色体上都有稳定的位置来实现的。由于在多数情况下，我们并不清楚基因产物的结构和功能，很难通过正向遗传学途径克隆基因，而反向遗传学途径则显示了较好的前景。其中可以利用的主要有三种方法，分别是转座子标签法、随机突变体筛选法和图位克隆法。转座子标签法中受转座子的种类、转座频率及有些植物存在内源转座子等的影响，随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量等，限制了它们的应用。图位克隆（map-based cloning）又称为定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Coulson 等提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。随着模式物种（拟南芥、水稻）全基因组测序的完成，各种分子标记技术的发展促进了高密度分子标记连锁图谱的建立和各种数据库的完善。图位克隆技术越来越成熟，已经成为分离生物基因的一种常规方法。本文将对图位克隆技术的相关策略作一介绍。 1图位克隆的策略 自1992年图位克隆技术首次在拟南芥中克隆到ABI3(Girauda et al., 1992)基因和F AD3 (Arondel et al., 1992)基因以来，图位克隆技术在其它相关技术快速发展的支持下迅速发展起来。它是依据功能基因在生物基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选已构建的DNA文库（如Cosmid、YAC、BAC等文库），构建出目的基因区域的遗传图谱和物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行、跳跃或登陆的方式获得含有目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补实验来验证所获得的目的基因（图1）。 初步定位（First-pass maping）-------构建遗传图谱（constructing genetic map）-----精细定位（fine maping）---------构建物理图谱( constructing physical map)------染色体步移、登陆（chromosomal walking、landing）-------确定侯选基因（Consider candidate genes）----遗传互补验证目的基因（Through genetic complementation (transformation) to identify candidate gene）（请帮我画一个简易图表，把内容填进去） 图1 图位克隆的主要步骤 Figure 1 Key steps in map-based cloning process
功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
基于光谱的颜色复制技术_王海文
工艺与技术 9 开创印刷颜色复制历史的新纪元。 件的解码，从而以多通道的方式显示在成像设备上， 不考虑“真实”的 颜色复制 考虑“近似真实”的 颜色复制 考虑“色度真实”的 颜色复制 考虑“色貌真实”的 颜色复制考虑“人文真实”的 颜色复制 原始印刷近代印刷现代印刷原始颜色复制经验色彩管理现代色彩管理光谱颜色复制 融合颜色复制 当代印刷（高保真）未来印刷图１ 印刷颜色复制发展历程示意
工艺与技术 2007.5３）多光谱颜色复制的工艺流程：多光谱颜色复制的基本工艺流程为：首先经多光谱相机获取原稿或实物的多光谱数字图像和高分辨率图像，而后把两种图像进行融合，并进行光谱数据的重建，然后把数据传输至输出端，并进行数据的解码，最后据光源 多光谱数据的编码 数据的解码及控制 多光谱相机 数据的传输 多通道显示 多光谱滤色片 图２ 多光谱颜色复制原理 图３ 孟塞尔实验室基于多光谱技术的颜色复制流程 多光谱数字图像 的获取 高分辨率图像 色度和色貌 变换图像融合 光谱重建 色域映射显示器特性化 普通打印机特性化 基于光谱打印分离的最小同 色异谱多原色直接数字打印 开放式通道
工艺与技术 《丝网印刷》征稿启事 《丝网印刷》主要报道国内外网印及制像业的新工艺、新材料、新设备和新技术，沟通国内外供需 信息，辟有工艺与技术、材料与设备、数字化技术、业者论坛、行业展望、新技术园地、技术讲座、经 验谈、初学者等栏目。热忱欢迎全国各地网版印刷、数码印刷、 标牌制作、广告制作、包装印刷、特种印刷的专家、企业管理 者、工程技术人员和生产操作人员踊跃投稿。 来稿要求和注意事项：１．文稿务求具有实用性及可读性，观 点明确，数据准确，行文简明流畅，长短不限；２．文稿请用方格 纸书写或用计算机打印，也可发送电子邮件，如有可能请提供与 文章相关的图片或照片；３．编译文稿请提供原文；４．来稿请自 留底稿，一般不退稿。稿件请注明作者的详细地址、邮编、联系 电话及身份证号码；５．切忌一稿两投。来稿一经刊用，稿酬从优， 并寄赠当期样刊２本。
水稻基因的图位克隆技术
水稻基因的图位克隆技术 吴自明 (江西农业大学,作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室,农业部双季稻生理生态与栽培重点实验室,江西省作物生理生态与遗 传育种重点实验室,江西南昌330045) 摘要 综述了水稻图位克隆技术的原理、技术环节及其在水稻基因克隆上的应用,分析了当前存在的主要问题,并对其应用前景作出了展望。 关键词 水稻;图位克隆;基因 中图分类号 S 511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)34-14905-02 Map based C lo ning T echnique of R ice Genes WU Zi m ing (Key Laboratory of C rop Ph ysiology,Ecol ogy and Genetic B reeding,Mi nistry of Ed ucation,Key Laboratory of Ph ysiology,Ecology and C ultivati on of Double C roppin g Rice,Mini stry of Agriculture,Key Lab oratory of Crop Physi ology,Ecology an d Genetic Breedin g of Jian gxi Province,Jiangxi Agricultural Uni versi ty,Nanchang,Jiangxi 330045)Abstract The p rinciple an d tech nical links of m ap based gene cloni ng techniq ue i n rice an d its applications in the gene cloni ng of rice were s um ma rized .And the mai n existing problems at present were analyzed .And its applicati on foregrou nd was p redicted.Key w ords Rice;Map based cloni ng;Gene 基金项目 江西省教育厅项目(GJJ09477);江西农业大学博士启动基 金;江西农业大学校自然科学基金。 作者简介 吴自明(1974-),男,江西鄱阳人,副教授,从事植物分子 生物学研究。 收稿日期 2008 10 06 近年来,水稻基因组研究进展非常迅速,高密度遗传图谱和物理图谱的构建,全基因组序列的公布,数以万计ES T 、全长c DN A 等序列及功能分析数据的释放以及新型水稻分子标记及其高效检测技术的发展等,为基因的图位克隆带来了新的思路和方法。同时,这些新的进展也能够使基因的精细定位和物理图谱构建等相关工作大大简化,使基因的图位克隆朝着更加简便、快速的方向发展。1 图位克隆技术原理 图位克隆(Ma p based Cloning)又称定位克隆(Positional Cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan Co ulson 提出[1]。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行,无需预先知道基因的D N A 序列,也无需预先知道其表达产物的有关信息,而是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。 近几年来,水稻各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的日趋完善,在很大程度上得益于以粳稻日本晴和籼稻9311为代表的基因组测序的完成[2-3]。目前已有几十种技术可用于分子标记筛选,其中最常用的是简单序列长度多态性(SSLPs)、单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失多态性(Inser tio n/Deletio n,InDel)[4-7]。Shen 等利用日本晴和9311基因组序列构建了水稻基因组水平的D NA 多态性数据库,其中包括1703176个单核苷酸多态性(Single Nucleo tide Polymor phis m,SNP)和479406个插入缺失多态性(InDel)[8]。Fe ltus 等通过对除去多重拷贝序列及低质量序列后的日本晴和9311基因组草图的比对分析,得到408898个D N A 多态性,包括SNP 和单碱基I nD el [9],这些差别的核苷酸通常位于非编码区[10]。 目前,常把SNP 多态性转化成基于P CR 的剪切扩增多态性(Cle ave d Amplified P olymorphic Se que nc es,CAPS)或CAPS 衍生的dCAPS 标记[11-12]。CAPS 标记是PCR 反应和酶切相结 合产生的一种分子标记。如果不同材料间在PCR 扩增区域有S NP 位点,且该位点是限制性内切酶作用位点,那么不同 材料的PCR 扩增产物经特定的酶切后,再进行琼脂糖凝胶电泳就会表现多态性。当SNP 恰好位于限制性酶切位点比较少时,这种情况可以在CAPS 标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基,则可以结合SNP 位点引入新的限制性内切酶作用位点,产生和CAPS 标记类似的多态性,这就是dCAPS 的方法。用CAPS 或dCAPS 的方法则可以将几乎所有的SNP 位点转化成以P CR 为基础的分子标记[12] 。 2 图位克隆技术环节 2.1 构建遗传作图群体 对于基因图位克隆而言,构建特殊的遗传作图群体是筛选与目标基因紧密连锁分子标记的关键环节。常用的作图群体有F 2、近等基因系、重组自交系等群体,水稻常用F 2群体。创建F 2群体应注意优先选择基因组已测序的日本晴、9311和培矮64S 等品种为亲本之一。2.2 基因初定位 一般说来,当标记为显性遗传时,欲获得最大遗传信息量的F 2群体,需借助于进一步子代测验,以分辨F 2中的杂合体。为此,Mic helmo re 等发明分离群体分组分析法(Bulke d Se gre ga nt Ana lysis,BS A)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记[13]。其原理是将目标基因的F 2(或BC)代分离群体各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲表型分为2群,每一群中各个体D N A 等量混合,形成2个D N A 混合池(如抗病和感病、不育和可育),并且用目的基因附近的所有分子标记对混合D NA 样品池进行分析,根据所有池中包含有交换的DN A 池的比例来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记和目的基因附近所有分子标记的顺序。混合样品作图可以极大提高分子标记分析效率,减小D NA 提取工作量。 2.3 基因精细定位 一旦把目标基因初步定位在2个标记之间后,就可以从国际水稻基因组测序计划(IRG SP)公布的序列中下载这2个标记区域的部分P AC/BAC 克隆序列。利用软件SSRI T 搜索克隆序列中的微卫星序列,然后选择合适的微卫星序列进行特异PCR 引物的设计。也可以直接借助于公共数据库的序列进行比较,如寻找R GP 基因组数据库(粳稻)与中国华大基因组数据库(籼稻)的单核苷酸多态性(SNP)序列差异,设计CAPS 或dCAPS 标记和插入/缺失多态 安徽农业科学,J ou rn al of An hui Agri.Sci.2008,36(34):14905-14906 责任编辑 张彩丽 责任校对 张士敏
印刷图文复制原理与工艺
1位图字体：将文字方块画成网格，文字由黑色的小点组成。 2图形：指没有明暗层次变化，简单的线画和形状要素，是机械结构图、工艺流程图、图标边框、标志、标识等的主要表现形式。 3图像：是印刷复制工艺中最难控制和掌握的信息要素。主要特征包括阶调3、色彩和清晰度。 4图像位深（颜色深度）：指位图中每个像素所占的位数，它存放图像的相关颜色信息，即用来记录一幅图中每个像素点的色彩等属性的位长度。 5调频加网技术：图像经扫描输入后，经处理，通过输出装置时以同样大小的点随机分布在不同空间内，用网点的多少和疏密即网点出现的频率高低，表示图像的密度和层次的一种技术方法。 6调频调幅加网只要有下列加网方法： 规则分布的单元网格中网点由数目随机、大小随机、位置随机的子网点组成，即子网点在一定范围内随机。 在图像不同的阶调处分别采用不同的加网方法。 7数字网点的生成方法： ？值法，模型法，生长模型法，对半取反法 8黒版的作用： 黒版能加强图像的密度反差或亮度范围 黒版能稳定颜色 黒版能加强图像中至暗调的层次 使用适当的黒版，可以降低成本 用黒版能更好地表现文字的视觉效果 用黒版能更好地再现以消色调为主的图像 9印前图像处理具有以下主要特征：（每个特征都要稍作解释） 色彩再现特征：印前图像处理应力求忠实的保持原稿的颜色和层次变化特征处理特征：根据复制工艺特点压缩或扩展图像阶调，提高图像对比度，降低或增加图像的色彩饱和度等 分色特征：分色的好坏直接取决于图像处理过程中对各分色参数的设置 10采样：将空间上连续变化的图像变换成离散点的操作称为采样或抽样。 11量化：经采样后图像被分割成空间上离散的像素，但其灰度是连续的，还不能作为印前处理的图像信息，必须将像素灰度转换成离散的整数值，这一过程就是量化。 12图像扫描过程：扫描仪工作基准设置—审稿—预扫描—扫描颜色模式确定—扫描分辨力的确定—图像大小的确定—brightness contrast的调节—扫描颜色校正—descreen选择—扫描及图像储存 13印刷复制中，图像增强处理的目的是： 采用一系列技术改善图像的视觉效果，提高图像的清晰度； 将图像转换成一种更适合于复制的形式，抑制一些无用的信息，以提高图像复制的质量； 14图像平滑方法：领域平均法，中值滤波，边界保持类滤波 15图像锐化：用灰度的差分对边缘和轮廓进行提取….. 方法：梯度锐化法，拉普拉斯算子，高通滤波，其他锐化算子 16图像平滑：图像的平滑处理技术即图像的去噪处理，主要是为了去除实际成像过程中，因成像设备和环境所造成的图像失真，提取有用的信息，