引物常见问题
引物常见问题
1．怎样按照使用浓度溶解引物？
了解以下几个参数：
1OD引物干粉约为33微克；
碱基的平均分子量为324.5；
引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量；
引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量
举例：如果您拿到一管标明为2OD的20碱基的引物，
分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66μg
摩尔数=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol
若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。
同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时
?非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。
如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
?常规碱基分子量
Base Molecular Weight
A 313.21
C 289.18
G 329.21
T 304.19
I 314.2
U 290.17
?常规修饰基团分子量
常规修饰基团分子量常规修饰基团分子量5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49 5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46 5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07 5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18 5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
?
?引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] +
0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
高层建筑结构设计常见问题探讨
高层建筑结构设计常见问题探讨 摘要：近年来，建筑高度的不断增加, 风格的变化多样，给高层结构设计提出了新的课题和挑战。本文就结构设计中特别要注意的几个问题进行了分析。 关键词：高层建筑; 结构设计;常见问题 一、高层建筑结构设计特点 1 高层建筑结构设计的特点 1.1 水平荷载成为决定因素。一方面，因为楼房自重和楼面使用荷载在竖向构件中所引起的轴力和弯矩的数值，仅与楼房高度的一次方成正比；而水平荷载对结构产生的倾覆力矩，以及由此在竖向构件中引起的轴力，是与楼房高度的两次方成正比；另一方面，对某一定高度楼房来说，竖向荷载大体上是定值，而作为水平荷载的风荷载和地震作用，其数值是随结构动力特性的不同而有较大幅度的变化。 1.2 轴向变形不容忽视。高层建筑中，竖向荷载数值很大，能够在柱中引起较大的轴向变形，从而会对连续梁弯矩产生影响造成连续梁中问支座处的负弯矩值减小，跨中正弯矩和端支座负弯矩值增大；还会对预制构件的下料长度产生影响，要求根据轴向变形计算值对下料长度进行调整；另外对构件剪力和侧移产生影响，与考虑构件竖向变形比较，会得出偏于不安全的结果。 1.3 侧移成为控制指标。与较低楼房不同，结构侧移已成为高层建筑结构设计中的关键因素。随着楼房高度的增加，水平荷载下
结构的侧移变形迅速增大，因而结构在水平荷载作用下的侧移应被控制在某一限度之内。 1.4 结构延性是重要设计指标。相对于较低楼房而言，高层建筑结构更柔一些，在地震作用下的变形更大一些。为了使结构在进入塑性变形阶段后仍具有较强的变形能力，避免倒塌，特别需要在构造上采取恰当的措施，来保证结构具有足够的延性。 二、根据不同类型高层建筑，选择合理的结构体系 2.1结构的规则性问题 新旧规范在这方面的内容出现了较大的变动，新规范在这方面增添了相当多的限制条件，例如：平面规则性信息、嵌固端上下层刚度比信息等，而且，新规范采用强制性条文明确规定“建筑不应采用严重不规则的设计方案”。因此，结构工程师在遵循新规范的这些限制条件上必须严格注意，以避免后期施工图设计阶段工作的被动。 2.2结构的超高问题 在抗震规范与高规中，对结构的总高度都有严格的限制，尤其是新规范中针对以前的超高问题，除了将原来的限制高度设定为a 级高度的建筑外，增加了 b级高度的建筑，因此，必须对结构的该项控制因素严格注意，一旦结构为 b级高度建筑甚或超过了b 级高度，其设计方法和处理措施将有较大的变化。在实际工程设计中，出现过由于结构类型的变更而忽略该问题，导致施工图审查时未予通过，必须重新进行设计或需要开专家会议进行论证
引物设计基本方法
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
DNA合成常见问题解答
DNA合成常见问题解答 1.DNA合成粗产物中含有什么杂质 DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。 2.如何进行合成产物的纯化 目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种： A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5' 端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。 B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5' 端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱， 被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附Dmt能力有限， 不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25 碱基以上的片段纯化效果不好。 C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净 电荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的 净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。 先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人
引物的原理
引物的原理 引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA 取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点： （1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等） （2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） （3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， 引物长度和专一性 ?常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 ?引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 3’-序列
楼梯设计常见问题探讨(一)
21 We learn we go 张 伟，李 斌，黄 杰/0 前言 楼梯间的功能是解决建筑物竖向交通，对多层和高层建筑而言，都是不可或缺的重要组成部分。当遇到紧急情况（如火灾、地震等）时，楼梯间是紧急疏散人群的重要交通通道，其重要性更突出。在对工业与民用建筑工程项目进行设计时，楼梯间是最能体现建筑师和结构工程师密切配合的劳动成果。在满足楼梯间建筑功能正常使用的前提下，做到安全经济，是结构工程师最基本的职责。但是，若欠缺有关的设计经验，不但会影响到楼梯间正常使用和建筑功能的要求，而且有时会遗留安全隐患。楼梯间设计正确与否的问题涉及到与建筑专业的配合深度，而且针对结构专业自身也存在一些需要注意的常见问题，故基于在实际工程中大量工程案例有关楼梯设计问题的归类和总结，通过一些常见问题的剖析，提出解决问题的思路和方法，供同行在实际工程设计中借鉴。 1 影响建筑功能的问题 1.1 净高不足 （1）存在问题 楼梯间净高不足是楼梯设计中常见问题之一，出现此类问题的原因主要有以下两点：1）建筑师对相关建筑规范中有关楼梯设计的规定尚未熟练掌握或对组成楼梯结构构件的空间关系缺乏必要了解；2）结构工程师对楼梯净高概念的要求未能融会贯通、灵活应用，对影响到净高结构构件的空间关系缺乏足够认识。 （2）应对措施 1）掌握有关楼梯净高概念的相关规定，《民用建筑设[1]第6.7.5条规定：楼梯平台上部及下部过道处的净高不应小于2m ，梯段净高不宜小于2.2m 。其中，对梯段净高的概念解释为：自踏步前缘（包括最低和最高一级踏步前缘线以外0.3m 范围内）量至上方突出物下缘间的垂直高度。上述解释的理由是基于一般应满足人在楼梯上伸至手臂向上旋升时手指刚触及上方突出物下缘一点为限，为保证人在行进时不碰头和不产生压抑感，故按照常用楼梯坡度，梯段净高不宜小于2.2m 。2）对遇到梯段净高余量较小的区域，上层踏步起跑位置的梯梁位置应仔细计算分析，遇到净高不足的情况，有两个途径可以选择：即取消起跑位置梯梁或将梯梁内退平移。前者适用于梯段和休息平台跨度之和较小的情况，此时该梯段转化为折线型楼梯，应重新复核计算，其梯板板厚和配筋均会有所变化。后者应特别注意，梯梁内退平移距离应将建筑面层厚度计算在内，以免余量太小，有可能仍旧不满足对梯段净高的要求。遇到休息平台下方净高余 各项因素，将上层位置的梯梁内退0.35m ，可有效解决该问题（图1）。 图1 梯段净高不足实例一 （4）工程实例2 某工程楼梯间，首层入户门和半层位置均存在净高不足的问题，针对此问题，采取的具体措施为：入户门上方梯梁设计为反梁可使得净高大于2m 。半层位置梯段休息平台和起跑位置净高余量均较小，除将梯梁内退0.35m 外，尚要求梯梁梁高控制在0.3m 以内，方能满足最小净高的要求（图2）。 1.2 净宽不足 （1）存在问题
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能
PCR常见问题分析报告及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低
6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数 问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物
的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非
引物设计的11条黄金法则
引物设计的11条黄金法则
PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值
5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端
对建筑结构设计常见问题探讨
对建筑结构设计常见问题探讨 发表时间：2018-11-09T17:57:33.430Z 来源：《建筑学研究前沿》2018年第19期作者：秦浩 [导读] 设计工作需要由多工种多专业合作共同完成，因此结构设计工作不是孤立的。 山东建大工程鉴定加固研究院山东济南 250000 摘要：结构设计简而言之就是用结构语言来表达建筑师及其它专业工程师所要表达的东西。用基础，墙，柱，梁，板，楼梯，大样细部等结构元素来构成建筑物的结构体系，包括竖向和水平的承重及抗力体系。把各种情况产生的荷载以最简洁的方式传递至基础。 关键词：房屋建筑；结构设计；常见问题 设计工作需要由多工种多专业合作共同完成，因此结构设计工作不是孤立的。在设计方面，就需要与建筑设计或工艺设计、设备设计及建筑经济等工种紧密配合；在设计以外，它又跟很多专业，如结构材料、施工技术、分析理论和计算工具、检测手段等密切相关，因此，要提高结构设计水平，除做好自身工作以外，不管是正常的设计工作或者科学研究，都要取得这些工种与专业的支持。不要把结构设计工作自闭起来，应该认识到它的成果或者提高是与其他工种和专业的支持分不开的。 1.地基与基础方面 1.1对于独栋或单体数量较少的住宅，建设单位能委托地质勘察单位进行详细的地质勘察，能为工程设计提供较为详细的勘察技术资料，而成片的多层房屋建筑往往因为地勘费用的问题，地勘单位的探点不能严格按照有关技术要求布置，多栋建筑单体参考一个探点，使得实际的地质情况与地勘报告相差较大。地基与基础设计要做到合理、安全适用，设计人员必须依据详细、真实的地质勘察资料。 1.2软弱地基处理一般采用级配砂石换填，仅仅简单提出换填深度和最终地基承载力的要求，在技术上只是草草写上严格执行《地基处理规范》，而没有针对具体的建筑物画出详细的开挖边线，如轴线变化处，突出凹进墙体部分的开挖边线等，也没有明确砂石换填的应力扩散角具体数值。因此很多工程在地基基础施工中，不能切实有效地做好地基处理。 1.3在基础设计中，对于混凝土独立基础、筏板基础、条形基础，节点设计、构造设计中往往不明确应采用的具体技术参数，如锚固长度搭接长度是采用抗震的还是非抗震的，造成具体实施阶段的扯皮现象 1.4在高层混凝土结构的主体结构设计中，往往梁柱混凝土的等级差别较大，那么在梁柱节点处混凝土怎么进行处理，在设计图中往往不作清楚地技术交底。梁柱节点本身就是个受力复杂的节点，而由于设计缺陷，造成此部位成为一个薄弱点。 2楼板设计常见问题 2.1设计时为了计算方便或因对板的受力状态认识不足，简单地将双向板作用按单向板进行计算。使计算假定与实际受力状态不符，导致一个方向配筋过大，而另一方向配筋不足，致使板出现裂缝。 2.2楼板承受线荷载时弯矩计算问题。在民用建筑中，常在楼板上布置一些非承重隔墙，故楼板设计中，通常将该部分的线荷载换算成等效的均布荷载后，进行楼板的配筋计算。有些设计人员图省事，错误地将隔墙的总荷载附以该板块的总面积。这样会造成非承重隔墙分布宽度内配筋量不足，而此板块其它部分配筋过大，这样隔墙处楼板会出现裂缝。 2.3双向板有效高度取值偏大。双向板在两个方向均产生弯矩，由此双向板跨中正弯矩钢筋是纵横叠放，短跨方向的跨中钢筋应放在下面，长跨方向的跨中钢筋置于短跨钢筋的上面，计算时应用两个方向的各自的有效高度。一般长向的有效高度比短向的有效高度小 d（d 为短向钢筋的直径）有的设计者为图省事或对板受力认识不足，而取两上方向的有效高度一致进行配筋计算，致使长跨有效高度偏大，配筋降低，致使结构构件存在的质量隐患，甚至出现开明缝的现象。 3楼层平面刚度的问题 一些设计在缺乏基本的结构观念或结构布置、缺乏必要措施时，采用楼板变形的计算程序。结构设计存在着结构不安全或者某些部位或构件安全储备过大等现象。为了使程序的计算结果基本上能反映结构的真实受力状况，而不致于出现根本性的误差，设计时应尽可能将楼层设计成刚性楼面。要做到这一点，首先，应在建筑设计方案阶段就避免采用楼面有变形的平面，比如楼层大开洞、外伸翼块太长、块体之间成“缩颈”连接、凹槽缺口太深等。其次，要从结构布置和配筋构造上给予保证，对于使用功能确实必需的，或者建筑效果十分优越的建筑设计，如果其平面无法完全符合刚性楼板的假定，那么在结构设计时，可以通过增设连系梁板、洞口边加设暗梁边梁、提高连系梁板或暗梁边梁的配筋量、采用斜向配筋或双层配筋形式等方法，尽量满足刚性楼板的基本假设，或者弥补由于不是绝对的刚性楼板假定而产生的计算“误差”。 4砖混结构房屋中构造柱兼作承重柱用 在砖混结构中，构造不但能够提高墙体的抗剪能力，而且构造柱与固梁联结在一起，形成对砌体的约束，这对于限制墙体裂缝的开展，维持竖向承载力，提高结构的抗震性能有着重要的作用在当前结构设计中，构造柱经常被作为承重柱使用，这种作法将引起以下几个问题。 4.1构造柱作为承重柱使用后，使得构造柱提前受力，这不但会降低构造柱对彻底的拉结和约束作和，而且结构一旦遭遇地震作用时，在构造柱位置必然形成应力集中，首先破坏这样构造柱不但起不到其应有的作用，反而成为房屋结构中的一个薄弱的部位。 4.2构造柱一般生根于地圈梁中，没有另设基础，构造柱兼作承重柱使用后，柱底基础的抗冲切、抗弯部及局部承压强度必然不能满足要求。柱底基础一旦发生冲切或局部承压被出现裂缝。本文建议承重大梁下的柱子应按承重柱设计。若梁上荷载和跨度都比较小时，构造柱也可布置于梁下，但此时必须按不考虑构造柱作用来验算下墙体的局部承压和抗弯强度。经验算满足，方可在粱下布置构造柱。 5承重柱截面高度设计过小 这种情况多发生于六度抗震设防区。一些结构设计人员误认为六度设防就是不设防，为受力分析方便，他们故意把柱子的截面高度设计得过小，使梁柱的线刚度比加大。把梁简化为铰支梁，梁柱按轴心受压计算。这种做法虽然易于进行结构受力分析，但却给房屋结构埋下了隐患。因为，这样做忽略了梁柱间的刚结作用，加之柱截面的配筋都较小，结构一旦受力后，柱顶抗弯刚度必然不足，从而柱子在梁底附近将会出现一条或多条水平裂缝，形成塑性饺。这样在正常使用情况下，柱子已开始带铰工作。这不但影响了房屋的耐久性，而且也常常引起用户的恐惧心理。更为严重的是，这样的结构一旦遭遇地震作用，将会倒塌，这违背了现行抗震规范中“强柱弱梁”的设计原则。
引物设计注意事项
引物设计 首先引物与模板的序列要紧密互补， 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 非配对结构最好出现在引物中间。 另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产 生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
引物的应用常识
引物的应用常识 引物的原理 引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点： （1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等） （2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） （3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， ?引物长度和专一性 常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。 同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 ?平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 ?3’-序列 3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会 降低反应的专一性。 ?避免互补的引物序列
引物设计的原理与方法
引物设计的原理与方法 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列
PCR常见问题分析及对策
. PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间 问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低
. 6.循环次数过多 对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数
问题3：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 问题4：假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物 的交*污染 对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
引物设计步骤与要点
引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
引物设计常见问题
引物设计常见问题与解答(二) 17. 长链引物为什么出错的几率非常高 答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。 18. 如果测序发现突变，该如何处理 答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。 19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿 答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。 20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入 答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。 21. 为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高