在线毒性监测仪操作手册

在线毒性监测仪操作手册

1.1简介

建立在广泛的基础上利用发光菌对水中毒性进行测试的这个方法是根据ISO 11348（即早期的DIN 38412号方案的34章节）号方案实施的。而TOXcontrol在线毒性监测是一种全自动的在线毒性测试系统。使得对水厂水源全天候24小时在线监测成为可能。整个系统由两部分组成，包括生物培养器对菌种的培养部分和测试系统部分。

1.2根据ISO 11348号方案的发光菌测试方法

在这个章节中将对根据ISO标准进行的测试过程作一个简单的介绍。根据这个标准，测试所用到的发光菌为费歇尔弧菌（Vibrio fischeri）。由于为海洋发光菌，在淡水中无法存活，所以测试液必须是2%的盐溶液。完成整个测试，必须进行下列的步骤：

1.测试溶液：加入2%NaCl盐溶液的发光菌溶液进行混合

2.控制液：加入2%NaCl盐溶液进行混合

3.测试水样：如果水样需要稀释则在加入2%的NaCl盐溶液之前就必须进行，需要时还得

进行酸碱中和。

所有的测试液都必须保存在15±0.2oC下。系统至少有一个5分钟的温度调节阶段。接下来系统将进行测试,得出一个原始发光值（I0）。然后将向测试水样或参考水样中加入一些测试液。水样中如果存在毒性物质则会对发光菌产生影响。接触反应时间（也称培养时间）持续30分钟。接触反应以后仪器将对最后的混合水样的发光强度l k30（参考水样测试值）和I T30（待测水样测试值）进行测定。即使水中不含毒性物质，经过30分钟的接触反应，混合水样的发光强度也会发生衰减或增强的现象。这是可以接受的，因为在水样中和在控制液中都会发生增强和衰减的情况。因此根据参考水样中光强的改变，可以得出一个修正系数（30或15分钟的反应时间）。

f k30=I K30/I0 I0：发光菌测试液在0反应时间的发光强度值。

修正系数的值必须在0.6到1.3之间，才表示这次测试所得的值是有效的。根据这个系数，最后对水样的发光强度I T30的值进行修正：

l c30 = l T30.f K30

l c30是没有添加任何毒性物质，通过计算后水样中发光强度值。光强抑制百分数的计算公式为：

H30=(I C30-I T30)/I C30.100

注解：

●修正系数f K30= I K30/I K0（K=参考测试，0表示0反应时间，30表示测试的时间长度）●修正后的水样发光强度：l c30 = l T30.f K30

●光抑制百分数：H30=(I C30-I T30)/I C30.100

这个程序已经设置为fig.1，下面将对随后的操作步骤进行介绍。

为了对待测水样中的毒性进行测定，用去离子水或相对纯净的纯净水对待测水样进行稀释。这个稀释步骤被称做G-

表1：测试开始时待测水样的百分数（100%/G）。但当G=1时例外。

当用最小稀释倍数利用发光菌对水样进行测试时，如果光抑制小于20%。则根据ISO标准，必须进行一次重复测试。

图1

上面的这个图示既是根据ISO11348号标准对发光菌毒性测试的一个简单介绍。修正系数的引进是由于考虑到发光菌在自然的条件下的衰变。经过证明，这种自然衰变在待测水样和参考水样中都是一样的。同样，毒性物对发光菌的抑制作用与发光强度的减弱也是成正比的。

图2

2. 在线毒性监测仪

图2是在线毒性监测仪的整个外观。由于仪器整体较大，再加上存在着具有腐蚀性的NaCl

盐溶液，所以仪器整个框架都是金属的。仪器通过活塞式进样器抽取溶液进行测试。测试液经过软管被抽到后面的暗室（测试发光强度）对其光强值进行测定。右边玻璃瓶中装的是一个星期测试所用的盐溶液。水样则是通过仪器前面的两根软管引进。

2.1 仪器的设置

插图3用图示的方法对仪器内部结构和设置进行了一个展示。提供待测水样和参考水样的水槽有溢流装置设计。前面的槽沟中流动的是待测水样，而后面的槽沟中流动的是用于稀释，同时也是用于参考的参考水样。仪器可以同时对待测水样和参考水样进行抽取，测试。在水

槽和各种盛液容器装置的上面，有一可以自由移动的机械臂，它由一个控制棒控制，还可以上下移动。在哪个容器中取液则由偏心轮控制。仪器用两个活塞式进样器对待测水样和参考水样进行抽取和排放。两个活塞式进样器都是同时完成相同的操作步骤的。它们和光检测探头被安置在暗室中。盛放液体的各种容器模块都是可以拿出来的，所以很容易进行清洗。这样，如果发生损坏的话也比较容易更换。正是由于这种设计，所以如果增加一组参考毒性测试也很容易。至少每天可以做一次参考毒性物的测试，以检测发光菌的灵敏性。在下面的各个章节将对各个不同的部分一一进行介绍。

图3.在线毒性监测仪的结构示意图。左边：侧面观截面图，右边：前面观截面图

装置中的各种容器模块都是可以拿出来的。装测试水样的模块中有两个对称的槽沟，一个进待测水样，一个进参考水样。用于存放菌种和水样混合的模块都有自动恒温装置。

2.2 发光菌存放室

培养好的发光菌溶液存放在一个5 0C的特氟纶恒温容器中。在容器盖子上有一个缺口，从而使取参考水样的吸液管可以进入。这样可能含有毒性物的用于取待测水样的吸液管就不会与发光菌溶液接触，从而避免对发光菌的污染。每次测试所用的菌溶液的体积为50ul。在与测试液接触反应后，混合液就被同时吸入进样器中以待测量。在存放发光菌的储存室中放有一个不停旋转的蓝色磁子，这是为了防止细菌溶液沉淀的发生。

注意：当仪器由于停电或其它原因停止运行超过一分钟，必须马上把发光菌取出存放到冰箱中。不能让菌种溶液的温度升高后又降低，这样反复进行！！

图4：菌种储存室。发光菌是储存在特氟纶杯中，杯下面是一个恒温模块。取参考水样的吸液管通过盖上的缺口深入到杯中吸取发光菌溶液。模块上的插头插在机械臂下面后板上左边的插座上。

注意：不要对特氟纶杯进行加热，这样会导致其变形。

2.3 水样混合槽

整个水样混合槽由三个单独的槽孔组成。是一个正方形的金属钛模块（图5）。左边是一个长形槽孔。测试混合液在左边的槽孔中进行混合，是由稀释水样，发光菌溶液和盐溶液组成的。左边的槽孔中放有一个蓝色的搅拌子以使混合液能充分混合（图6），槽孔与槽孔之间都是相互独立的，所以就保证参考水样和待测水样之间不会相互影响。右边这两个槽孔分别是用于参考水样和待测水样与测试混合液的混合。在两个槽孔中首先向水样中加入NaCl溶液，然后在从左边的槽孔中取测试混合液加入其中进行混合。水样与发光菌的接触反应（水样影响发光菌发光强度）是在右边的槽孔中进行的。

图5：水样混合槽是一个金属钛模块。模块的底部是一种恒温作用的珀耳帖（Peltier）组件。混合槽放在从左往右数的第二个位置上。模块上的插头插在机械臂下面后板上右边的插座上。

模块由金属钛组成。这样盐溶液不会对其造成腐蚀，而且良好的导热性可以很快使混合水样达到所需的15 0C。珀耳帖（Peltier）组件的铝元素可以很好的起到隔热的作用。为了起到更好的散热，在整个模块的底部还装有一个风扇。珀耳帖（Peltier）组件和其中的搅拌子必需通过插在插座上的插头不断的提供电流才能正常的工作。当需取出模块，把插头拔掉就行了。

当接上电源进行工作时，注意，必须让搅拌子处在正确的位置上。这样才能保证最好的搅拌效果。

图.6水样混合槽。左边的槽孔用于准备测试混合液。发光菌将在这个槽中适应培养一段时间。因为测试混合液是同时用于待测和参考水样的测试，所以这个长形槽孔实际是两个小槽孔连通而成的。中间放有一个搅拌子（2*7mm）以达到充分搅拌的目的。右边这两个槽孔分别是用于参考水样和待测水样与测试混合液的混合。在培养完以后，测试液将被分别加入到右边的槽中。然后进行的是与水样的接触反应。

2.4 化学物存放模块

化学物存放模块实际上是一个存放化学试剂管的底座。在实验开始之前把所用的试剂装入小试管中再放如其中。这个模块置水样混合槽的旁边。由抽取待测水样的吸管抽取。在抽取参考水样的吸管处放的是一种溶剂，以消除这种化学试剂带来的影响。

用化学试剂进行控制测试的实验过程将在5.2.8节作详细的介绍。

图.7带有6ml玻璃小试管的化学物存放模块。在模块底座中存放一个装有化学参考测试试剂的小试管也是可以的。20ml就够一个星期之用。

2.5 水样的供给

待测和参考水样以每分钟0.2L的稳定速度进行供给。取水样的槽有溢流设计，溢流出的水从中间的排水口排出。待测水样由前左方的水槽进入。参考水样首先进入左后部的槽中，然后在流入到右边以提供稀释和清洗之用。这样设计是为了在左边两条吸管可以分别同时取待测和参考水样，在右边又可以同时取参考水样对仪器进行清洗。

水槽放入仪器中就可以很好的与仪器的排水管连接

图.8供水槽

2.6 盐溶液的供给

用于调节的盐溶液装在容量为1L的一个玻璃瓶中。玻璃瓶则以倒立的形式拧在一个塑料模块上。塑料模块上有两个取水孔槽和一条沟。瓶中的溶液根据重力作用通过这条沟流入到槽孔中，当槽孔中的液面不断上升时，暴露在空气中的空隙将被液体堵塞，空气就无法进入瓶中，所以根据大气压原理槽孔中的液面也将不在上升，这样就保证溶液不会从槽孔中溢出。所以测定时槽孔中溶液源源不断的被抽取，也源源不断的由瓶中的溶液提供。

图.9盐溶液供给装置（以一个星期为一个周期，大概需要700ml左右的盐溶液。所以每个星期必须添加一次）

2.7测试过程

TOXcontrol发光菌测试系统是一种半连续的，全自动的生物测试系统。仪器对水样定期的进行检测。水样与发光菌接触反应的过程也就是测试的过程。整个过程可以分为下面几个部分：

如果接触反应的时间为15分钟，则一次完整的测试大约耗时27分钟。但仪器设置的整个测试过程为30分钟，所以在两次测试之间有3分钟的间隔时间。但水样的抽取和测试完后废液的排除也需要时间，而且根据ISO的建议，适应培养的时间至少为5分钟。所以在一个30分钟完整的测试过程中，水样可能存在的毒物对发光菌作用的时间为15分钟（最长可达到18分钟）。根据ISO所得的结果，30分钟的完整测试模式中，生物毒性对发光菌的发光强度的抑制并不会表现的很明显，而对重金属污染物却有着很高的灵敏度。所以这里建议用45分钟的完整测试模式（接触反应时间为30分钟）。

测试一开始，仪器从供水槽中抽取4.5ml参考水样注入水样混合槽左边的长型槽孔中。然后加入0.5ml的盐溶液。通过吸液管对槽孔中的混合液不断的吸取再注入过程来达到充分的混合效果。接着再从菌种储存室中取50ul的发光菌溶液加入其中。同样也不断重复吸取再注入的过程以达到良好的混合效果。槽中的搅拌子也为菌在溶液中的混合过程起到了很好的作用。在适应培养阶段结束后，混合液被吸入注射器内进行第一次的光强测试。这是发光菌环境温度从5 0C升高到15 0C适应以后的发光值。然后再分别抽取4.5ml的参考水样和待测水样分别注入右边两个槽孔中，同样加入0.5ml的盐溶液。最后再将测试混合液与水样混合。所以根据稀释步骤G可知混合的比例是1：1（G=2）。所以最后的总体积为10ml。在接下来的接触反应阶段里，水样会每隔一分钟进行一次光强测试。所以不仅在开始和结束的时候可以得到光强值，还可以知道发光强度的变化情况。最后仪器将数据记录下来，并根据ISO的规则进行计算。整个测试完成以后仪器使用参考水样自动对水样混合槽进行清洗。

3. 发光菌的培养

培养好的发光菌溶液放在生物培养器上，40C的情况下可保存一个星期，且不会降低它的灵敏度。如果想要了解更多关于菌种的培养，可以参考TOXbioshaker生物培养器的使用手册。

3.1 生物培养器

测试结果的好坏主要取决于菌种的好坏。为了使菌种的培养有很好的可操作性和重复性以及保证培养出来的菌种溶液达到质量要求。厂家提供了一种叫TOXbioshaker全自动的生物培养器。在这只做一个简单的介绍，如果想了解更多参看TOXbioshaker的使用手册。

图.10发光菌培养器。仪器上面是培养时用的小玻璃瓶。右边放的盖盖的小瓶中是培养液，也是培养时需要的。

4 在线毒性检测仪的安装

4. 1 供水管的连接

仪器不仅需要待测水样，还必须以32ml/分钟的速度向其提供作为稀释，参考测试和清洗之用的参考水样。待测水样被引进入供水槽的前面的槽孔中（参考图.8）其实在测试过程中稀释所用的水样既是用于参考测试所用的参考水样。由于废水从供水槽排出完全依靠重力作用，所以所选用的排水管的口径不能太小，至少10mm，否则会产生溢流，污染待测和参考水样。排水管必须要有一定的倾斜角，以保证在任何情况下水位都不会上升。

为了防止发生溢流现象，可以在连接参考水样的管道上安装一个压力控制阀。而且所使用的管道要能承受一定的压力。在连接的两端用夹子将其夹紧。

4.2 TOXcontrol软件

在线毒性检测工作的过程是由TOXcontrol软件控制完成的。仪器上所安装的电脑为一台单板计算机。通过仪器特殊的硬件设备所进行一些基本程序，如控制阀或泵的开与关，所得数据的保存这些程序过程与数据都保存在TOXview软件中。

4.3 仪器的启动

考虑到电压安全问题，仪器在工作时的工作电压仅为16V。所以仪器内部的电源转换器将外部的交流电转换为16V的直流电。外部的电源线通过接入左边的电源插座将电引入内部。

可以通过检查混合槽左边槽孔中央的磁子的旋转情况来检查电流是否接通。如果取样控制臂在仪器启动时不是待在初始位置上，则需要对仪器进行重启。打开电源开关后，电源供应装置上的控制灯将会亮。磁子将开始旋转。之后可以进行毒性测试。但是在正式测试之前，必须按要求添加菌种溶液和盐溶液。加完菌以后要保证盖上的缺口处在正确的位置上使兰色吸液头能顺利进入其中取液。

5. 测试

开始测试程序

双击桌面上的“TOXcontrol”图标，打开测试程序控制软件。发光菌毒性测试操作呈现在此软件的窗口中。想了解更多的信息可以参考TOXcontrol Engine软件使用手册。

一些参数说明

测试过程说明

在进行测试之前可以选择30或15分钟的接触反应时间（发光菌混合液与水样的接触反应时间）。根据标准，30分钟的接触反应时间对于检测某些污染物（重金属）的灵敏度更高。但是完成一次测试的时间也更长。通常，设置为15分钟的接触反应时间，则完成一次完整的测试则需要30分钟。30分钟的接触反应时间，需耗时45分钟。

水样的稀释

软件有两种方式对水中的毒性进行测定：

固定的稀释倍数测水样对菌发光的抑制，或者是根据毒性情况来自动调整稀释的倍数，然后对这个倍数值进行测定。第一种方法通常用于对地表水的监测，水中毒性比较低或者是表现为没有毒性的情况下。在这种情况下，最高的稀释等级为G=2（即按1：1的比例进行稀释），同时所测的为菌的发光量被抑制率。在对毒性很高且经常变动的废水进行监测时，如果采用第一种方法，则它对发光量的抑制率可能达到饱和（抑制率达到90%）。在这种饱和的情况下，毒性跟抑制率并不存在着线形关系。在这种情况下，应采用第二种方法对水中的毒性进行测定。必须保证稀释完以后水中的毒性在20%以下。

一次菌溶液的使用量

一般建议每次测试所取用的发光菌溶液的体积为50ul或者是为了保证一定的发光量而增加菌溶液的取用量。当取用的体积一定时，发光强度会随着时间的增加而降低（一个星期以后的发光强度大概是开始时的10%）。

静态报警线

如果仪器一开始便设置的报警界面，毒性抑制的静态报警线便可以在这个界面上进行设置（用两种毒性测试方式都行）。静态报警线是最简单的一种报警方式。根据标准，静态报警线的光抑制临界值为20%。抑制值低于这个数的都没必要界定为存在毒性。因为所测的这个值在基线值（根据以往所测的历史数据而定）上下浮动都是正常的。但是这个值却不能超出动态报警限的限值。这些报警方式的设定，使得TOXView软件（参考软件使用手册）对所测的数据的归档处理，计算更加准确。

清洗

为了防止毒性物的残留，在每次测试完成后，仪器都会用参考水样自动对水样混合槽和取样器进行清洗。对于进行完某些污染物（光抑制作用十分显著的一些参考化学物质）的测定，清洗则尤为显得重要。每次清洗的次数则可以自行设置。但是得明确，清洗的次数越多则耗时越长，且对取样器的磨损更快。一般情况下，监测并不含毒性的水样时，清洗的次数设置为一次就足够了。如果测试那些添加了化学物质或高浓度污染物水样的时候，建议每次测试完进行3次清洗。

注意：如果清洗的次数高于3次，则会超出每次30分钟的检测时间。

化学物

测试程序有两种自动向测试水样中定量添加化学控制物的方式：

第一种方式是在普通测试模式下向测试水样中加入同量，同浓度的参考化学物（比如硫酸锌或是五氯苯酚）

第二种方式（未来应用）对不同浓度的化学物对光的抑制结果进行测定以及结果之间的关系进行计算研究。测试开始时设置一个浓度值，接下来的每次测试都增加一倍化学物的体积使浓度也增加一倍，直到浓度达到所选的最大浓度值。化学物装在一小玻璃瓶中，放在一个塑料模块上。取化学物时，通过取待测水样的吸管抽取。建议在取参考水样的管道上放置一瓶溶剂，以消除化学物残留的影响。

如果采用ZnSO4溶液作为控制测试液，它的配置如下：将1117mg ZnSO4*7H2O溶于100mL去离子水中。溶液中Zn2+浓度即为2500mg/L。每次进行控制测试时，仪器取0.04mlZnSO4溶液混合进10ml的水样中，最后混合液中Zn2+的浓度则为10mg/L

在相应的空格中可以将所使用化学物的名称,和一些说明填入。测试程序会自动将这些参数以及化学物的浓度记录下来（在TOXView中可以查看到）。这是一系列测试开始时的浓度以及与此同时在灵敏度测试时的浓度。通过测试样品以及根据稀释倍数，程序可以自动计算出最大的可能浓度。最大的可能浓度并不影响接下来的灵敏度测试。可以通过移动鼠标进行选择来确定灵敏度测试或化学测试。但是只能选择一个。在灵敏度测试中，进行测试的次数会由仪器给出，通过这个数值就可以得最小浓度的剂量。不管是在灵敏度测试还是在化学物测试中，稀释水样都是用于对测试水样的调节。所以没有稀释水样将无法进行测试。最后显示的结果即为水样中的浓度以及此浓度对发光菌的影响。

注意：由于测试过程中，测试液是按照1：1（5ml菌种悬浮液，5ml测试水样）的比例混合而成的，但是在测试原始发光值的时候，所用的是5ml菌种悬浮液。所以我们测试所得的发光值Ik30和Ip30都乘以2，但这步计算机程序会自行进行计算，保存的也为计算后所的发光值。

6.维护

6.1 向仪器中添加发光菌悬浮液

每星期向特氟纶杯中添加菌种悬浮液一次，特氟纶杯是嵌入在有自动调温能力模块中。没次向其中添加新悬浮液之前都必须将残余的旧倒出并用去离子水进行清洗（最好是进行消毒）。清洗完以后将杯子放入模块中，并向其中加入20ml的发光菌悬浮液。最后将盖子盖好，确保盖上的缺口处在正确的位置以使取液头能进入其中。可以手动进行测试一下。为了尽可能减少污染，所以盖上的缺口较小，所以测试很重要

建议每次测试时取菌的体积为50ul，所以一天48次测试，一个星期的用量即为16.8ml。因此建议每次向杯中加入20ml的发光菌悬浮液。

6.2 添加盐溶液

在向盐溶液供应装置中加入液体之前，先将装置从仪器中取出，将析出来的盐沉淀清洗干净。然后将玻璃瓶从塑料模块上拧下来。

每次测试消耗盐溶液2ml，所以一个星期总消耗量为672ml。玻璃瓶可盛放的最大体积为1000ml。塑料模块是像瓶盖一样拧在玻璃瓶上的，拧上以后将玻璃瓶倒转过来再放入仪器中。添加完以后将所添加的盐溶液体积值写入仪器的程序中。这样可以时时监控。在屏幕上移动鼠标，然后点击“salt”项，在弹出的对话框中填入相应的数值。填写完以后点击“OK”。

盐溶液的配制：用去离子水溶解200gNaCl，最后定容到1L。

同样的人工配制的海水溶液也行，在盐溶液中可以防止了一些错误结果的发生，由于在碱性环境和含有碱性离子的溶液中能提高菌的发光量。但是这在参考水样和待测水样中都是同等的，所以并不影响检测结果。

注意：根据经验可知，用人工配制的海水溶液有可能会降低菌对污染物的灵敏度。而且有可能会导致菌种悬浮液中产生沉淀。

6.3 进样器的更换

更换进样器必须打开测试盒盖，所以打开盒盖之前有一点必须注意：关闭光电倍增器的电源。

注意：仪器设备有一个自带的安全断电装置，当你在打开盖子之前忘记关闭电倍增器的电源时，打开盖子的同时自动装置将自动切断电源。但是不要以此养成习惯，因为当安全装置出现故障不能及时关闭电源，打开盖子后强光将对光电倍增器造成损坏。以降低它的使用寿命。

6.3.1更换进样器

下面将对如何更换进样器进行详细的描述。如果仪器一直处在测试状态，进样器的使用寿命一般不小于一个星期。由于存在着磨损，所以如果长时间不进行更换则进样器中的液体则会产生漏损的情况。所以建议一星期更换一次。

6.3.2取出旧的进样器

1.首先关闭光电倍增器的电源，以免电倍增器在强光的照射下造成损坏。

2.拧下测试暗室盖上的6个螺丝。

3.取下测试暗室盖。

4.将卡住进样器中活塞杆的两个红色的螺丝拧松，将活塞推之最底部。然后将卡住进

样器的螺丝拧下，取下上面的那块板，然后将进样器连同下面的固定板一起从暗室拉出。

6.3.3 装入新的进样器

在装入新的进样器时可以按照拆除旧进样器步骤倒过来进行操作。首先准备两个新的进样器以及两根13.39cm长，内径为1.6mm的软管。将软管与进样器接好。进样器针管插入软管中大概5mm即可。

将进样器放入固定板的孔中，然后整个放入测试暗室中并将进样器用力按下至底将其卡紧，接着装上进样器上面的固定板并用螺丝拧紧。最后将进样器中的活塞杆拉起，用红色螺丝卡紧。

这样就可以将盖板盖上了。但是别忘了将光电倍增器的电源打开。

6.4 更换软管和取液头

连接进样器和取液头的软管必须是黑色的，这样可以避免自然光对测试的影响。每个星期在更换进样器的同时必须对软管进行清洗。因为在管壁上可能会沉积一些污染物（导致微生物繁殖生长）。清洗完以后可以重复使用。

取液头是一种聚四氟乙烯小管，基本上也是一星期清洗一次（主要取决所测试的水样情况）。

6.5 搅拌磁子

在发光菌存储盒和水样混合槽分别放有一个直径2mm，长5mm的搅拌磁子，前者为兰色，后者为白色。

6.6 自动清洗

仪器有自动清洗功能，所以不用担心在测完有毒的物质后会影响下一次的测定。仪器会自动进行下面的清洗操作。

1.清洗水样混合槽

2.清洗软管和进样器

根据经验，污染物在仪器中累积的程度不会高于原本水样中的浓度。