嗜热菌的研究进展_欧平

　[收稿日期]2009-10-29

　[作者简介]欧平(1970-),男,汉族,广西昭平人,贺州学院讲师。主要研究方向:微生物学。

嗜热菌的研究进展

欧　平

(贺州学院,广西　贺州　542800)

[摘　要]文章从嗜热菌的分类、耐热机理及其在工业方面的应用前景等方面予以综述,介绍国内外近

年来的研究进展。

[关键词]嗜热菌;分类;耐热;机理;意义

[中图分类号]Q939　[文献标识码]A [文章编号]1673-8861(2009)04-0136-05 生物的一个基本特征是对环境的适应性,而微生物对高温的适应能力尤为惊人,一般把在高温环境中生长的微生物叫嗜热菌(thermophiles ),包括一些细菌及古细菌。它们广泛分布在草堆、厩肥、温泉、煤堆、火山地、地热区土壤及海底火山附近等处。普通耐热菌的最高生长温度在45℃～55℃之间,低于30℃也能生长,而超嗜热菌最高生长温度可达80℃～110℃,最低生长温度也在55℃左右。

自从1879年米奎尔从法国塞纳河中分离到能在70℃环境下生长的杆菌以来,嗜热菌的研究热潮始于上世纪的六七十年代,但是自Brock T.

D (1969)从美国黄石国家公园的温泉中分离到最适生长温度高达70℃的水生栖热菌(Thermus aquaticus )以后[1],在近30年里,世界各国科学家不断从陆地温泉和深海海底温泉等高温生态环境分离到许多新的、生长温度更高的高温菌、超高温菌(hyper -thermophiles ),大约70个属140种。并采用最先进的研究手段对这些高温菌的分类、生理、生化、生态、遗传、生物工程等进行了广泛深入的研究。

对这种“嗜极生物”(extremophiles )有了一连串惊人的发现,对它的生存环境有了较多的了解。1998年初,我国科研人员在云南腾冲地区考察时在沸泉中发现了一种泉生热孢菌,最适75度左右生长,这是第一个被发现的这种极端嗜热菌,是国际上从未报道过的新菌种[2]。中国科学院遗传研究所、微生物研究所和生物物理研究所的科学家联合起来,测定

了这种嗜热菌的全基因组DNA (脱氧核糖核酸)序列。准确率达到99.99%,从而获得了国内第一张微

生物基因组“完成图”,标志着我国基因组研究又向前迈出重要一步。据悉,这是迄今为止中国人首次破译微生物的遗传密码,嗜热菌也成为除病毒外国内第一个遗传密码被破译的微生物。

1　嗜热菌分类

嗜热菌的系统分类学,是在C.R.Woese 对产甲烷菌的16S rRNA 序列与其他细菌的分析与对比后才取得突破的。C.R.Woese 根据16S rRNA 序列分析结果,在分子水平上将原核生物分为两个不同的

类群,分别称为真细菌(Eubacteria )和古细菌(Archaebacteria )。在此基础上,他又提出了趋向自然

的生命三域进化系统,即古菌域(domain archaea )、

细菌域(domain bacteria )和真核生物域(domain eucarya ),并构建了有根系统进化树[3,4]。

嗜热菌(俗称高温菌,也称嗜热微生物),是一类生活在高温环境中的微生物,广泛分布在温泉、堆肥、地热区土壤、火山地区以及海底火山地等。在美国黄石国家公园的含硫热泉中,曾经分离到一株嗜热的兼性自养细菌———酸热硫化叶菌(Sulfolobus ),它们可以在高于90℃的温度下生长。嗜热细菌并非单一的菌属或菌群,而是广泛分布于各种不同的菌群中,其中有些嗜热细菌,其同届菌中皆为嗜热菌,如红色嗜热杆菌(Rhodothermus )、脱硫肠状菌(Desu1.fotomaeulum )、玫瑰弯菌(Roseiflexus )、嗜热

好氧杆菌(Thermoaerobium )、嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobaeterium )、嗜热嗜油杆菌(Thermoleophilum )、绿弯菌(Ctdorolfexus )、嗜热丝菌(Thermothrix )、嗜热管菌(Thermosipho )、球杆菌

(Sphaembaeter)等,也有高温菌及中温菌并存的菌属。如芽孢杆菌、奇异球菌(Deincooccus)、假黄色单胞菌(Pseudoxanthomonas)等。嗜热菌是一种生活在高温环境下的微生物,根据它们的耐热程度,可把嗜热菌分为五个不同的类群[5]:耐热菌、兼性嗜热菌、专性嗜热菌、极端嗜热菌和超嗜热菌。

1.1耐热菌:最高生长温度在45℃-55℃之间,低于30℃也能生长。已经报道的耐热菌细胞的形态有杆形和球形变化的有2个属,分别是高温神袍菌属和石油神袍菌属,都是革兰氏阴性。另外,高温神袍菌属的Thermotoga aritime、Thermotoga eapolitana[6]和Thermotoga thermarum的细胞外面都被类似鞘的结构包围。石油神袍菌属中的Petrotoga miotherma无运动性,生长严格厌氧。好氧球杆菌属中Sphaerobacter thermophilus[7]和Rubrobacterxylanophilus的细胞形态,既有球状又有杆形的,但是在一个代谢周期内没有两种形态之间的变化。Sphaerobacter thermophilus没有运动性,只有一种圆形菌落。Rubrobacterxylanophilus的菌落也只有圆形一种。

1.2兼性嗜热菌:最高生长温度在55℃-65℃之间。葡萄糖异构酶和木糖异构酶分别催化D-葡萄嗜热古细菌菌株J W/SL-YS489能产生一种分子量为200kDa的木糖异构酶。其催化活性同样需要二价阳离子如Mn2+、C02+和Mg2+的存在,其最适作用温度受p H的影响,在p H为6.4时,其最适作用温度为60℃;在p H为6.8时,其最适作用温度为80℃;在缺少底物的情况下,82℃处理1h该酶仍然稳定[8]。从T.maritima分离纯化的热稳定性葡萄糖异构酶,当温度达到100℃时其活性保持不变;当温度继续上升到115℃时,10min后仍有50%的酶活[9]。有趣的是,从T.neapolitana分离的热稳定性葡萄糖异构酶,在90℃时的活性竟比该温度以下时(60-90℃)提高214倍[10];Anoxybacillus属是芽孢杆菌世系中的一个嗜热分支,严格厌氧或耐氧,碱性或耐碱性,在热泉中广泛分布[11]。G eobacillus属是另一个中度嗜热的芽孢杆菌分支,在37-75℃的环境中均能够分离得到,最适生长温度为55-65℃,最适生长p H值为6.2-7.5,生长p H范围为6.0-8.5,其中的绝大多数种分布广泛,如热泉、油田、堆肥等热环境中都能分离得到[12]。

1.3专性嗜热菌:最适生长温度在65℃-70℃,不能在低于40℃-42℃条件下生长。2006年,唐赘等[13]从油田地层水分离获得的嗜热菌BF80在无机盐培养基中,能以苯酚为唯一碳源良好生长,经API 系统和16SrDNA分析,该菌归属G eobacillus thermoglucosidasius,最适生长和降解苯酚温度为60℃-65℃;海栖热袍菌Thermotoga maritima是一种生长在55-90℃的海底火山口附近、严格厌氧的细菌,能够分解和利用淀粉、纤维素、半纤维素等多聚糖[14,15,16,17,18],是极耐热性半纤维素酶的重要来源。

1.4极端嗜热菌:最高生长温度高于70℃,最适温度高于65℃,最低生长温度高于40℃。到目前为止,已陆续发现多种嗜热微生物能产生热稳定的木聚糖酶,主要是Thermotoga属的一些种,其中热稳定性较好的是从Thermotoga sp.FiSS3- B.1、Thermotoga neapolitana、Thermotoga maritime和Thermotoga thermarum分离的酶,它们的稳定性在80-105℃。

1.5超嗜热菌:最高生长温度在80℃～110℃,最低生长温度在55℃左右。现已发现的超嗜热菌,主要包括灼热球菌属(Pyrococcus)、古球菌属(Archaeoglobus)、高温变形球菌属(Thermoproteus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、热棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属(Suflolobus)等,大多属于古细菌(Archaebacteria)。一种超嗜热菌能提供1000种以上的耐热蛋白质,目前工业生产中使用的高温淀粉酶主要是由中温型细菌地衣芽孢杆菌及其突变株产生的,它们的耐热性能较好,其最适反应温度为90-95℃。极端耐热淀粉酶主要是从Pyrococcus woesei,Pyrococcus furiosus, Thermococcus profundus等古细菌中分离和研究,他们的最适作用温度分别为100℃、100℃和80℃[19,20,21];1995年Bronnenmeier等[22]从Thermotoga maritimeMSB8中分离出一种纤维素酶,其最适作用温度为95℃,最适p H为6.0-7.0。从Thermotoga neapolitana中分离出2种内切纤维素酶:CelA、CelB,CelA分子量为29kDa,其最适作用温度为95℃;CelB分子量为30kDa,其最适作用温度为105℃。有些超嗜热菌如Anaerocellum thermophilum、T.maritime、P.furiosu能产生溶纤酶,能水解微结晶纤维素。这些酶的最适温度都在95℃以上,有的甚至在115℃的高温下仍然具有活性;1996年,Hanzawa等[23]从Desulfurococcsu strainSY中分离的一种胞内蛋白酶,对热的抗性极强,在95℃的高温中其半衰期为 4.3h。而从Staphylothemus marinus中分离的一种球状丝氨酸蛋白酶其抗热性更加惊人,在135℃下10min后仍然具有活性[24]。

2　嗜热菌耐热机理

目前,对微生物适应极端环境的机理,进行了较为深入的研究,已进入到分子水平,嗜热菌的耐热机理主要是集中在以下几方面。

2.1细胞膜耐热机理

嗜热菌的细胞膜外有多个隐窝,这有利于耐高温。嗜热菌细胞膜的脂双分子层中有很多结构特殊的复合类脂,主要是甘油脂肪酰二酯,随着温度的升高,复合类脂中烷基链彼此间隔扩大,而极性部分作为膜的双层结构则保持整齐液晶状态。嗜热菌的细胞膜中含有饱和脂肪酸的比例比不饱和脂肪酸大。增加磷脂酰烷基链的长度,增加异构化支链的比率,或是增加脂肪酸饱和度都可维持膜的液晶态,从而使嗜热菌的细胞膜耐受高温[25,26,27]。

2.2遗传物质耐热机理

一般来说,嗜热菌的G-C%含量与其生长温度成正相关的关系,DNA分子中G-C配对越多,解链所需的温度就越高[28]。嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus)DNA的G-C%高达60-70%。此外,组蛋白和核小体在高温下均有聚合成四聚体甚至八聚体的趋势,这能保护裸露的DNA免受高温降解[29]。有资料表明嗜热古细菌中存在一种特殊的机制对抗热变性,例如反解旋酶结合在DNA双螺旋上,使DNA产生更能耐受高温的正超螺旋结构[30]。嗜热菌的DNA双螺旋结构中核苷酸排列非常有序,很少有突出的核苷酸或其它不规则因素的存在。而且,在螺旋结构侧面、近端、远端的碱基很少会从方阵结构中滑出,这保证了碱基堆积力的增加,使得DNA双螺旋更加稳定。另外,嗜热菌中的t RNA不仅有很好的热稳定性,而且周转率大于嗜温菌t RNA 的周转率。t RNA是蛋白质生物合成中的运载工具,占有很关键的位置,它的耐热性及高周转率有助于一些重要酶的迅速再合成。

2.3菌体蛋白耐热机理

研究表明在嗜热菌蛋白质的一级结构中,个别氨基酸的改变会引起离子键、氢键和疏水作用的变化,从而大大增加整体的热稳定性,这就是氢基酸的突变适应[31];而嗜热菌的蛋白与常温菌蛋白的大小、亚基结构、螺旋程度、极性大小和活性中心都极为相似,但构成蛋白质高级结构的非共价力、结构域的包装、亚基与辅基的聚集,以及糖基化作用、磷酸化作用等等却不尽相同,通常蛋白对高温的适应决定于这些微妙的空间相互作用[32];化学修饰、多聚物吸附及酶分子内的交联也是提高蛋白热稳定性的一条重要途径。嗜热蛋白酶离子结合位点上所结合的金属离子(如Ca2+、Mg2+、Zn2+等)可能起到类似于二硫键那样的桥连作用,促进其热稳定性的提高。

微生物对极端环境的适应,是自然选择的结果,是生物进化过程的动因之一。了解极端环境下微生物的物种、遗传特性及适应机理,不仅为生物进化、微生物分类积累资料,提供新的线索;还可直接利用它的特殊基因、特殊机能,创造更有用的新种。因此,极端环境中微生物的发现和研究,在理论上和实践上都具有重要的意义。

3　研究嗜热菌的意义

我国广大地区的热泉中蕴藏着丰富的嗜热芽孢杆菌资源,其在遗传多样性上体现了典型的陆地热泉的微生态构成,同时包含了较高丰度的嗜热脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和木聚糖酶的产生菌。嗜热酶是当今研究和开发得最多的极端酶,因其具有诸多酶学性质上的优势而具有很高的商业应用价值,并有可能会带来巨大的经济效益引,来自于嗜热芽孢杆菌的一些酶类已有成功的研发范例,如来自Bacilluslicheniformis的淀粉水解酶[33]、来自G eobacillusstearothermophilus的聚合酶Bst I pol[34]等已经应用于商业生产。

研究嗜热菌的一个主要目的是研究与开发嗜热酶。嗜热菌产生的酶由于和菌体一样耐高温,这使得它们在生物技术上的应用具有独特的优势[35]:(1)酶制剂的制备成本降低。因为嗜热酶的稳定性高,因而可以在室温下分离、提纯和包装运输,并能长期保持活性;(2)加快了动力学反应。随着反应温度的提高,分子运动速度加快,酶催化能力增强;(3)对反应器冷却系统的要求标准降低,因而减少了能耗。由于嗜热酶有耐高温的特性,所以生产中不需要复杂的冷却装置。一方面节省开支;另一方面也降低了冷却过程对环境所造成的污染;(4)提高了产物的纯度。在嗜热酶催化反应条件下(超过70℃),很少有杂菌生存,从而减少了细菌代谢物对产物的污染。

嗜热酶在商业上应用最为广泛的就是把嗜热细菌Thermus aquatics(水生栖热菌)的耐热DNA聚合酶“Taq”用于多聚酶链式反应(PCR,DNA Polymerase Chain Reaction)中,由于耐热“Taq”酶的使用,才使PCR的专一性、收得率、灵敏度、DNA片段长度、复制的忠实性、操作简便性和自动化程度有了明显的提高。使该反应在科学研究和医疗等实际领域的应用中实现了新的飞跃。

嗜热菌可用于细菌浸矿、石油及煤炭的脱硫。在一些污泥、温泉和深海地热海水中,生活着能产甲烷

的嗜热细菌,生活的环境温度高,盐浓度大,压力也非常高,在实验室很难分离和培养。嗜热真菌通常存在于堆肥、干草堆和碎木堆等高温环境中,有助于一些有机物的降解。利用嗜热菌对废水废料进行厌氧处理,可提高反应速度,消灭污水污物中的病原微生物。

嗜热菌除了它们的耐高温酶在工业上的应用广泛外,由于它的生长速率高,代谢作用强,产物/细胞重量之比值较高,因其在高温下具有竞争优势,故在发酵生产中可防止杂菌的污染;乙醇等代谢产物容易收得;发酵过程中不需冷却,可省去深井水的消耗等等,在造纸工业、环境保护、能源利用、烟草业、石油开采、液体燃料的生产、生物转化及抗生素生产等领域都有广泛的应用。

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