分子生物学进化

分子生物学发展史及荧光定量PCR技术

摘要：分子生物学是在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程。分子生物学主要包括转录组学、基因组学、后基因组学、荧光定量PCR技术等，本文主要叙述了分子生物学的发展史以及荧光定量PCR技术研究进展。

关键字：分子生物学；发展史；荧光定量PCR

1分子生物学发展史

达尔文的进化论，许旺和施莱登的细胞学说以及孟德尔遗传定律和摩根的染色体学说奠定了当代生物学的基础，但是他们都只是从纯生物学的角度来阐述生命现象，而不能说明它的根本机理和原因。

分子生物学的诞生和发展按其重大的突破和进展可大致地划分为三个阶段。第一阶段：在上世纪的后期，巴斯德由于发现了细菌而在自然科学史上留下丰功伟绩。直至1890～1900年间suchner兄弟证明酵母提出液可使糖发酵之后，科学家们才认识到细胞的活动原来可以再拆分为更细的成分加以研究。此后相继结晶了许多酶，如腺酶、胰蛋白酶（及胃蛋白酶）等，并且证实了这些物质都是蛋白质。这些成果开辟了近代生物化学的新纪元。与此同时，被湮没达 35年之久的孟德尔遗传定律（1865），又被重新发现，摩根等在这个定律基础上建立了染色体学说，使遗传学的研究引起了科学界的重视。在这个时期，分子生物学研究的最重要成果是证明了遗传的物质基础是DNA而不是蛋臼质，Avery等（1944）证明了使肺炎双球菌由粗糙型转成为光滑型的转化因子是DNA。随后，噬菌体学派的Hershey和chase进一步提出了更加令人信服的证据，他们用蛋白质上标记了放射性硫的噬菌体感染细菌，发现只有噬菌体的DNA被“注射”到细菌体内去并在其中繁殖，而蛋白质则留在细胞之外。但在当时，由于科学界对DNA的结构尚少研究，所以还无从知道何以DNA能成为遗传的物质基础。

分子生物学发展的第二阶段是以DNA双螺旋的发现为标记的，这个划时代的发现正是结构学派和信息学派汇合所结出的硕果，从此以后，关于生物大分子结构和信息的研究才紧密地结合起来，Watson 和Crick的DNA双螺旋学说破天荒地用分子结构的特征解释生命现象的最基本问题之一－基因复制的机理，从而使生物学真正进入分子生物学的新时代。在这以后的年代里，DNA的研究始终占据着分子生物学的中心地位。

分子生物学的第三阶段是mRNA的发现和遗传密码的破译，以及DNA聚合酶、RNA聚合酶、限制性核酸内切酶、连接酶，质粒等一系列重大发现，终于导致70年代初重组DNA技术的问世。这项技术使分子生物学家能够在体外按照主观愿望切割和拼接DNA分子，借助细菌制造大量所需的DNA片段，极大地促进了DNA

本身结构和功能的研究。更有甚者，这项技术标志着分子生物学家从认识和利用生物的时代进入了改造和创建物种的新时期。

2荧光定量 PCR 技术

荧光定量 PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量 PCR 是在普通 PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。在荧光定量PCR 技术发展的过程中，两个重要的发现起着关键的作用：一是 Taq DNA 多聚酶的 5′端核酸外切酶活性被发现，它能降解特异性荧光标记的探针，使得间接检测 PCR 产物成为可能；另一个是荧光双标记探针被使用在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。在 1996 年由美国 Applied Biosysterms 公司推出了一种实时荧光定量 PCR 技术，它是利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量检测的飞跃，而且所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性等特点。目前在不同的研究领域得到广泛的应用。

2．1主要类型

2.1.1 SYBR Green I

SYBR Green I 是一种只与双链 DNA小沟结合的具有绿色激发波长的染料，也是荧光定量 PCR最常用的 DNA 结合染料，当与 DNA 结合的时候可以发出荧光。在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光,但是一旦与双链 DNA 结合后，其荧光强度是游离状态下的1000倍。所以一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链 DNA 量成正比，可以根据荧光信号检测出 PCR 体系中的双链 DNA 的数量。SYBR Green I 的优点是检测方法简单，不需要设计探针，成本低，通用性好，且能够进行融解曲线分析检测扩增反应的特异性。但其缺点是 SYBR Green I 可以与所有的双链 DNA 结合，因此不能进行多重 PCR 反应，由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。但通过优化 PCR 的反应条件，减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生，另外，也可以借助融解曲线分析产物的均一性，有助于增加定量结果的准确性。

2.1.2 TaqMan 探针技术

TaqMan 荧光定量 PCR 技术是以 TaqMan 荧探针为基础，利用 DNA 多聚酶的 5′→3′外切酶活性来水解与目的序列杂交的探针。TaqMan 荧光探针为一个20 bp 以上的寡核苷酸，其 5′端标记荧光发射基团，3′端标记淬灭基团。当探针保持完整时，3′端淬灭基团抑制 5′端发射基团的荧光发射，只能检测到3′端荧光信号，而不能检测到 5′端的荧光信号。但在 PCR 扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq DNA 聚合酶的 5′→3′外切酶活性将探针 5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离 3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号。即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。由于理论上被释放的荧光基团数目和 PCR 产物数量是一对一的关系，且

光密度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。 TaqMan 探针技术特异性好，假阳性低，线性关系好，准确性高，但是需要设计特异性的探针，所以成本较高，另外，采用Taq 酶的 5′→3′外切活性，因此定量时常受酶性能的影响。

2.1.3 分子信标技术

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，是 TaqMan 探针的衍生形式。两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。在茎环结构中，环一般为 15～30 个核苷酸，并与目标序列互补，茎一般为 5～7 个核苷酸，并相互相配对形成茎的结构。荧光基团连接在一个臂的末端，淬灭基团则连接在另一个臂的末端。当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离很近，使其产生能量转移效应，而检测不到荧光信号。当互补序列出现时，探针与 DNA 杂交，探针转变成一个呈线性开放的结构。荧光基团与淬灭荧光基团彼此分开，当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。荧光基团脱离了淬灭基团的能量转移效应，从而产生可被检测到的荧光。与探针互补的靶分子数量越多荧光信号也就越强，这样就达到了定量的目的。分子信标的方法优点是灵敏度高，特异性强，其缺点是设计要求高，杂交探针不能完全与模板结合，稳定性较差，探针合成的时候标记较复杂。

2.2应用

荧光定量 PCR 技术比起普通 PCR，不用进行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，人工分析数据等步聚。较之与以前的以终点法进行定量的 PCR 技术具有很大的优势。它操作简便、快速高效，荧光定量 PCR技术不仅具有普通 PCR 的高灵敏性，而且可以实时检测 PCR 每个循环过程中荧光信号的变化，并获得定量结果，具有 DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，可以降低污染，进行多重扩增，克服了普通 PCR 的许多不足。目前该技术已经被广泛应用于基础科学，食品、医学、药物开发以及分子生物学等多个领域。