cisco使用教程+实验攻略
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Packet Tracer建构CCNA实验攻略⑴-------- 配置Cisco交换机
Packet Tracer 是一款非常不错的Cisco（思科）网络设备模拟器，对于想考思科初级认证（如CCNA）的朋友们来说，Packet Tracer 是非常不错的选择。利用Packet Tracer 练习思科IOS 操作命令很不错的。
要配置好Cisco 交换必需要熟悉IOS 命令及相关的知识。
、几种配置命令模式
switch>
这种提示符表示是在用户命令模式，只能使用一些查看命令。
switch#
这种提示符表示是在特权命令模式。
switch（config）# 这种提示符表示是全局配置模式
switch(config-if)# 端口配置命令模式
L>
l>ena]bl€
Li
1#disable
If GQ^-f t
Knt?r ecmLgxgnar-a^lon on? pac line B End with Cir TT
1 ( ecu figji ^liostrLacie Cor e￡W
亡ore￡W (conf i g\Winter t ace i D/L Cor e SO (conf i g-d ￡j ￡f|
图一几种命令模式
二、检查、查看命令
这些命令是查看当前配置状况，通常是以show(sh)为开始的命令。show version查看IOS的版本、show flash 查看flash内存使用状况、show mac-address-table 查看MAC地址列表
Cisco IOS Sc ftware, CZ56O Soft-ware ( CZ9 6O-LAMBASE-M^ , Version 丄E. Z (25) RELEAS E StiTTWARE i.
Copyright- ( c ) 2 0 0-C by Cx￡Systems , Inc -
Caapiled Wad J.2-0=t- OS 22-toy pt.y色込
ftOU: CZ9&0 Boot Loader (CE9GO-HEOOT-M) Version LZ.Z(ZSr) FX, KEL^A3E SOFTWOE (tc
Sysnem r&t.limed co R.0I1 bv power-cm
Ci s co 'WrS—CZ9 SO —Z4TT ( R.C3Z30O) processo r (ireTirlsi on CO J with 2.1O3^K l)ytes o f menior"
24 P&st.Etk&r^e/IEEK 902.3 mt&Tfacfe (s )
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64K fcytes：ot f lash-siuculaved nan-volat ils conf i gniat-
Base ethernet FIAC Address : 0J01.4327.1?P1^
Moth亡KbQBFd aswe泌丄屮: 73-3S3￡-Q6
Power supply p&irt niuLber : 34L-OOS7-OZ
图二
图三
图四
图五Show帮助命令显示当前所有的查看命令
图六查看端口状态信息
三、密码设置命令
Cisco交换机、路由器中有很多密码，设置好这些密码可以有效地提高设备的安全性。
switch(co nfig)#e nable password 设置进入特权模式进的密码
可以设置通过con sole端口连接设备及tel net远程登录时所需要的密码switch(co nfig-li ne)
C(jieS￥ffCQiif t
EmLai: contiQurabion coomands, one par line. End uibh CETLfZ.
C oxaSU(conflg> fankble pafjwoxd able
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CoreSW(config-line)d J.Ins
Co^aSU (con fig-lias)才丄agin
CaieSWt config-lin.e) S丄士“皀ury 0 4
C aieStff (匚ciiifzig-LzLrLe ) d vty
C (JieSlff ( CQJI fig-line) ^logLn
CoieS￥(con fig-line)
CateEFU 图七设置交换机的各种密码 默认情况下，这些密码都是以明文的形式存储，所以很容易查看到。为了避免这种情况，我们可以以密文的形式存储各种密码：service password-e ncrypti on Inter can t i guratlon coxutands, on?per lin< . Bnd wi'th CNTL/2 . Cor?Stf^cou.￡i^}nseri^ice pas s vord-1 on CoreSW^catLfig) ft 图九 图十密码以密文的形式存储 四、配置IP地址及默认网关 图十一 五、管理MAC地址表 switch#show mac-address-table 显示MAC地址列表 switch#clear mac-address-table dynamic 清除动态MAC地址列表 C QHUS可芽中Gtau一殂吕"V型1 = Has 思吕百T吐丄u Vls±i ITaC 1Tg■& 1000￡..5ed3.c4tl DYUABIC JaO/4 1 .bdSc."嗣 D YU AMIC TaO/Z 1OOd O. .toa&9.9?￡t DYUJLHI 匚TaO/1 CoieSWffclear m&c!-addTes￡-t.able dynam.it! CoieStaff 图十二 图十三设置静态MAC地址 六、配置端口安全 switch(con fig-if)switchport port-security switch(config-if)switchport port-security maximum 4 匚口re SV (conf ig-J.face Core^W Cconf ig—i ￡J clip orc mo de access Cor?2Vfuonfig-i f)ff^witchporC port-sacui;ity Cor?SV(aonfiy-i f)0±vitch]pDE^ port-secuirixy naxiiLuiii 4 匚宀F苣Ce&ftf ig-1 f 3 g 图十四图十五 七、一个配置实例 图十六实例拓扑图 图十七 图十八 图十九 图二十保存对交换机的配置 Packet Tracer建构CCNA实验攻略⑵——配置VLAN Vla n( Virtual Local Area Network) 即虚拟局域网。VLAN可以把同一个物理网络划分为多个逻辑网段，因此，Vlan可以抑制网络风暴，增强网络的安全性。 、实例拓扑图 图一交换机Cisco 2960 、创建VLAN 在Cisco IOS 中有两种方式创建vian,在全局配置模式下使用 vlan vianid 命令，如 switch(config)#vlan 10 ；在 vian database 下创建 vian,如 switch(vlan)vlan 20 Suitch>en t conf rati on CQmuands, one p?￡- 1 ine . ^jith CNTL/W- ￡wit ah (conf C&r^SM CarsEW(eonf1^)Sv 丄血丄D CoraSW (config-vlan) Snsiie Mach Cor eSW (ci on ti vl sn.) Kit CoreSW (config? f exit SYS-5-G0KFIG_I: Gontiqur&d ￡roxi consol 亡 fcy consol 亡 CoreSlWvlan databas 皀 辛(Taming: It Is recoun&^Lded t Q confL^u.1；e VLAU ￡rom config jaode 7 巳w VLAN ULQ de Hw be-ng depcecP 丄亡巳吕亡 匚口ixmudt user ioxi f QIC c QXI fagvif VTP/VLAJJ H EX uoi^fig mo 日u. C&rsSTJ (vlan) Uvlan ZO nuts Chin.? s* 17ULM 20 added ITame: CKinese C^reSW (vlsn) Svlsn 3(J nsme Other VLAH 30 added: 图二创建vlan 三、把端口划分给 vlan(基于端口的vlan) switch(c on fig)#i nterface fastethernetO/1 switch(c on fig-if)#switchport mode access switch(con fig-if)#switchport access vla n 10 Cor ?SW>en CoreSWconf t Eix^r^x conf i guxa^i^n coxmandf cue p 巳E 1 me - Ezxd 丽久匕h CMTL/2. C QE ig) face f s&O/l Co r eSW < con. f i q —i ￡) JEsiritctipoirt- mode acc ess CortfiSW if J ^svi-tcliport mode ruuwsw CorfiSW(conti^-if )tfsvitchpart vlan ID Cor eSU(conf ig-i f) f| 图三 如果一次把多个端口划分给某个 vlan 可以使用in terface range 命令 匚口 r e SU {coj^.￡￡g — x f J S int-e r face r artge ￡a0/2 - 4 Core SU (cozifig ■- z ￡—rang^e J f strife czRp o 工七 ULodLe access Core SU (c on ￡ i >g — i f —r J # suit czKp o rt accres s 17-1311 总 0 CoreSU (config --i f —iran^e J Sfliiterrfa.c e xangre f a0_/￡ — 5 匚口reSTT (coanf ig --! f —irsn^e J $siuitchp o r t mode access CoreSTT (conf ig —i f —皀)#access vJLaxi 30 CoreSU (config —i ) # 图四 进入端口配置模式 配置端口为 access 模式 把端口划分到vlan 10 四、查看vian信息 switch#show via n CoizeSWJsti vlaix Port 占 1 d& fpu丄匕active FiO/fi, FaCi/3, FaO/LO, TaO/lL FaO/丄Z” FaO/13, Fad/丄4” FaC/15 FaO/丄FaO/17, FaO/18, Fa￡i/19 FaQ/20, F^Q/SJ.^ Fa^/22, FaPfE3 FaO/Z^, Gig-1/1, 10Hath act- iv?Fa.0/l r FaCi/7 2Q Chinese active FiO/2, PaCi/3, Fa0/4 30Otkat active Fa.0/^, FaO/6 丄002 f ddz-de f SLU L匸active 1003匸ok en- ring - f Quit act ive 1004￡ddinet-de fault active 1005 trneu-(3ef ault-active VLA M Type SAID KTTJ Parent RingJJo B^idgeNo Stp Brd.gMede Transi 1enet1000011￡00 -―-- 10esne 七100010isac -一-- 2Q胡点匸L00020l￡0C -一-- 30enet100030isoo --—— 1002enec L010021500 --■- 1.003enet1010031S00 -一-- 1004 旳刍匸10100415 00 一—-- jogs gxi.ig'C LQ1QQS 1 5 00 一——— 冬五 图六show vian brief 查看vian简明信息 图七查看id为10的vian 图八通过vian的名字查看vian 五、删除配置 eSW (config) ^int.er face CoiraSU tconf ig-lf) vlari 40 Cor eSU (conf i^-if)歩ex it 亡or e￡U(config}#ex￡t 图九把第0个模块中的第8个端口从vian 40中删除 图十删除vian 40 我们还可以为每个vian配置ip地址 Packet Tracer 建构CCNA实验攻略(3)——Cisco VTP VTP(Vian Trunk Protocoi) 即VLAN中继协议。VTP通过网络(ISL帧或cisco私有DTP帧)保持VLAN g己置统一性。VTP在系统级管理增加，删除，调整的VLAN自动地将信息向网络中其它的交换机广播。此外，VTP减小了那些可能导致安全问题的配置。便于管理,只要在vtp server做相应设置,vtp ciient 会自动学习vtp server 上的vian 信息。 、实例拓扑图 图一核心交换机Cisco 3560 、配置VTP 核心交换机Cisco 3560 配置为vtp Server,vtp domain 为senya。 CoreSU (config—if J jSin-t 0/1 Cor e SU ( c on ￡ i g— d. ￡ ) w it clip or t nuo de t r uzJi 匚ar 1 f) #int fa 3/2 Cor sSU^coaf) #5vltchp&ri：t-ruxk *LINEJHOTCi- 5-UPD0W; Line protocol an f ac? Fa￡tKthQrnat.O/Z F changed ￡Cat? t □ dovn LIN KJ ROTS-5-UPD Own：iKne protocol on Inter fact FastEtharn&t-D/Z, chang t-d s^At&t a up Cor a SU (cenf 1 g-1 ￡) #| 图三配置trunk链路，允许带vlan标记的以太网帧通过该链路 图四配置汇聚层(接入层)交换机 图五 图六 、创建Vian及端口划分 动物实验操作的基本知识 一、实验动物抓拿固定 （一）小白鼠(mouse) 右手抓住其尾，放在鼠笼铁纱网上，然后用左手拇指及食指沿其背向前抓住其颈部，并以左手的小拇指和掌部夹住其尾固定在手上(图3-1)。取尾血及尾静脉注射时，可将mouse固定在金属或木制的固定器上。 （二）大白鼠(rat) 实验者应戴帆布手套，用右手将鼠尾抓住提起，放在粗糙的台面或鼠笼上，抓住鼠尾向后轻拉，左手抓紧两耳和头颈部皮肤，余下三指紧捏鼠背部皮肤，如果rat后肢挣扎厉害，可将鼠尾放在小指和无名指之间夹住，将整个鼠固定在左手中，右手进行操作（图3-2）。若进行手术或解剖，则应事先麻醉或处死，然后用棉线活结缚四肢，用棉线固定门齿，背卧位固定在大鼠固定板上。需取尾血及尾静脉注射时，可将其固定在大鼠固定盒里，将鼠尾留在外面供实验操作。 （三）豚鼠(cavy) Cavy具有胆小易惊的特性，因此抓取时要求快、稳、准。一般方法是：以右手拇指和食指夹住两前肢及头部，使整个颈胸部皆在手掌中（不要抓得太紧以免窒息），左手抓住两后肢，使腹部向上，而后进行操作（图3-3）。 （四）蛙或蟾蜍(frog or toad) 捉拿方法宜用左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、小拇指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左，右前肢，右手进行操作（图3-4）。 在捉拿toad时，注意勿挤压其两侧耳部突起之毒腺，以免毒液射到眼中。 实验如需长时间观察，可破坏其脑和脊髓以后放在蛙板上固定进行操作。 （五）家兔(rabbit) 用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使家兔的体重主要落在左手掌心，然后按实验要求固定（图3-5）。作兔耳血管注射或取血时，可用兔盒固定。作各种手术时，可将家兔麻醉后固定在手术台上。固定方法常采用仰卧位固定，四肢用粗棉线固定，头用兔头固定夹固定或用棉线钩住家兔门齿再固定在兔台头端铁柱上。 （六）狗(dog) 生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐) (2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只 一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合 用小鼠做实验的基本知识 1．实验动物环境可分为： 外环境。是指实验动物设施或动物实验设施以外的周边环境。如气候或其他自然因素、邻近的民居或厂矿单位、交通和水电资源等。 内环境。指实验动物设施或动物实验设施内部的环境。内环境又细分为大环境和小环境。前者是指实验动物的饲养间或实验间的整体环境状况;后者是指在动物笼具内，包围着每个动物个体的环境状况，如，温、湿度，气流速度，氨及其他气体的浓度，光照，噪音等等。实验动物环境条件,对动物的健康和质量,以及对动物实验结果有直接的影响，尤其是高等级的实验动物，环境条件要求严格和恒定。因而，对环境条件人工控制程度越高，并符合标准化的要求，生活这样环境中的动物，就越具有质量上的保证，一致性的程度就越高，动物实验结果就有更好的可靠性和可重复性，也使同类型的实验数据具有可比较的意义。 影响实验动物环境的因素及其控制： 气候因素。包括有温度、湿度、气流和风速等。在普通级动物的开放式环境中，主要是自然因素在起作用，仅可通过动物房舍的建筑座向和结构、动物放置的位置和空间密度等方面来作有限的调控。在隔离系统或屏障、亚屏障系统中的动物，主要是通过各种设备，对上述的因素予以人工控制。在国家制定的实验动物标准中，对各质量等级动物的环境气候因素控制，都有明确的要求。 理化因素。包括有光照、噪音、粉尘、有害气体、杀虫剂和消毒剂等。这些因素可影响动物各生理系统的功能及生殖机能，需要严格控制，并实施经常性的监测。普通级动物要在适当的范围内，采取有效的措施，对此予以监控;尤其是清洁级以上等级的动物，应通过实验动物设施内的各种设备，按国家颁布的各个等级标准，严格予以控制。 生物因素。是指实验动物饲育环境中，特别是动物个体周边的生物状况。包括有动物的社群状况、饲养密度、空气中微生物的状况等。例如，在实验动物中许多种类，都有能自然形成具有一定社会关系群体的特性。对动物进行小群组合时，就必须考虑到这些因素。不同种之间或同种的个体之间，都应有间隔或适合的距离。对实验动物设施内空气中的微生物有明确的要求，动物等级越高要求越为严格。国家标准规定，亚屏障系统设施内空气落下的菌数少于或等于12.2个/皿时，屏障系统2.45个/皿时，隔离系统0.49个/皿时。 2．对实验动物设施的环境条件，国家有标准化的规定，检测项目包括温度、相对湿度、气六速度、梯度压差、空气洁净度、空气落菌数、氨浓度、噪声、照度和换气量等。 环境检测的项目 空气洁净度的指标包括有：空气落菌数，是检测空气生物洁净度的指标，用血琼脂培养基，置于被检房舍的空间，暴露30分钟后，计算培养基上的落菌数;尘埃粒子测定，是空气洁净级别的指标，10-20平米的房间布点3-5个，用专用仪器测定，数据作统计分析。 此外还有下列七项指标的测定：温度、湿度测定，包括日温差、温湿度的均匀性等;气流速度测定，使动物处在合理的风速区域;换气次数，测定送风口或出风口的风速，然后参照风口面积和房间容积计算;静压差测定，用压差计测定设施内各区域的压差，分析设施内气流走向的合理性;噪声测定，用噪声计，选离墙壁1米，距地面1.2-1.5米的测点测定;照度测定，常用仪器是照度计，采用多测点测定，检测光照的均匀性;氨浓度测定，该检测项目通 实验一：感受态细胞的制备 1.原理： 当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。 2.实验材料 2.1LB液体培养基 2.20.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中， 定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。 2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）； 移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱 3.操作方法 3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。 3.2自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。 3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。 3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。 3.5加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。 3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。 3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。 3.8置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。 思考题： 制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？ 钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。 生物学基础实验技能 实验讲义 王玉倩冯晓英郭娟张潮汤晓辛唐婧编 贵州师范大学生命科学学院 2012年6月 目录 一、显微操作 (2) 实验一显微镜的使用方法与绘图 (2) 实验二简单临时装片的制作与观察，油镜的使用 (6) 实验三压片的制作，涂片的制作 (8) 实验四生物材料的解剖结构观察 (10) 二、溶液配制 (11) 实验五玻璃器皿的洗涤 (11) 实验六、溶液的配制Ⅰ (13) 实验七、溶液的配制Ⅱ (15) 实验八溶液pH值的调节 (18) 三、分光光度计的使用 (20) 实验九分光光度法的介绍及分光光度计的使用方法 (20) 实验十混合物中CuSO4的测定 (24) 实验十一分光光度法测定叶绿素的含量 (26) 四、无菌操作 (28) 实验十二无菌操作技术 (28) 一、显微操作 实验一显微镜的使用方法与绘图 一、实验目的 1、掌握显微镜的构造及原理，熟练使用光学显微镜。 2、了解显微镜使用的基本要求、注意事项及一般维护方法。 3、学习生物绘图的基本要求及方法。 二、实验原理 显微镜的原理是经过两次成像，成为倒立的虚像。第一次先经过物镜成像，在物镜的一倍焦距和两倍焦距之间成放大的倒立的实像。第一次成的物像，经过目镜的第二次成像，是一个虚像。倒置的像常常使初学者使用发生困难。 1、显微镜的构造 机械部分 (1) 镜座 显微镜最下面呈马蹄形或园形的部分，起稳定和支持镜身作用。 (2) 镜柱 从镜座向上直立的短柱。上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。 (3) 镜臂 弯曲成马蹄形的部分，便于手持，下端与镜柱相连接的地方有一个倾斜关节，可使镜臂倾斜，便于观察。 (4) 载物台 自镜臂下端向前伸出，放置标本用的平台，其中央有一个园孔，叫通光孔。台上有一移动器（老式的左右各有一个压片夹），用以固定和移动标本。 (5) 镜筒 和镜臂上方连接的园筒部分。有的显微镜镜筒内有一抽管，可适当抽长，一般长度是160－170毫米。镜筒上端装有目镜，下端有一个可转动的园盘，叫物镜转换器（或叫物镜旋转盘，固着在镜筒下端，分两层，上层固着不动，下层可自由转动。转换器上有2～4个圆孔，用来安装不同倍数的低倍或高倍物镜）。作用是保护成像的光路与亮度。 (6) 调节器（也叫调节螺旋） 为镜壁上两种可转动的螺旋，一大一小，能使镜筒上下移动，调节焦距。大的叫粗准焦螺旋，位于镜臂的上方，可以转动，以使镜筒能上下移动，从而调节焦距，升降镜筒较快，用于低倍镜对焦；小的叫细准焦螺旋，位于镜臂的下方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，升降镜筒较慢，可以细调焦距。 (7) 倾斜关节 镜柱和镜臂交界处有一个能活动的关节。它可以使显微镜在一定的范围内后倾（一般倾斜不得超过45°）便于观察。但是在使用临时封片观察时，禁止使用倾斜关节，尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用，以免污损镜体。 (8) 载物台 从镜臂向前方伸出的金属平台。呈方形或圆形，是放置玻片标本的地方。其中央具有通光孔，在通光孔的左右有一个弹性的金属压片夹，用来压住载玻片。较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上移 Ⅰ生物化学基本实验技术 一、分光光度法 （一）原理 光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400—760nm。短于400nm的光线称为紫外线（200—400nm为紫外光区），短于200nm 的叫远紫外线，再短的就是X射线和γ射线了。长于760nm的光线称为红外线（760—500000nm为红外区），再长的就是无线电波了。 可见光区的电磁波，因波长不同而呈现不同的颜色，这些不同颜色的电磁波称为单色光，单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内的光，太阳及钨丝灯发出的白光，是各种单色光的混合光，利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等，这就是光谱。 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液之后，部分光波减少。例如，可见光通过有色溶液后，或红外线通过多种气体后，部分光波被吸收。不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，故可利用各种物质的不同的吸收光谱特征及其强度对不同物质进行定性和定量的分析。 在可见光范围内，利用溶液的颜色深浅来测定溶液中物质含量的方法，称为比色法。采用适当的光源、棱镜和适当的光源接受器，可使溶质浓度的测定范围不仅仅局限于可见光，尚可扩大到紫外光区和红外光区。这就是分光光度法。 分光光度法是生物化学中最有价值的测定方法之一。通过测定紫外、可见或红外的特征吸收光谱可以鉴定未知化合物；通过测量在某一波长的光吸收可以测定溶液中未知化合物的浓度。 分光光度法所依据的原理是Lambert和Beer定律。 1．Lambert定律一束单色光通过透明溶液时，一部分波长的光波被吸收，被吸收光波的量与溶液厚度有一定的比例关系。 即： 以前做过的实验： 病毒学实验：抗体检测：血凝抑制 ELISA 抗原检测：血凝 PCR 胶体金检测试纸卡测抗原细菌学实验：药敏试验 水质监测测大肠杆菌 其他：PH计测畜禽饮用水PH值 显微镜法测虫卵（饱和盐水法） 建议：可以采用的其他的检测试纸卡扩大抗原检测的种类和缩短检测时间。 各实验具体步骤： 病毒学实验 1.抗体检测： 有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。 疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验 目的意义： 1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法； 2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。 基本原理： 许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。 血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。 器材及试剂: 待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液； 待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清； 生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。 实验步骤 (一)血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水25ul，第二排1-12孔加生理盐水25ul为红细胞对照； 2、吸25ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取25ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去25ul， 3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul。 4、室温静置10-30分，观察结果 5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集 的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价 （二）血凝抑制试验（HI） 取一96孔板，按以下步骤操作： 1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。（根据学农实验配置4单位抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数除以4即为含4单位抗 第五章常用分子生物学技术的原理及其应用习题（引自网络精品课程） 一、选择题 （一）A型题 1 ．分子杂交实验不能用于 A ．单链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 B ．双链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 C ．单链 RNA 分子之间的杂交 D ．单链 DNA 分子之间的杂交 E ．抗原与抗体分子之间的杂交 2 ．关于探针叙述错误的是 A ．带有特殊标记 B ．具有特定序列 C ．必须是双链的核酸片段 D ．可以是基因组 DNA 片段 E ．可以是抗体 3 ．下列哪种物质不能用作探针 A ． DNA 片段 B ． cDNA C ．蛋白质 D ．氨基酸 E ． RNA 片段 4 ．印迹技术可以分为 A ． DNA 印迹 B ． RNA 印迹 C ．蛋白质印迹 D ．斑点印迹 E ．以上都对 5 ． PCR 实验延伸温度一般是 A ．90 ℃ B ．72 ℃ C ．80 ℃ D ．95 ℃ E ．60 ℃ 6 ． Western blot 中的探针是 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．抗体 E ．双链 DNA 7 ． Northern blotting 与 Southern blotting 不同的是 A ．基本原理不同 B ．无需进行限制性内切酶消化 C ．探针必须是 RNA D ．探针必须是 DNA E ．靠毛细作用进行转移 8 ．可以不经电泳分离而直接点样在 NC 膜上进行杂交分析的是 A ．斑点印迹 B ．原位杂交 C ． RNA 印迹 D ． DNA 芯片技术 E ． DNA 印迹 9 ．下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．蛋白质 E ．双链 DNA 10 ． RT-PCR 中不涉及的是 A ．探针 B ． cDNA C ．逆转录酶 D ． RNA E ． dNTP 11 ．关于 PCR 的基本成分叙述错误的是 A ．特异性引物 B ．耐热性 DNA 聚合酶 C ． dNTP D ．含有 Zn 2+ 的缓冲液 E ．模板 12 ． DNA 链末端合成终止法不需要 A ． ddNTP B ． dNTP C ．引物标记 D ． DNA 聚合酶 E ．模板 13 ． cDNA 文库构建不需要 A ．提取 mRNA B ．限制性内切酶裂解 mRNA C ．逆转录合成 cDNA D ．将 cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E ．重组载体转化宿主细胞 14 ．标签蛋白沉淀是 A ．研究蛋白质相互作用的技术 B ．基于亲和色谱原理 C ．常用标签是 GST D ．也可以是 6 组氨酸标签 E ．以上都对 15 ．研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A ．标签蛋白沉淀 B ．酵母双杂交 C ．凝胶迁移变动实验 D ．染色质免疫沉淀法 E ．噬菌体显示筛选系统 16 ．动物整体克隆技术又称为 常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） 当动物有病时，常表现为精神不振、行动迟缓、毛发蓬乱无光泽、鼻部皮肤干燥并流鼻水、眼有分泌物等。 1.大白鼠的生物学特征是什么？主要用于哪些实验？ 大白鼠性情温顺，行动迟缓，易于捕捉，但受惊吓或粗暴操作时，会紧张不安甚至攻击人。 大鼠嗅觉发达，对外界刺激敏感，抵抗力较强。大鼠无胆囊，肾单位表浅，肝再生能力强。大鼠的血压反应比兔稳定，可用它作血压实验，也可用于慢性实验、抗炎、降脂、利胆、子宫实验及心血管系统的实验。药典规定该动物为催产素效价测定及药品指控中升压物质检查指定动物。 2.动物实验的常用方法有哪些？ 动物实验方法已成为医学科学研究和实验教学及相关学科研究中不可缺少的重要手段。 动物的实验方法是多种多样的，在医学的各个学科领域内都有其不同的应用，但基本的实验方法则是共同的， ⑴如健康动物的识别、选择、抓取、固定、麻醉、动物分组、编号、脱毛、给药、采血、取尿、急救、处死、尸检等，不论从事何种课题的医学研究都涉及到这套实验动物基本操作方法。 ⑵动物实验按机体水平不同可分为整体实验和离体实验。还可进一步具体分为分子、亚细胞、细胞、组织、器官、整体动物和无损伤动物等水平的实验。按动物时间的长短则可分为急性实验和慢性实验。 ⑶按学科的实验方法可分为生理学的动物实验方法，病理生理学的动物实验方法，药理学的动物实验方法，病理解剖学、组织学的动实验方法等。 3.实验动物的捉持与固定 如何正确捉拿及固定大白鼠？ 以防大鼠在惊恐或激怒时咬伤手指，捉拿时最好带上防护手套， 右手抓住鼠尾立即提起，放在易攀抓的粗糟面上， 用左手拇指和食指抓住其两颊及后枕部皮肤，充分固定慎防咬伤， 其余手指握住整个鼠体，注意握力不要太大，以免大鼠窒息死亡。 然后将其腹部向上，作腹腔麻醉，最后固定。 4．实验动物性别的鉴别？ （1）如何鉴别小、大鼠的性别？ 根据外生殖器（阴蒂或阴茎）与肛门之间的距离来判断这些动物新生仔的性别， 一般间隔短的是雄性，外生殖器阴茎与阴蒂大，但是对此判别要有一定经验，成熟期雌性有阴道口，有膨起的阴囊和阴茎。 5．实验动物编号标记的方法 （1）为什么要对实验动物进行编号标记？标记的方法有几种？ 动物在实验前常常需要作适当的分组，不同的体重或相同的体重放在同一个笼时，这就 需要编号标记。标记的方法很多，良好的标记方法应满足标号清晰、耐久、简便、适用、无 明显损伤、无毒和易辨认等要求。标记的方法有染色标记法、号牌法、打孔剪口法和剃毛、 剪毛法。 分子生物学实验技术 目录 实验一细菌的培养 (2) 实验二质粒DNA的提取 (3) 实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 (4) 实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (5) 实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (7) 实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (8) 实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (9) 实验八RNA提取与纯化 (11) 实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA (13) 实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 (15) 实验十一感受态细胞的制备及转化 (16) 实验十二克隆的筛选和快速鉴定 (18) 实验十三DNA分析——Southern杂交 (19) 一基本操作 实验一、细菌培养 实验二、质粒DNA提取 实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析 实验八、植物RNA提取及纯化 二、目的基因获取 实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应 实验十一、感受态细胞的制备及转化 实验十二、克隆的筛选和快速鉴定 实验十三、DNA分析——Southern杂交 实验一细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 （一）实验材料 大肠杆菌 （二）试剂 1、胰蛋白胨 2、酵母提取物 3、氯化钠 4、1mol/L NaOH 5、琼脂粉 6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等） （三）仪器 1、培养皿 2、带帽试管 3、涂布器 4、灭菌锅 5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等） 6、恒温摇床 四、操作步骤 （一）LB培养基的配制 配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入： 细菌培养用胰蛋白胨10g 细菌培养用酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。 LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。 （二）细菌的培养 （１）在液体培养基中培养 实验一、药理学实验的基础知识和药理学总论实验 一、实验动物的基本技能和实验技术基础 1、实验动物的标记 大、小鼠和白色家兔的标记常用3～5％黄色苦味酸溶液涂于皮毛上标号。常用的方法：1号 --- 左前腿 2号 --- 左腰部 3号 --- 左后腿 4号 --- 头部 5号 --- 正中 6号 --- 尾根部 7号 --- 右前腿 8号 --- 右腰部 9号 --- 右后腿 10号 ---不标记 2、实验动物的捉持（大、小鼠） (1)小鼠的捉持用右手提起鼠尾，放在粗糙物（如鼠笼盖）上面，向后轻拉鼠尾；用左手拇指和食指捏住其两耳颈背部皮肤，将小鼠固定在掌中，使其腹部朝上，然后以无名指和小指夹住鼠尾或小鼠的左后肢。 （2）大鼠的捉持捉持和固定方法基本同小鼠，无经验者可戴上防护手套，并应动作轻柔。用右手捉住鼠尾，放在鼠笼盖上，向后轻拉鼠尾；左手掌面向鼠背，食指和中指压住鼠的头顶，拇指和无名指分别从鼠的两腋下插入，将鼠的两前肢卡住；或拽紧鼠后颈及后背皮肤即可。 3、实验动物的给药方法（大、小鼠） （1）小鼠的给药方法 灌胃（ig）：将小鼠固定后，使颈部拉直，右手持装有灌胃针头的注射器，自口角插入口腔，压其头部，使口腔与食道成一直线，沿上腭壁向鼠口腔的后下方轻轻插入食道。如遇阻力，可将针头抽出再插，以免刺破食管或误入气管。一般给药量为0.1-0.3ml/10g（体重）。 皮下注射（H或sc）：常在背部皮下。轻轻捏起背部皮肤，将注射针头刺入皮下，稍稍摆动针头，若容易摆动则表明针尖位于皮下。然后注入药液。一般给药量为0.1-0.20ml/10g （体重）。 腹腔注射（ip）：左手固定动物，右手持注射器，从下腹部外侧，呈45度角刺入腹腔，进针约3～5mm（注意：进针不宜过深，以免伤及肝脏和脾脏。注药前回抽一下，无回血时再注药）。一般给药量为0.1-0.3ml/10g（体重）。 肌内注射(im)：多注射于后肢股部肌肉，一般每侧不超过0.1ml。 尾静脉注射（iv）：将小鼠置于固定筒内，使尾部露在外面，用70％～75％的乙醇棉球擦尾部，或将鼠尾浸入45～59oC温水中，待尾部左右侧静脉扩张后，左手拉尾，右手进针。一般给药量为0.1-0.2ml/10g （2）大鼠的给药方法 均同小鼠。一般情况下，灌胃剂量为1～2ml/100g，皮下注射、尾静脉注射<1ml / 只，腹腔注射为1.5ml /只，肌内注射为 第二章 常用实验技术及方法 一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR) 反应总体积为50 μl ，其中含有： 模板DNA 0.5 μl PCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 μl 10×MgCl 2 溶液 5 μl dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 μl 引物1 (50 umol/L) 0.5 μl 引物2 (50 umol/L) 0.5 μl Taq DNA 聚合酶 0.5 μl 无菌去离子水加至 50 μl 上层用25 μl 液体石蜡油覆盖。 循环参数为： 94 ℃变性10 min 94 ℃变性1 min 56 ℃退火1 min 72 ℃延伸2 min 共30个循取环，PCR 结束后，取2 μl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。 二、基于PCR 技术的定点突变 1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下 游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）； 2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA 片段1和 DNA 片段2； 3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 μl： 片段1 1 μl 片段2 1 μl 10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 μl 10×MgCl2溶液 5 μl dNTP (2.5 mmol/L) 5 μl Taq酶 1 μl 加ddH2O至50 μl 在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环； 4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突 变的正确性。 三、Total RNA的提取(Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11) 1. 吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 ml的Catrimox-14 TM 溶液，然后充分混匀； 2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心： 细胞数<5×105 ：9500 rpm (约5 000×g) 5 min 细胞数5×105 - 1×10 7 ：3000 rpm (约450×g) 5 min 细胞数>1×107 ：1500 rpm (约112.5×g) 5 min 3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后，12000 rpm离心2 min； 4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动； 5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液； 6. 激烈振荡后，室温下12000 rpm离心5 min，除去溶液； 7. 沉淀用70 %冷乙醇清洗一次； 8. 沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。 实验动物知识与技能测试问答题 1、简述实验动物设施的分类 答： (1)、按功能和使用目的分为两类： 1、繁育生产设施：用于动物生产的建筑物、设备、运行管理的总称。包括：动物生产区、辅助生产区、辅助区。 2、动物实验设施：进行动物实验的建筑物、设备、运行管理的总称。包括：动物实验区、辅助实验区、辅助区。 (2)、按照空气净化的控制程度，《实验动物环境及设施》国家标准（GB14925-20），分为三类： 1、普通环境：符合动物居住的基本要求，控制人员和动物出入，不能完全控制传染因子，但能控制野生动物的进入，适用于饲育普通实验动物。 2、屏障环境：符合动物居住的要求、空气洁净度达到万级、严格控制人员、物品和动物出入及微生物控制，适用于饲育清洁动物和无特定病原体动物。 3、隔离环境：采用无菌隔离装置以保持无菌或无外来污染的状态，保证与外环境绝对隔离，又能满足转运动物时内环境保持一致。适用于SPF、悉生及无菌实验动物。 2、封闭群动物繁殖生产的原则（基本要求） 答：尽量保持封闭群动物的基因异质性及多态性，避免近交系数随繁殖代数增加而过快上升。基于此，从开始引种一直到繁殖生产的过程中不能忽视基因异质性。 3、大鼠、豚鼠的营养需求特点 答：大鼠 1）18-20%的蛋白质 2）饲料中保证必需氨基酸的含量占总能量的1.3%，亚油酸不低于0.3%。 3）不需要补充维生素K，需要补充维生素A 4）对钙磷缺乏耐受，对镁需求量较多 5）添加0.4%的蛋氨酸和0.48%的赖氨酸，可以提高大鼠的生长速度。 豚鼠： 1）对精氨酸需求量很高 2）要求饲料中含有10-12%的粗纤维 3）必需在饲料中补充VC或饲喂青饲料 4、实验动物饲料按营养成分分为哪几类 1）全价配合饲料：营养均衡全面，可以直接饲喂 2）混合饲料：由能量、蛋白质、矿物质等饲料按比例配合而成，可直接饲喂，但营养不全面 3）浓缩饲料：以蛋白质饲料为主，混以矿物质和添加剂混料而成，不可直接饲喂，需按比例添加 4）添加剂预混料：由营养物质添加剂+载体配制而成，不可直接饲喂，需按比例添加 5）乳代饲料：为用以替代自然乳的全价配合饲料，转为待哺乳的幼年动物设计。 5、简述动物福利中的五大自由 生物学实验常用技术 一、分子方面 1基因工程 1）PCR （Polymerase Chain Reaction 2）RT-PCR;Q-PCR 3）琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4）酶切/链接 5）转化 6）固体/液体LB培养基配制（高压蒸汽灭菌锅使用方法）7）质粒大/小抽原理及步骤 （手提、溶液I、II、山作用）8）基因组DNA抽提 9）RNA提取； （TRIZOL法原理、注意事项及步骤）2、蛋白质工程 1）蛋白收集 （蛋白裂解液+PMSF; 2）SDS-PAGE（电泳胶的配制） 2）考马斯亮蓝染色，银染 3）Wester n blot 4）蛋白定量常用的方法及原理,以及熟练操作Bradford法蛋 二、细胞方面 1）细胞培养、传代 2）细胞冻存与复苏 （2）DMSO培养基:血清= 1:3:6均可 DMSO为细胞专用型；现用现配，效果最好；冻存时细胞在-80C中不要超过一周，最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3）细胞培养基配制（过滤除菌）、胰酶配制（过滤除菌）,PBS配制（灭菌）;（不同培养基的区别；谷氨酰胺（提供氮源）,2周补充一次）4）转染 5）MTT原理及操作（检测细胞存活率或死亡率） 6）碱性磷酸酶实验（ALP,检测细胞分化） （5、6需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用） 7）Hoechst 染色 8）结晶紫染色（不推荐） 9）苏木精/伊红染色 （9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮） 10荧光显微镜的使用 11）激光共聚焦显微镜样品制备（细胞固定，染色，洗脱）（7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据） 12）流式细胞仪样品制备（包括:转染效率与细胞凋亡染色标记）以及仪器操作（需学会FlowJo软件分析流式结果） 三、动物实验 1）小鼠的定制: 2006年《分子生物学实验技术》实验内容 一、RT-PCR （一）总RNA的提取 实验安排： 每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS-Biotragents液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入1、将100μl酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。 8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 （二）反转录 实验安排： 每人做一管。 反应体系（20μl）：按下列顺序加样 μl45×Buffer μl6dNTPs μl1RNA酶抑制剂 μl1Oligo（dT）μ随机引 μ反转录AMV1 μ提取RNA6 总体μ20 1h 42反应条件：℃ 注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。dNTPsBuffer加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。℃，以防酶失活。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20 PCR （三）实验安排：每人做一管。 ：按下列顺序加样μl）反应体系（50 ddHO 32.7μl 2510×PCR Buffer μl 4μldNTPs 2P1 μl 2μlP2 0.3Taq μl 4cDNA template μl μl50Total 反应程序： 预变性94℃2min 30s 变性94℃ 45s 退火50℃ 1min 延伸72℃ 第二章 常用实验技术及方法 一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR) 反应总体积为50 μl ，其中含有： 模板DNA 0.5 μl PCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 μl 10×MgCl 2 溶液 5 μl dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 μl 引物1 (50 umol/L) 0.5 μl 引物2 (50 umol/L) 0.5 μl Taq DNA 聚合酶 0.5 μl 无菌去离子水加至 50 μl 上层用25 μl 液体石蜡油覆盖。 循环参数为： 94 ℃变性10 min 94 ℃变性1 min 56 ℃退火1 min 72 ℃延伸2 min 共30个循取环，PCR 结束后，取2 μl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。 二、基于PCR 技术的定点突变 1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下 游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）； 2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA 片 段1和DNA片段2； 3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 μl： 片段1 1 μl 片段2 1 μl 10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 μl 10×MgCl2溶液 5 μl dNTP (2.5 mmol/L) 5 μl Taq酶 1 μl 加ddH2O至 50 μl 在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环； 4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突 变的正确性。 三、Total RNA的提取(Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11) 1. 吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 ml的Catrimox- 14TM溶液，然后充分混匀； 2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心： 细胞数<5×105 ： 9500 rpm (约5 000×g) 5 min 细胞数5×105 - 1×107：3000 rpm (约450×g) 5 min 细胞数>1×107 ：1500 rpm (约112.5×g) 5 min 3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后， 12000 rpm离心2 min； 4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动； 5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液； 6. 激烈振荡后，室温下12000 rpm离心5 min，除去溶液； 7. 沉淀用70 %冷乙醇清洗一次； 8. 沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。动物实验操作的基本知识
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