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分子克隆技术期末考试

一、名词解释

I > Restr i ct i on Endonuc I ease （限制性内切酶）:是一类识别双链DNA分子中的某种特定的核昔酸序列（4-8bp）,并由此处切割DNA的核酸内切酶。

2、Competent ceI I （感受态细胞）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态，即易于吸收外源DNA的细胞。

3、Star activity （星星活性）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。

4、Plasmid （质粒）：是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，其大小通常在1-100KB范围内。

5、Plasmid vector （质粒载体）：在由限制性内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导入宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。

6、Binary vector （双元载体）：既有犬肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。

7、shuttle vector （穿梭载体）：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制，又能在真核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细

菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列（ARS）以及选择标记性状，具有多克隆位点。

8、I socaudarner （同尾酶）：不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可以产生相同的粘性末端。同尾酶切割DNA得到的产物可以进行互补连接。但形成的

新位点不能被原来的酶识别。

9、MCS （multiple cloning site,多克隆位点）：是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，它是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。

10、S igna I peptide （信号肽）：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质定位的N 端的氨基酸

序列（有时不一定在N端）

II > R/M system （restr ict ion and modif icat ion system,限制与修饰系统）：限制酶和

甲基转移酶（甲基化酶）组成限制和修饰系统。限制作用实际上就是限制酶降解外来DNA,维

护宿主遗传稳定的保护机制，甲基化是常见的修饰作用，宿主细胞通过甲基化作用达到识别自

身遗传物质和外来遗传物质的目的。该系统就好比人的免疫系统。

1） restriction （限制）：限制性内切酶将侵入细菌内的外源DNA切成小片段。

2）mod if icat ion （修饰）：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。

二、相关知识点

1>限制与修饰系统的比较

、限制性内切酶的命名原则: 答：主要依据来源而定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。现在通用的命 名原则是： 依次取宿主属名的第一个字母（大写）、种名的头两个字母（小写、斜体）、菌株 号（小写）、然后再加上序号（罗马字）。

如：H/>?dl I I 限制性内切酶，H/7?指来源于流感嗜血杆菌，d 表示来自菌株Rd, I I I 表示序号。

3、 DNA 聚合酶I 与KI enow DNA 聚合酶的关系：

答：Klenow DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶I 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶） 裂解而从全酶中删去5’ T3'外切核酸酶活性的肽段后的大片段肽段，其聚合 性和3’ T5'外切核酸酶活性不受影响。该片段也称KI enow 片段。

即： 枯草杆菌蛋白酶

DNA 聚合酶I ------------------------- Klenow DNA 聚合酶

4、 DNA 连接酶：催化DNA5,磷酸基团与3'務基之间形成磷酸二酯键。

1） T4DNA 连接酶：可以连接粘性末端和平末端；

2） 大肠杆菌DNA 连接酶：只能连接粘性末端。

5、 反转录酶 （reverse transcr iptase ）

依赖于RNA 的DNA 聚合酶，有5' T3'合成DNA 活性，但没有3’ T5'外切 核酸酶活性。 反转录酶的活性包括：5’ T3' DNA 聚合活性（需Mg 2+）,即以RNA 或DNA 为 模板及带3' —0H 的RNA 或DNA 引物合成DNA ； 5' T3'或3' T5' RNA 外切核 酸酶活性，产生5'磷酸及3'務基的长4-20个碱基的核昔酸。

6、 末端转移酶（terminal transferase ）

一种不寻常的DNA 聚合酶，是一种不依赖于模板的DNA 聚合酶，具有5' T3' 外切酶活性。

7、 T4 多核昔酸激酶（T4 poIynucIeotide kinase ）

是一种磷酸化酶，可以将ATP 的卩-磷酸基团转移至DNA 或RNA 的5'末端。

8^ 碱性磷酸酶（a I ka I i ne phosphatase ）

通过除去5'磷酸基团，可以防止DNA 片段自身连接。 二者的关系“

5，H0 -------------------------------------- 0H3'

3' H0——

5' ? 3，OH ------------------------------------- @)5‘

9、 普通载体最基本的原件：MCS 、0RI 以及选择标记。

10、 线性DNA (LDNA)、开环DNA (OCDNA)以及超螺旋DNA (SCDNA)电泳速度的 大小：

0H5'

0H3,

SCDNA>LDNA>OCDNA

11> Cb互补:LacZ7基因编码的a肽链与失去了正常氨基端的0半乳糖昔酶突变体互补，这种现象称为a互补。(现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌B半乳糖昔酶的启动子及其a肽链的DNA序列，此结构称为lacZ'基因。LacZ'基因编码的a肽链是0半乳糖昔酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的0半乳糖昔酶分子oLacZ7基因编码的a肽链与失去了正常氨基端的0 半乳糖昔酶突变体互补，这种现象称为a互补。由a互补而形成的有功能活性的0半乳糖昔酶，可以用X-gal (5-渙-4-氯-3-口引喙-B-D-半乳糖昔)显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-澳-4-靛蓝。因此，任何携带着lacZ'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种B半乳糖甘酶突变的犬肠杆菌细胞后，便会产生岀有功能活性的B半乳糖昔酶，在IPTG (异丙基硫代3-D-半乳糖昔)诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位点后，就会破坏a肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的0半乳糖昔酶相互补的活性a肽，而导致不能形成有功能活性的3半乳糖昔酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。)

蓝白斑实验的原理：由于克隆用载体带有lacZ的调节序列和B ?半乳糖昔酶的部分编码序列，可以与缺陷型宿主在诱导物IPTG存在下，形成a?互补，宿主菌在含色素底物X?qal的培养基平板上形成蓝斑；在有外源DNA片段插入到载体多克隆位点时，就使载体编码0 ■半乳糖昔酶的部分序列失活，带有重组质粒的宿主菌产生白斑。

12、碱裂解法提取质粒DNA的原理：在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状，在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。

13、碱裂解法提取质粒DNA的各溶液的作用：

(1) EDTA：抑制DNase的活性，防止DNA被降解；

(2) NaOH：使双链DNA变性；

(3) SDS：溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，使蛋白质变性沉淀；

(4) KAc-HCI溶液：中和NaOH变性液，使DNA复性；

(5) 乙醇：用于沉淀DNA (乙醇夺取DNA的水分子)；

(6) RNaseA：降解RNA,防止提取的DNA中有小分子RNA；

(7) TE-buffer： DNA 保存液；

(8) 酚?氯仿：蛋白质变性，进一步提取DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。

其中，溶液I (Tris?HCI、EDTA、葡萄糖)：将细胞悬浮起来，葡萄糖溶液维持渗透压，Tris-HCI作为缓冲剂，EDTA抑制DNA酶的活性。

溶液II （NaOH、SDS）：裂解细胞，使蛋白质和取链DNA变性；溶液III

（KAoHCI溶液）：中和NaOH变性液，使DNA复性。

14、Southern杂交和Northern杂交的区别:

答：（1）对象不同（前者检测DNA分子，后者检测RNA分子）；

（2）变性方法不同（前者可用碱变性，后者不能，因RNA的2'碳原子上有務基，对碱不稳定）；

（3）探针不同。

15、Southern杂交与Western杂交的区别：

答：（1）对象不同（前者检测DNA,后者检测蛋白质）；

（2）探针的性质不同，在Western杂交，探针是抗体蛋白。

16、Sanger双脱氧链终止法的基本原理：DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3'?0H末端上进行的。由于2', 3' ?双脱氧三磷酸核昔酸（ddNTP）的3'位脱氧而失去游离?0H,当它参入到DNA链后，3'?0H末端消失，使DNA链的延伸终止。（核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，

只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脫氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3'端的双脫氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。）

17、PCR产物的连接:①在引物的5'端设计酶切位点；②与T载体直接连接（Taq 酶在3'端悬挂一个A）

19、大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点：

答：（1）优点：①研究得最为详尽的原核细菌；②成熟的基因克隆表达受体

40-65°C人工合成的单链DNA 小片

断，碱基顺序分别与所要扩增的模板

DNA双链的5'端相同

72°C, DNA聚合酶按碱基配对原

则在模板上延伸DNA链。

细胞；③繁殖迅速，培养简单，培养代谢易于控制。适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。

（2）缺点：①某些真核生物基因仅能合成出无特异之间结构的多肽链；②缺乏蛋白质加工系统；③内源性蛋白酶易降解外源蛋白；④内毒素导致人体热源反应。

20、酵母表达系统的特点：

答：1）优点：①对其遗传学和生理学的研究比较深入。

②小量培养和大规模反应器中都能生长。

③已经分离出很强的启动子。

④有翻译后的加工。

⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。

⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不需要宿主的安全性检验。

2）缺点：①表达量普遍低。

②常常发生质粒丢失。

③重组蛋白常常超糖基化

④分泌困难，分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙。

⑤酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。

21、外源蛋白一般的表达部位有：细胞质、周质、胞外。

22、穿梭载体的种类及其优点：

答：1）种类：大肠杆菌/枯草杆菌穿梭载体、大肠杆菌/酵母菌穿梭载体、大肠杆菌/动物细胞穿梭载体

2）优点：①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达；

②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。

③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

23、重组DNA分子导入大肠杆菌的方法：

答：1） CaCI2转化法：将大肠杆菌在CaCI2水溶液中浸泡一段时间，经过处理后大肠杆菌细胞对DNA的吸附能力显著提高，转化率也显著提高

基本原理：细菌细胞膜外表面都带有负电荷，而DNA分子由于其磷酸骨架上的磷酸根而带有负电荷，同性相斥使DNA分子不易靠近，CaCI2分子中的Ca2+ 带有两个正电荷，可以与细胞膜表面的负电荷结合，屏蔽斥力，使DNA分子容易接近。当细菌处于冰冻（0°C）的CaCJ溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的竣基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。

2）电转化法：是一种将极性分子穿过细胞膜导入细胞的一种物理方法，在这个过程中一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双分子层从而允许DNA 等分子进入细胞。电转化不仅可以用于大肠杆菌的转化，也可用于几乎所有的细胞。

24、PCR产物的克隆

1）在PCR产物两端添加限制酶切位点

2）A/T克隆法

25、重组体克隆的筛选和鉴定的常用方法：

答：1)酶切鉴定

基本原理：对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组

子。

2) PCR扩增检测法

基本原理：

过程：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。

(1) 从重组克隆中提取质粒(或DNA)

(2) 用外源DNA插入片断引物或载体上的通用引物作PCR

(3) 电泳PCR产物

(4) 检查是否有PCR产物

(5) PCR产物的长度是否与外源基因一致

3)直接电泳检测法

基本原理：从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。