植物同工酶凝胶电泳实验
植物同工酶凝胶电泳实验
一、实验目的和意义
同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。从作用上看，分子形式不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起源，生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具；此外，同工酶还与植物抗性有一定联系，可用来鉴定抗性的强弱。
本实验的实验目的主要是让学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物同工酶的原理及方法、步骤。提高学生的实际操作及动手能力。培养学生对实验结果的分析能力。
二、实验原理
带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。不同组分的蛋白质（包括同工酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷多寡不同，在电场中的运动速度也不同。因此经过电泳便会分成不同的区带。然后用适当的染料着色，这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法。它是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr 和Bis遇到自由基时，便能聚合。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。
三、材料
新旧小麦种子、锦带花上下枝叶片
四、实验器材与试剂
1.器材：电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和凹槽玻璃）；台式高速离心机；烧杯；微量进样器；注射器；皮头滴管；刻度吸；培养皿（染色用）。
2.试剂：丙烯酰胺（Arc）；甲叉丙烯酰胺（Bis）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵（AP）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；甘氨酸（Gly）；琼脂粉；溴酚蓝；甘油；联苯胺；醋酸；α-醋酸萘酯；β-醋酸萘酯；牢蓝RR盐；冰醋酸。
3.试剂的配制：见表1
五、实验步骤
1．样品的提取
称取1g不同处理的材料，加入少量提样缓冲液，置冰浴研磨成匀浆后定容至5ml，8000rpm离心6min，取上清液贮于冰箱备用。
2．凝胶制备：
（1）取电泳玻板，用去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污。将玻板安装到电泳槽上。用电极缓冲液配制1.5%琼脂胶，沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管沿板上部灌入两侧的封胶空隙，注意不要产生气泡。20分钟后凝固。
（2）按照表1中的A液：B液：水：C液=1：2：1：4的比例配置凝胶，混匀后用一细玻棒引流，缓缓注入胶室中，注胶过程防止气泡产生。胶液加到与凹槽相平时停止，插入预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。（本实验为A液：B液：水：C液=2.5：5：2.5：10）
3.点样及电泳：
（1）向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳（不要拉断样槽隔墙）。将少许提取液与溴酚蓝指示剂以5：1混合。用微量进样器针头插入样槽下部慢慢进样。每槽点样30μl。
（2）上槽接负极，下槽接正级，接通电源，电流调至15~20mA，电压为200V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿1 cm处，将电流、电压调至零后断电。
（3）电泳结束后，取下玻板，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入染色液中。
4.染色：
（1）过氧化物酶染色联苯胺贮存液16ml（2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再加水72ml），0.6%过氧化氢16ml，水48ml。将胶板浸入此液中，待出现兰色条带后，弃去染色液用水洗涤保存。
（2）酯酶同工酶显色称取30mg α-醋酸萘酯，30mgβ-醋酸萘酯，50mg坚牢蓝RR（或坚牢蓝B），先用约4ml丙酮溶解，再用0.1mol/L pH6.5的磷酸缓冲液稀释到60ml，将胶板浸入此液中，室温下显色约20min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带。弃去染色液，用蒸馏水漂洗。
5.结果保存：
将脱过色的凝胶按照颜色深浅绘成的谱带图作为实验报告的凭证。
六实验结果与分析
过氧化物酶 酯酶
从左到右依次是新种子、旧种子、锦带花上叶、锦带花下叶
从图上看新种子过氧化物酶、酯酶的活性都大于旧种子的，锦带花下叶过氧化物酶的含量多于上叶的并且存在差异性。酯酶没有显现。新种子中过氧化物酶比酯酶更明显，锦带花过氧化物酶比酯酶更明显。
有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点
1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件； 旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。 低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。 凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。 注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。 2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例） 1) 淋巴细胞的提取 ①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。 ②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。 ③重复洗涤细胞两次。 2) 琼脂糖玻片的制备 ①制好微型电泳槽。 ②使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。 3) 细胞裂解、电泳 ①好的玻片浸入新配的预冷的(4oC)中性裂解液中裂解1.5h。 ②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。 ③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。 4) 染色 用溴化乙啶(2μg/ml)染色。 用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。 5)读片和分析 ①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓 取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。 ②用CASP软件分析系统分析慧星图像。 3、biomed96 ：lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。 铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点胶。 裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解1小时 解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。 染色：PI 50ug/ml染色15分钟。 结果是什么都看不到，好像一点都没染色。 lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解
LDH同工酶
LDH同工酶 定义1：具有相同底物，但电泳迁移率不同的酶。可来简介 用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚体，LDH有两类肽链，A（M）或B（H），各有不同同工酶 的免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形成，称为纯聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体。 编辑本段分类 基因性同工酶或原级同工酶 由不同基因产生的肽链而衍生的同工酶。这里所指的不同基因可以在不同染色体或在同一染色体的不同位点上，例如LDH中A、B两条肽链的基因分别在第11及第12对染色体上，唾液淀粉酶和胰淀粉酶的基因在第1对染色体的不同位点上。这类同工酶因分子结构差异较大，彼此间无交叉免疫。但同工酶的不同基因也可以是同源染色体的等位基因，这种成对的等位基因上两个基因结构不同的情况，在遗传学上称为杂合子。杂合子在同一个体中可合成同一种酶的两种不同
肽链，或亚基，这两种亚基尚可杂交，形成同工酶。在生物群体的不同个体中，有时同一基因位点上的一个（对杂合子来说）或一对（对纯合子来说）基因也可发生遗传变异，从而产生变异的酶，出现群体中的遗传多态。不同个体中这些遗传变异的酶也属于基因性同工酶。其在免疫学上常有交叉反应。由同一基因转录出前体核糖核酸（前体RNA），经过不同的加工剪接过程而生成多种不同的mRNA，再转译出多种肽链，从而组成同工酶。这类同工酶因发现较晚，在国际上尚无统一命名，彼此间也有交叉免疫。 次生同工酶或转译后同工酶 由同一基因、同一mRNA转译生成原始的酶蛋白，再经过不同的化学修同工酶试剂 饰，如酰胺基水解、磷酸化、肽链断裂、糖链上的糖基增减等形成不同结构的酶蛋白，它们的免疫性往往相同。国际生化协会命名委员会（CBN）建议只将原级同工酶列为同工酶，而将次生同工酶称为共合酶，但不少生化学家还是把上述各类酶的不同结构形式都包括在广义的同工酶概念中。 编辑本段功能 在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能，例如动物肝脏的碱性磷酸酯酶和肝脏的排泄功能有关，而肠粘膜的碱性磷酸酯酶却参与脂肪和钙、磷
彗星试验步骤
彗星试验步骤 1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。 1.5.4.1 制片 将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。 1.5.4.2 铺胶 取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。 1.5.4.3 裂解 轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。 1.5.4.4 解旋 从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。 1.5.4.5 电泳 电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。 1.5.4.6 漂洗及染色 电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。 以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。 1.5.4.7 结果观察 荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全
同工酶分析
锰胁迫下美洲商陆CAT, POD活性的变化以及同工酶谱分析 专业：生物科学 作者：范英姿指导老师：彭喜旭，王海华 (湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201) 摘要:采用室内培养及生理指标测定方法，研究了不同锰胁迫水平（0.005，0.010，0.015 mol/L）下，美洲商陆幼苗中过氧化氢酶（CAT）活性、CAT和过氧化物酶（POD）同工酶谱带的变化，结果表明：随着锰浓度的增加，美洲商陆幼苗中CAT活性呈一个先增大后降低的趋势，CAT同工酶电泳分析表明，处理和对照中，CAT谱带均为一条，迁移率相同(Rf=0.41)；CA T谱带亮度变化表明，第2d的10000 mmol/L CAT同工酶活性最强，而到第4d美洲商陆CA T活性降低，与CA T紫外光光度计测活性结果一致；POD同工酶电泳分析表明，POD活性变化趋势与和CA T一致，提示在0.005～0.015 mol/L浓度范围的锰胁迫下，美洲商陆的活性氧清除能力增强，而0.015 mol/L时，美洲商陆活性氧清除能力下降。 关键词:锰胁迫；美洲商陆；CA T；POD；同工酶谱分析 Manganese to deal with excessive land CAT, POD and changes in the activity of the isozyme spectrum analysis Major：Life Sciences Author: Fan Yingzi Director: Peng Xixu, Wang Haihua (School of Life Science, Hunan University of Science and Technology Xiangtan 411201, Hunan) Abstract: Indoor cultivation and use of physiological indicators of method to study the different stress levels of manganese (0.005,0.010,0.015 mol / L), Phytolacca americana seedlings in the catalase (CAT) activity, CAT and peroxidase (POD) Isozyme bands change, The results showed that: With the increasing concentration of manganese, Phytolacca americana seedlings in the CAT activity increased after the first was a decreasing trend, CAT isoenzyme electrophoresis analysis showed that the treatment and control of, CAT are a band, the same rate of migration (Rf = 0.41); CAT bands brightness changes show that the first 2 d of 10000 mmol / L CAT isozyme of the strongest, and to the first American to land 4 d CAT activity decreased, and CAT ultraviolet spectrometer measurement of results are consistent; POD isoenzyme electrophoresis analysis showed that, POD activity of CAT and consistent with the trend, Tip in the 0.005 ~ 0.015 mol / L manganese concentration of the stress, the Inter-American to land the ability to enhance the removal of reactive oxygen species, and 0.015 mol / L, Phytolacca americana active oxygen scavenging ability. Key words: manganese stress; Phytolacca americana; CAT; POD; isozyme spectrum analysis.
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1 陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪 广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021） E-mail：lcling78@https://www.360docs.net/doc/d213621250.html, 摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。 关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤 目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。 DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。鉴于此，本研究以此法检测染锰后对神经细胞遗传物质的影响，探讨锰神经毒性的机制，为锰中毒的防治提供研究基础。 1. 材料与方法 1.1 试剂 MnCl2·4H2O(购自上海生化试剂公司, AR级), Dulbcco's Modifed Eagle 培基(DMEM,高糖)及新生小牛血清购自Gibco公司(美国)，L-谷氨酰胺与多聚赖氨酸 (PL YS)购自生物工程产品公司（上海）.低熔点凝胶(LMPA)及正常熔点凝胶(NMPA)、TritonX-100、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、Tris-HCl、溴乙锭(EB) 购自Sigma 公司（美国）其他所有试剂都达试验用的分析纯级 1.2 皮层神经元的原代培养 制备原代皮层神经元方法参照方法所述[1]. 取新生24小时内Wistar 乳大鼠，消毒后冰层上剥离大脑皮层，解剖显微镜下剔除血管、脑膜及海马组织后转入盛D-Hank’s液的玻璃瓶，机械法分离神经细胞。200um稠布筛网过滤神经细胞悬液，滤后悬液800转/分离心5 1本课题得到国家自然科学基金资助项目（项目批准号：30260095）的资助。
同工酶在临床上的意义
同工酶在临床上的意义 生物工程 1092820112 万晓佳 同工酶（isozyme，isoenzyme）广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。按照国际生化联合会（IUB）所属生化命名委员会的建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶。同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸，后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。 在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能，例如动物肝脏的碱性磷酸酯酶和肝脏的排泄功能有关，而肠粘膜的碱性磷酸酯酶却参与脂肪和钙、磷的吸收。对LDH催化的可逆反应，心肌中富含的LDH1及LDH2在体内倾向于催化乳酸的脱氢，而骨骼肌中丰富的LDH4及LDH5则有利于丙酮酸还原而生成乳酸。所以同工酶只是做相同的“工作”（即催化同一个反应），却不一定有相同的功能。 在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段，癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象，即合成过多的胎儿型同工酶。如果这些变化可反映到血清中，则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。此外。因同工酶谱有脏器特异性，故测定血清同工酶常可较特异地反映某一脏器的病变，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是诊断心肌梗塞较特异的指标，较测定血清LDH或肌酸激酶（CK）总活力更为可靠。 目前，同工酶对疾病的诊断和鉴别诊断都有重要意义。 同工酶的分布有明显的组织差异或细胞内的定位不同，使其具有较大的临床应用意义。 1）同工酶在不同组织中差异的临床意义： 因为存在组织差异，所以可根据其变化来推测受损的组织或器官。例如CK-MB活性增高对判断心肌梗死有意义。心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD1活性上升，且LD1>LD2则说明有心肌疾病，如果在此基础上还出现LD5>LD4则说明在心肌损伤的同时并伴有肝的损伤，例如右心衰竭引起肝淤血状态。
毒性试验整理
实验一发光细菌的急性毒性评价试验 一、实验器材 1.菌株 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum） 2.培养基 酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。 3.溶液、试剂及待测物质 酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。 4.仪器及其他用品 生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。 二、目的要求 1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。 2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。 三、基本原理 发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下： FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光 具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为 407-409 nm处的蓝绿光。 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳之令狐文艳创作
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 令狐文艳 一、目的 1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程 3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程 二、实验原理： 1、电泳原理及影响电泳的主要因素 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2） V= E·q·a/6πrη (1) u= q·a/6πrη (2)
由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。 另外，迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触
的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。 最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。最常见的为0.05。 在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：Ⅰ＝ 1/2ΣmiZi2 (3) （3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。 2、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法
ISS N 100727626 C N 1123870ΠQ 中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology 2005年10月 21(5):691～694 ?技术与方法? 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 翁 瑜1),2), 曾群力2),3), 姜 槐2), 许正平2),3)3 (1)浙江大学生命科学学院;2)浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点研究实验室;3)浙江大学医学院环境基因组学研究中心,杭州 310031) 摘要 组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(22DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF27蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF27细胞总蛋白的提取效率.MCF27细胞经培养后,分别采用M2PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF27细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M2PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15～70kD,pH417～613的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M2PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF27细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容. 关键词 蛋白质提取,双向凝胶电泳,MCF27,条件优化 中图分类号 Q503 Comparison of Three Protein Extraction Methods by Tw o2 Dimensional E lectrophoresis WE NG Y u1),2),ZE NG Qun2Li2),3),J I ANG Huai2),X U Zheng2Ping2),3)3 (1)College o f Life Sciences,2)Bioelectromagnetics Laboratory,3)Research Center for Environmental G enomics, Zhejiang Univer sity School o f Medicine,Hangzhou 310031,China) Abstract Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2res olution protein separation in tw o dimensional electrophoresis(22DE).Three routine cellular total protein extraction methods were com pared in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF27.The cultured MCF27cells were lysed by M2PER kit,standard lysis buffer or im proved lysis buffer,respectively.Then the extracted total proteins were subjected to22DE,and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel.Data showed that use of M2PER kit gave the lowest res olution,in which m ost proteins were distributed in the pI ranging from417to613with m olecular weight between15kD and70kD.Standard lysis bu ffer im proved protein res olution with broader protein distribution pattern.Im proved lysis bu ffer generated the best res olution am ong these three methods,especially for the high2abundance and high m olecular weight proteins.Based on above results,we concluded that the im proved lysis bu ffer has the best protein s olubilization ability,which renders it much m ore suitable for cellular protein extraction from MCF27,and is m ore com patible with the conditions of22DE. K ey w ords protein extraction,tw o dimensional electrophoresis,MCF27,optimization 收稿日期:2004212203,接收日期:2005203221 国家自然科学基金项目(N o.50137030,30170792),浙江省自然科学基金项目(N o.301524)和浙江省卫生厅重点项目(N o.2004Z D006)资助 3联系人 T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.360docs.net/doc/d213621250.html, Received:December3,2004;Accepted:M arch21,2005 Supported by National Natural Science F oundation of China(N o.50137030,30170792),and Natural Science F oundation of Zhejiang Province(N o.301524),and K ey Program of Health Bureau of Zhejiang Province(N o.2004Z D006) 3C orresponding author T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.360docs.net/doc/d213621250.html,
植物同工酶凝胶电泳实验
高级植物生理实验报告 2014 年12 月28 日
植物同工酶凝胶电泳实验 一、实验目的和意义 同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。从作用上看，分子形式不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起源，生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具；此外，同工酶还与植物抗性有一定联系，可用来鉴定抗性的强弱。 本实验的实验目的主要是让学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物同工酶的原理及方法、步骤。提高学生的实际操作及动手能力。培养学生对实验结果的分析能力。 二、实验原理 带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。不同组分的蛋白质（包括同工酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷多寡不同，在电场中的运动速度也不同。因此经过电泳便会分成不同的区带。然后用适当的染料着色，这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法。它是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。 三、材料 不同品种的燕麦
单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用
陕西师范大学 硕士学位论文 单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用 姓名：罗明志 申请学位级别：硕士 专业：动物学 指导教师：齐浩 20050501
单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用 罗明志 摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。 我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。 为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。 我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。 我们用单细胞凝胶电泳方法对磁场和抗癌药物对人自血病细胞Ｋ５６２以及小鼠原代肝细胞的ＤＮＡ损伤进行了检测。结果发现，Ｋ５６２细胞在９ｍＴ稳恒磁场中处理１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，这一损伤随处理时间的延长而增加，具有时间依赖效应；同样条件下对原代肝细胞的处理以及更长时间的处理（３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ）均未发现细胞的ＤＮＡ损伤。在使用较低浓度紫杉醇（５０ｎｇ／ｍＬ）处理Ｋ５６２细胞１２ｈ后，即可导致细胞ＤＮＡ损伤，并表现出时间依赖效应，而仅在高浓度长时阳Ｊ的紫杉醇（８００ｎｇ／ｍＬ，２４ｈ）处理下才会引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。８００９９／ｍＬ环磷酰胺处理Ｋ５６２细胞１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，而在１２００９９／ｍＬ时方才引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。 关键词：单细胞凝胶电泳；ＤＮＡ损伤：ＵＶ；细胞培养；磁场；抗癌药物
凝胶电泳实验报告模板
凝胶电泳实验报告模板
降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲，D N A 和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子( Polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 我最近做彗星实验，总是解决不了脱胶问题，要么是铺第二三层胶的时候第一层胶就松动，要么侥幸没动，在裂解、解旋、电泳、中和过程中都会出现胶脱落的现象，我愁死了，不知道是什么原因？我的步骤这样，请帮我分析分析好吗？ 1.5%正常熔点琼脂糖120微升乘热滴于磨砂载玻片上，盖玻片，4度20分钟，0.8%低熔点琼脂糖和 细胞混合液80微升，0.8%低熔点琼脂糖80微升铺第二、三层胶，裂解液和电泳液中和液都按配方来
凝胶电泳实验原理与步骤
一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。 附： ⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)： Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制： 0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染
实验十 同工酶分析
实验四同工酶分析 同工酶概述 酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。它们对底物的浓度、pH、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme）。 同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。可以进行同工酶分析的酶已有100多种。不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。 从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因： （一）亚单位结构学说亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为透彻的学说之一。该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。这个 学说有广泛的实验证据。如已经证明乳酸脱氢酶（LDH）是由A、B两个亚基， 按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH1（A4）、LDH2（A3B1）、 LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。 （二）不同基因编码由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个别氨基酸残基不同的多肽链。因而产生同工酶。由不同基因引起的同工酶存在于 同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族 中。 （三）单一亚单位聚合程度不同有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同工酶。经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体 （26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。 （四）多肽链的续发变化多肽链合成后的续发变化与遗传因素无关。续发变化如果只改变部分分子的非活性中心局部结构、组成或对部分分子影响程度不一，都回产 生不同的同工酶。常见的续发改变有脱氨基作用、甲酰或乙酰化作用、巯基氧化、 磷酸基团相加、部分肽段脱落、多糖或辅酶的增减。 （五）酶空间构象的差异组成、结构相同但空间构象不同的酶分子，其暴露在分子外表的残基不同，会导致其理化性质上的差异，从而形成不同的同工酶。 从以上关于同工酶形成的来看，除了续发改变形成的次生同工酶外，可以说同工酶的差异都是由它们的基因决定的。因此同工酶作为基因表现的标记是可靠的。 同工酶多型性研究、原级和次级同工酶的鉴别、同工酶结构与功能关系的研究等，必须将不同的同工酶分子分离，区带电泳是分离同工酶的最佳方法之一，等电聚焦电泳可将一级结构相同而空间构象不同的同工酶分子分离开来，进而拓宽了该技术的使用范围。通过电泳分离出来的同工酶带，再采用酶组织化学技术染色形成酶谱即可进行分析鉴定。显色的主要方法有以下几种： （一）呈色法直接利用酶作用于底物产生有色产物。如以无色的磷酸酚酞作为底物，经酸性磷酸脂酶催化水解脱出酚酞，反应系统再改为碱性条件，酚酞即呈红色，直接标出同工酶带。同理，用兰色淀粉可测定淀粉同工酶谱，用联苯胺可测定过氧化物酶同工酶酶谱。 （二）化学反应显色法采用不同的化学试剂使酶促反应的产物或尚未分解的底物显