细胞工程学考试问答题

一、细胞融合的方法以及有哪些区别和特点？

1.病毒介导的细胞融合：优点是对细胞毒性较小，融合细胞易于存活；缺点为使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。

2.化学介导的细胞融合：优点是操作简便、快速省时且融合效果好；缺点为PEG对细胞有毒性，处理不好则会直接影响融合细胞的存活率。

3.电激法：优点是对细胞无毒性，且操作简单；缺点为它除需要电融合仪外，还要求实验人员接受一定的技术训练。二、动物细胞培养的方法有哪些，与植物有何不同？

途径：

一、半连续式培养

半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜

的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。

二、连续式培养

连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。

连续培养的优点是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。在稳定状态下细胞所处的环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可维持不变。细胞很少受到培养环境变化带来的生

理影响，特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺，维持在一个较低的水平，从而使他们的利用效率提高，有害产物积累有所减少。然而在高的稀释率下，虽然死细胞和细胞碎片及时清除，细胞活性高最终细胞密度得到提高；可是产物却不断在稀释，因而产物浓度并为提高；尤其是细胞和产物不断的稀释，营养物质利用率、细胞增长速率和产物生产速率低下。

三、灌流式培养

灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。灌流式培养常使用的生物反应器主要有两种形式。一种是用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。中空纤维生物反应器是连续灌流操作常用的一种。它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物，在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克

隆抗体。另外一种形式是固定床或流化床生物反应器，固定床是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。流化床生物反应器是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应，适合于固定化细胞的培养。

四、细胞工厂培养

细胞工厂（cell factory）是一种设计精巧的细胞培养装置。它在有限的空间内利用了最大限度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间,并可节省贵重的培养液。更重要的是，它可有效地保证操作的无菌性，从而避免因污染而带来的原料、劳务和时间损失。它是对传统转瓶培养的革命。丹麦NUNC公司生产的NUNC细胞工厂是目前应用较多的细胞工厂系统。可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长的动力学条件，可提供1，2，10和40盘的规格使放大变得简单易行，低污染风险，节省空间，培养表面经测试保证最有利于细胞贴附和生长。同时，与NUNC的细胞工厂操作仪结合使用，可全面实现细胞培养的自动化，从而大大地减低劳动强度和密集度。这

套系统使用很方便，可产生类似塑料培养瓶的效果。由组织培养级聚笨乙烯制成，使用后可随意处理。其最大缺点是：经胰酶消化后，很难将细胞完全洗出。异同：

1.植物组织培养的原理是细胞的全能性。固体培养基，成分主要是矿质元素、蔗糖、纤维素、植物激素、有机添加剂。结果是获得新个体或细胞产品。应用与快速繁殖试管苗；细胞产品；人工种子；转基因植物的培育。

2.动物细胞培养的原理是细胞的增殖。液体培养基，成分主要是葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清。结果是大量新生细胞或细胞产品。应用是获得心包的产物或细胞等。植物组织离体后，放在含有植物激素的培养基中培养，脱分化产生愈伤组织，再分化形成胚状体，成植物幼苗；动物组织离体后，需用胰蛋白酶处理成单个细胞，再放入到含5%二氧化碳的密闭环境中，同时培养基中需要加动物血清

三、什么是褐变，植物组织培养过程有哪些方法可以防止褐变？

褐变：酶促褐变是果蔬中的多酚类物质在多酚氧化酶的作用下被氧化形成醌及其聚合物的反应过程。一般认为，果蔬的酶促褐变主要是由于果蔬中富含的多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，简称PPO）催化酚类物质的氧化反

应引起的。PPO 能催化果蔬中游离酚酸的羟基化反应以及羟基酚到醌的脱氢反应，醌在果蔬体内自身缩合或与细胞内的蛋白质反应，产生褐色色素或黑色素。在果蔬体内，PPO 主要存在于完整的细胞质体和微体中，而PPO 的底物主要存在于液泡中，处于潜伏状态，在完整的细胞中作为呼吸传递物质，在酚-醌之间保持着动态平衡，不发生酶促褐变。当新鲜的果蔬在加工过程中组织被损伤，氧大量侵入，酶原被激活，酚类物质经酶的催化作用氧化为醌类物质，从而引起褐变反应.

防止措施：

a.选择适当的外植体成年植株比实生幼苗褐变的程度严重，夏季材料比冬季及早春和秋季的材料褐变的程度强。而冬季的芽进入深休眠状态，不太容易生长，所以最好选用早春和秋天的材料作为外植体。取材时还应注意外植体的基因型及部位，选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。

b.对外植体进行预处理空白琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。再转移培养基2-3次，切口愈合后，褐变减轻。

c.选择适宜的培养基与培养条件设置不同试验，进行选择。

d.添加褐变抑制剂与吸附剂有机酸\抗坏血酸、半胱氨酸\柠檬酸、苹果酸和α-酮戊二酸\水解乳蛋白、植酸（PA）\SO2和亚硫酸盐\、脂肪氧化酶、抗坏血酸氧化酶\硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、2-巯基苯并噻唑、氯化钠等也是PPO 的抑制剂。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚类物质的专一性吸附剂，活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，，能吸附各种微量物质和微小颗粒，

e.进行细胞筛选和多次转移进行细胞筛选，剔除易褐变的细胞。外植体接种后1~2天立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的不同部位，这样能减轻醌类物质对培养物的毒害作用，连续转移5~6次可基本解决外植体的褐变问题。

四、动物体外细胞培养的类型

各粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。粘附:是大多数有机体细胞在体内

生存和生长发育的基本存在方式含义两方面。结果基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长。

培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。

粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞。

悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，

只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。

上皮样细胞型：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性肿瘤。形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核。生长易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。

成纤维细胞样细胞：来源由中胚层间充质组织起源的组织。如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮。形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核。生长特点：排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。

五、细胞系建立的步骤

各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。因此凡符合上述情况的细胞群也可给

以相应的名称，即文献中常称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品。当前世界上已建的各种细胞系（株）已难胜数，我国也建有百种以上，并在不断增长中。体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系(Lineage of Cells）所组成。2、细胞株(Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，

而改称为细胞系。

（二）细胞系

初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用!°恶性转化细胞系!±一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。

六、名词解释

1.胚胎分割：胚胎分割是通过对胚胎进行显微操作，人工制造同卵双生或同卵多生的技术，它是扩大胚胎来源的一条重要途径，其理论依据是早期胚胎的每一个卵裂球都具有独立发育成个体的全能性。

2.细胞重组：由不同细胞的细胞核与细胞质在融合因子介导下并合形成完整细胞的技术叫细胞重组。这种细胞叫重组细胞。

3.细胞融合：是指人工的或自然发生的细胞合并形成多核细胞的现象。通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交

4.原代培养：原代培养也称初代培养，严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养的细胞叫做细胞株。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。

5.悬浮培养：非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。细胞

悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以了。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。

6.人工种子：人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。目前研制的人工种子，是由胚状体、作为保护性外壳的人工种皮和提供发育所需营养的人工胚乳三部分组成的。

7.胚胎嵌合：将两枚胚胎细胞(同种或异种动物胚胎)融合共同发育成为一个胚胎为嵌合胚胎。将该胚胎移植给受体，妊娠产仔，如该仔畜具有以上两种动物胚胎的细胞称之为嵌合体动物。

8.生物反应器：生物反应器是利用生物催化剂为细胞培养（或发酵）或酶反应提供良好的反应环境的设备，通常称为发酵罐或酶反应器。用于污水生物处理的曝气池或厌气消化罐也可作为生物反应器的一类。生物反应器是生物反应过程中的关键设备，它的结构、操作方式和操作条件对生物技术产品的质量、转化率和能耗有着密切关系。

七、组织培养和细胞培养过程会发生的问题和原因

植物的组织培养：在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。

细胞培养：在体外条件下，用培养液维持细胞生长与增值的技术。

区别是侧重点不同，组织培养是把细胞或组织培养成完整个体。细胞培养是使细胞增值，以获得细胞代谢产物。动物细胞培养基与植物组织培养基所需的化学组分不同。

八、胚胎工程的工作重点和工作中的瓶颈

（一）胚胎工程的概念

胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。（二）精子和卵子的发生

1、精子的发生（分三个阶段）

（1）第一阶段：精原细胞胚胎工程

（2）第二阶段：初级精母细胞胚胎工程

（3）第三阶段：精子细胞胚胎工程

2、卵子的发生

（1）卵原细胞胚胎工程

（2）初级卵母细胞胚胎工程

（3）次级卵母细胞胚胎工程

（三）受精

1、精子获能：

刚刚排出的精子，不能立即与卵子受精，必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力，这一生理现象称为精子获能。

2、卵子的准备：

卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程，需要在输卵管内进一步成熟，当达到减数第二次分裂的中期时，才具备与精子受精的能力。

3、受精过程

（四）早期胚胎发育

1、桑椹胚

（1）概念：当胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹，叫桑椹胚。

（2）特点：桑椹胚前的每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞。

2、囊胚

（1）概念：随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部出现了含有液体的囊腔——囊胚腔，这个时期的胚胎叫做囊胚。

（2）特点：内细胞团（聚集在胚胎一端，个体较大）将发育成胎儿的各种组织。

滋养层细胞（沿透明带内壁扩展排列，个体较小）将发育成胎膜、胎盘。3、原肠胚

囊胚孵化后，再进一步发育，内细胞团表层的细胞形成外胚层，下方的细胞形成内胚层。这时的胚胎称为原肠胚。由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。

（五）体外受精

1、卵母细胞的采集和培养

采集的主要方法是用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后从输卵管中冲取卵子。采集的卵母细胞应在体外人工模拟输卵管环境进行培养，才能使其成熟，达到受精前的成熟阶段。

2、精子的采集和获能

收集精子的方法有假阴道法、手握法和电刺激法等。

精子获能方法：

①培养法：在人工配制的获能液中培养一段时间。

②化学诱导法：将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能。3、受精精子和卵子一般要放在培养液小滴内共同培养一段时间才能完成受精。

（六）胚胎的早期培养

1、胚胎早期培养的目的

检查受精状况和受精卵的发育能力。

2、培养液成分

哺乳动物胚胎的培养液成分比较复杂，除一些无机盐和

有机盐类外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。

3、培养时期

不同动物胚胎移植的时间不同。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段才进行移植；小鼠和家兔等实验动物可在更早的阶段移植；人的体外受精胚胎，即试管胚胎，可在4个细胞阶段移植。

（七）胚胎移植

1、概念胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。

2、生理学基础

（1）哺乳动物发情排卵后，不管是否妊娠，在一段时间内，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。——为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。

（2）哺乳动物的早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态。——为胚胎的收集提供了可能。

（3）受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。——为胚胎在受体内的存活提供了可能。

（4）供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中不受任何影响。

3、基本程序对供、受体的选择和处理→配种或进行人工受精→对胚胎的收集、检查、培养或保存→对胚胎进行移植→移植后的检查。

思考：在胚胎移植操作中，怎样才能使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致？

应对供体和受体母畜进行同期发情处理，使它们的生理条件达到同步或一致，这样才能使供体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存条件，这是胚胎移植成功与否的关键。因此，必须做到供、受体母畜的发情时间一致。同进还要做到移入受体子宫胚胎的位置应该与其在供体内的位置相同或相似，移入胚胎一侧的受体子宫角对应的卵巢必须有黄体存在。

（八）胚胎分割

1、概念

胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

2、操作中的注意事项

（1）选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。（2）在盛有操作液的培养皿中进行分割。

（3）对囊胚进行分割时，要将内细胞团均等分割。

（九）胚胎干细胞

1、概念

哺乳动物的胚胎干细胞是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。

2、特点——具有胚胎细胞的特性

（1）在形态上，表现为体积小、细胞核大、核仁明显。

（2）在功能上，具有发育的全能性，即可以分化为成年动物体内任何一种组织细胞。

（3）在体外培养的条件下，它可以增殖而不发生分化。

（4）对它可以进行冷冻保存，也可进行遗传改造。

3、应用

（1）用于治疗人类的某些顽症。

（2）可以通过诱导分化培育出人造组织器官。

（3）是研究体外细胞分化的理想材料。

（4）可用于对哺乳动物个体发生和发育规律的研究。

胚胎的收集

对配种或授精后的供体母畜，经过一段时间就要进行胚胎的收集。其具体操作方法是用配制好的冲卵液，借助特制的冲卵装置，把位于子宫或输卵管的胚胎冲洗出来，也称冲卵。之后，再进行胚胎质量检查。冲胚胎的时间一般在配种或授精后3～8天进行，这时的胚胎已发育到4～8个细胞以上。

冲卵的方法分为手术法和非手术法两种，胚胎移植技术应用的早期多采用手术法冲卵，目前对于牛、马等大家畜多采用非手术法，而小家畜或实验动物仍然使用手术法。手术法冲卵需按外科手术的要求，在腹部适当部位切口，并迅速找到输卵管和子宫，引出体外。一般用注射器吸取冲卵液，自输卵管的腹腔开口或子宫角注入冲卵液，而从对应的另一端（子宫角或输卵管）插入一条塑料管引出含有胚胎的冲卵液，两侧子宫角要分别冲洗。冲卵确切的部位要根据家畜的