在单一提取系统中同时测定五种植物抗氧化酶
在单一提取系统中同时测定五种植物抗氧化酶
Ξ
李忠光1, 李江鸿2, 杜朝昆1, 黄号栋1, 龚 明1
(1.云南师范大学生命科学学院,云南昆明650092;2.思茅高等师范专科学校,云南思茅665000)
摘 要: 文章介绍了在一个单一酶提取系统中同时提取并测定五种抗氧化酶。通过对酶测定反应的动力学分析,确定了各个酶测定的适宜参数。这一提取和测定系统使多种抗氧化酶的提取变得简便快速,并使酶活性测定结果有较好的准确性、重复性和可比性。关 键 词: 单一提取系统;抗氧化酶系统;动力学曲线;酶活性
中图分类号: 946.5 文献标识码: A 文章编号: 1007-9793(2002)06-44-05
植物细胞在其生命活动过程中,由于叶绿体、线粒体和质膜上每时每刻发生的电子传递过程中的电子泄漏,而不可避免地总会产生大量的活性氧。活性氧会导致生物大分子及膜系统的过氧化反应而损伤细胞。但植物细胞具有由多种抗氧化剂分子及抗氧化酶所组成的抗氧化系统,从而将活性氧控制在细胞可忍耐的水平[1-4]
。植物抗氧化酶系统有一系列的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD )、过氧化氢酶(CA T )、抗坏血酸专一性过氧化物酶(APX )、愈创木酚过氧化物酶(GPX )、谷胱甘肽还原酶(GR )等组成[1-4]。通过各抗氧化酶的协同作用,可把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如O 2?-、H 2O 2、OH .等直接或间接地清除,防止了活性氧的级联放大作用,阻止和延缓了细胞膜系统的脂质过氧化作用及生物大分子如蛋白质和核酸的氧化损伤,保障了细胞内各种生命代谢活动的正常进行。因此,抗氧化酶系统在植物生命活动中起着举足轻重的作用。
但是,目前在国内外的研究文献中,不同的抗氧化酶有不同的提取和测定系统,显得纷繁复杂。而由于各抗氧化酶在清除活性氧时的协同作用,所以在研究中常需同时测定多种抗氧化酶,如果使用不同的酶提取系统,将使酶提取工作量加大而难以进行。此外,目前国内外有关抗氧化酶测
定的文献中绝大部分均未给出酶促反应的动力学变化情况。而酶促反应动力学的分析关系到酶活性的准确测定。在不同的反应时间内,酶促反应的速度不同,如果不同研究者采用的反应时间不同,所测得的酶活性大小也不一样。为了使抗氧化酶活性测定在一定程度上得到简化和统一,本文对五种抗氧化酶的提取系统和测定过程作了修改和完善,用单一提取系统来提取五种抗氧化酶,通过酶促反应的动力学分析,确定了五种抗氧化酶测定的适宜参数,使抗氧化酶的提取和测定比以前更加快速简便,而所得的测定结果有更好的准确性、重复性与可比性。
材料和方法
1植物材料的培养和处理
玉米种子(品种大黄)用0.1%HgCl 2消毒10min ,蒸馏水洗净后于26.5℃下吸涨12h ,然后转
入垫有6层湿润滤纸的白磁盘中,26.5℃下暗萌发60h 。选取长势一致的玉米幼苗转入150ml 0.1mmol/L H 2O 2溶液中或蒸馏水中(对照),处理4h 后再转入垫有6层湿润滤纸的白磁盘中恢复6h ,取中胚轴作下列酶分析。
第22卷第6期2002年11月 云南师范大学学报Journal of Yunnan Normal University Vol.22No.6Nov.2002
Ξ收稿日期:2002-05-09
0基金项目:国家自然科学基金、云南省自然科学基金及教育部优秀高校青年教师教学科研奖计划资助 作者简介:李忠光(1971-)男,云南省永德县人,实验师,主要研究方向为植物逆境生物学. 通讯作者:龚 明(Email :gongming @https://www.360docs.net/doc/d511572374.html, )
2五种抗氧化酶的提取系统
在前人研究的基础上[5],我们对五种抗氧化酶的提取系统作了修改,得到下列的单一提取系统:50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.0,内含20%甘油,1mmol/L ED TA,1mmol/L ASA(抗坏血酸),1mmol/L D TT(二硫苏糖醇),1mmol/ L GSH(还原型谷胱甘肽),5mmol/L MgCl2。准确称取经上述处理的黄化玉米幼苗中胚轴(长约0.5cm)0.5g,加入预冷的提取液3ml和少许石英砂,充分冰浴研磨后,转入离心管中,再用2ml 提取液洗研钵,合并提取液并于4℃下20000×g 离心20min,将上清液分装,液氮冷冻后于-85℃保存或直接进行酶活性分析。
3酶活性的测定
3.1愈创木酚过氧化物酶(GPX,EC1.11.1.7)的测定。按照Chance和Maehly[6]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.0,内含0.1mmol/L ED TA,10mmol/ L愈创木酚,5mmol/L H2O2。测定时,反应混合液先在25℃水浴中预热。取反应混合液2.950 ml,立即加入酶液50μl以启动反应,终体积为3 ml,每隔30秒读出OD470的增加值。取0.5—3. 5min时间段,即3min反应时间来计算酶活性。
3.2过氧化氢酶(CA T,EC1.11.1.6)的测定。按照Aebi[7]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.0,内含0.1 mmol/L ED TA。测定时,反应混合液和750 mmol/L H2O2预先在25℃水浴中预热。取反应混合液2.900ml,加入酶液50μl,封口并于25℃下水浴中预热5min,到时加入750mmol/L H2O2 50μl(终浓度为12.5mmol/L)以启动反应,终体积为3ml,每隔30秒读出OD240的减少值。取0. 5—3.5min时间段,即3min反应时间来计算酶活性。
3.3超氧化物歧化酶(SOD,EC1.15.11)的测定。按照G iannopolitis和Ries[8]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液, p H7.8,内含0.1mmol/L ED TA,0.1mmol/L NB T,13.37mmol/L蛋氨酸。测定时,反应混合液和0.1mmol/L核黄素溶液(用内含0.1mmol/ L ED TA的p H为7.8的50mmol/L Tris-HCl 缓冲液配制)预先于25℃水浴中预热。取反应混合液2.85ml(最大光还原管为2.90ml,不加酶液),加入酶液50μl,再加入核黄素溶液100μl,终体积为3ml,25℃下距离120瓦(30瓦/管)日光灯7cm(光强约1500lux)进行光化还原反应40min,到时用黑布蒙住,在无灯光照射的室内快速测定OD560。
NB T光化还原抑制曲线按照下列方法进行,取反应液2.900ml、2.900ml、2.895ml、2.890ml、2. 880ml、2.870ml、2.860ml、2.850ml、2.840ml、2.820ml、2.800ml、2.750ml、2.700ml,分别加入酶液0μl、0μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl 、50μl、60μl、80μl、100μl、150μl、200μl和核黄素溶液100μl,终体积为3ml,用上述方法测定并作出NB T光化还原抑制曲线。
3.4抗坏血酸专一性过氧化物酶(APX,EC1.11.
1.7)的测定。按照Nakano和Asada[9]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.0,内含0.1mmol/L ED TA,0. 1mmol/L H2O2。测定时,反应混合液和30 mmol/L ASA预先在25℃水浴中预热。取反应混合液
2.900ml,加入酶液50μl,摇匀并调零,封口并于25℃下水浴中预热5min,到时加入30 mmol/L ASA50μl(终浓度为0.5mmol/L)以启动反应,终体积为3ml,每隔10秒读出OD290的减少值。取0—60秒时间段,即50秒反应时间来计算酶活性。
3.5谷胱甘肽还原酶(GR,EC1.6.
4.2)活性的测定。按照Halliwell和Foyer[10]的方法,并作如下修改:反应混合液为50mmol/L Tris-HCl缓冲液,p H7.5,内含0.1mmol/L ED TA,5mmol/L MgCl2。测定时,反应混合液、10mmol/L NADPH2和10mmol/L GSSG预先于25℃水浴中预热。取反应混合液780μl,加入酶液150μl、10mmol/L NADPH220μl(终浓度为0.2mmol/ L)及10mmol/L GSSG50μl(终浓度为0.5 mmol/L)以启动反应,终体积为1ml,每隔30秒读出OD340的减少值。取0.5—3.5min时间段,即3min反应时间来计算酶活性。
结果与讨论
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第6期 李忠光等: 在单一提取系统中同时测定五种植物抗氧化酶
GPX 以邻甲氧基苯酚(愈创木酚)为底物,以H 2O 2为电子受体而催化其氧化,形成红棕色的4-邻甲氧基苯酚和水,前者在470nm 处有最大
光吸收。故在GPX 的测定中,每隔30秒读出OD 470的增加值,共测定5min ,得到GPX 反应的
动力学曲线(图1GPX )。从图中可以看出,在0—4.0min 内,酶促反应呈典型的线性关系。为
读取数值的方便与稳定性,我们取0.5—3.5min 时间段,即3min ,作为酶促反应时间来计算酶活性
。
图1 在25℃下GPX 和CA T 酶促反应的动力学曲线以及NB T 的光化还原与抑制曲线Fig.1 K inetic curve of GPX and CA T catalytic reaction and kinetic curve of photoreduction and SOD inhibition of NB T at 25℃
H 2O 2在240nm 处有最大光吸收,在CA T 的作用下,H 2O 2被分解为水和氧。因此在CA T 的测定中,每隔30秒读出OD 240的减少值,共测定5min ,得到CA T 反应的动力学曲线(图1CA T )。从图中可以看出,在0—4.0min 内,酶促反应呈较好的线性关系。为读取数值的方便与稳定性,我们取0.5—3.5min ,即3min ,作为酶促反应时间来计算酶活性。
核黄素在有氧和光照条件下释放出超氧阴离子(O 2?-),它可以促使氯化硝基四氮唑蓝(NB T )还原为兰紫色的甲腙,该物质的最大光吸收为560nm 。SOD 可以清除核黄素光氧化过程中产
生的O 2?-,从而使NB T 的光化还原得到了抑制,故以NB T 的光化还原被抑制50%所需要的酶量为一个酶活力单位(U ),以此来表示SOD 活性的大小。图1NB T1表示了NB T 光化还原的动力学
变化。从图中可以看出,在0—40min 内,NB T 光化还原反应呈很好的线性关系,可用于进行酶活性测定。另外,以不同体积的酶液来抑制NB T 的光化还原,得到了SOD 对NB T 光化还原的抑制曲线(图1NB T2)。从抑制曲线可以看出,当NB T 的光化还原的抑制率在20%到65%左右有
较好的线性关系。所以在SOD 的测定中,应根据酶活性的大小调整酶液的用量,使抑制率在20%到65%范围之内。
GR 以GSSG 为底物,以NADPH 2为氢供体,
把GSSG 还原为GSH 。由于NADPH 2的最大光吸收为340nm ,故可用NADPH 2被氧化过程中OD 340的减少来表示GR 活性的大小。在GR 的
测定中,每隔30秒测定OD 340的减少值,共测定5min ,得到了GR 反应的动力学曲线(图2GR )。从图中可以看出,在0—3.5min 内,GR 酶促反应呈
?64?云南师范大学学报(自然科学版) 第22卷
较好的线性关系。为读取数值的方便与稳定性,我们取0.5—3.5min 的反应时间来计算酶活
性
。
图2 在25℃下GR 和CA T 酶促反应的动力学曲线
Fig.2 K inetic curve of GR and CA T catalytic reaction at 25℃
ASA 的最大光吸收为290nm 。APX 以H 2O 2为
电子受体,使ASA 转变为MDHA ,从而使OD 290减少,所以OD 290的减少可以相应地表示APX 活性的大小。在APX 的测定中,每隔10秒测定OD 290的减少值,共测定100秒,得到APX 反应的动力学曲线(图2APX )。从图中可以看出,在0—60秒内,APX 酶促反应呈良好的线性关系。为读取数值的方便与稳定性,我们取10—60秒计算酶活性。
H 2O 2可作为植物的一个胞内氧化胁迫信号,
启动多种抗氧化酶基因表达而提高抗氧化酶活
力[1-4,11]。为检验我们这一提取和测定系统的有效性,我们检测了玉米幼苗在H 2O 2预处理后5种抗氧化酶活性的变化。从表1可以看出,H 2O 2预处理后,5种抗氧化酶活性都比没有处理(对照)的高,GPX 、CA T 、SOD 、APX 和GR 的活性分别高出了5%、14%、19%、18.5%和27%。
综上所述,使用单一的酶提取系统不仅能使多种抗氧化酶的提取变得简便快速,而且通过对酶反应的动力学分析,使酶测定过程中的多项参数得到了相对固定,使酶活性测定结果有较好的准确性、重复性和可比性。
表1 H 2O 2预处理后玉米幼苗五种抗氧化酶活性的变化
Tab.1 E ffect of H 2O 2pretreatment on five antioxidant enzyme activities in maize seedlings
抗氧化酶活性
+H 2O 2-H 2O 2GPX (
μmol guaiacol/min/g FW ) 4.1±0.2 3.90±0.1CA T (
μmol H2O2/min/g FW )280.6±4.3246±5.0SOD (Units/g FW )
488.4±10.0410.5±8.0APX (
μmol ASA/min/g FW )32.6±1.527.5±1.0GR (
μmol NADPH 2/min/g FW ) 1.40±0.05
1.10±0.10
参 考 文 献:
[1] 刘家忠,龚明.植物抗氧化系统研究进展[J ].云南师范大学学报(自然科学版)1999,19(6):1-11.
[2] Breusegem FV et al.The role of active oxygen species in plant transduction[J ].Plant Sci ,2001,161:405-414.
?
74?第6期 李忠光等: 在单一提取系统中同时测定五种植物抗氧化酶
[3] Alscher R G ,Donahue JL ,Cramer CL.Reactive oxygen species and antioxidants :Relationshi p in green cells[J ].Physiol
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[4] Mallick N ,Mohn FH.Reactive oxygen species :response of algal cells[J ].J Plant Physiol ,2000,157:183-193.[5] Knorzer OC ,Durner J ,Boger P.Alterations in the antioxidative systerm of sus pension -cultured soyb -ean cells
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Simultaneous measurement of f ive antioxidant enzyme activities using a single extraction system
LI Zhong 2guang 1, LI Jiang 2hong 2, DU Chao 2kun 1, H UANG Hao 2dong 1, G ONG Ming 1
(1.School of Life Science ,Yunnan Normal University ,Kunming 650092;2.Simao Teachers college ,Simao 665000)
ABSTRACT This paper introduced a single enzyme extraction system which could extract and assay five antioxidant enzymes simultaneously.Through analysis of enzymological kinetics ,the suitable parameters were selected for the measurement of these five antioxidant enzymes.This system made the extraction of these enzymes quick and easy ,and enhanced the accuracy ,reproducibility and comparability for the enzyme measurement.
KE Y WOR DS single extraction system ;antioxidant enzymes ;kinetics curve ;enzyme activities
?84?云南师范大学学报(自然科学版) 第22卷
植物提取物抗氧化成分及研究进展
植物提取物抗氧化原理及成分研究 抗氧化是抗氧化自由基的简称。因为人体常与外界接触，平时的呼吸、外界污染、放射线照射等因素会导致人体内产生自由基，过量的自由基会导致人体癌症、衰老和其它疾病，而抗氧化自由基（以下简称“抗氧化”）可以有效克服这些危害。因此，抗氧化已成为保健品和化妆品市场的主要研究课题之一。 本文从多种类植物提取物抗氧化成分及其原理出发，阐述了各界近年来利用植物对抗自由基的研究进展。 一、植物提取物抗氧化原理 不同的植物提取的有效成分不尽相同，同样，抗氧化作用的植物提取物也有很多不同成分，其作用机理也有所区别，西安源森生物从以下几方面进行了总结阐述： （一）作用于与自由基有关的酶 与自由基有关的酶类分为氧化酶与抗氧化酶两类，植物提取物的抗氧化作用体现在抑制相关氧化酶的活性和增强抗氧化酶活性两方面。 1. 抑制氧化酶的活性 生物体内许多氧化酶，如P-450 酶、黄嘌呤氧化酶(XOD)、脂氧化酶、髓过氧化酶(MPO)和环氧酶等，与自由基的生成有关，能诱发大量的自由基。 另外，诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)在缺血再灌注时活性增加，产生大量NO而导致氧化损伤。 研究表明，许多植物提取物对上述各种氧化酶有抑制作用，从源头抑制自由基生成。黄酮类化合物中的槲皮素、姜黄素在缺血再灌注损伤时可抑制iNOS 的活性，从而起到抗氧化作用；绞股蓝皂苷可以降低异常增高的XOD 和MPO 的活性，改善糖尿病大鼠肾脏的氧化应激，延缓肾脏损害的进展。 2. 增强抗氧化酶活性 机体存在具有防护、清除和修复过量自由基伤害的抗氧化酶类，如过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶等。SOD 是体内超氧阴离子的主要清除者，将其催化分解为H2O2，但H2O2也具有氧化损伤作用，CAT 将其转化为O2和H2O。同时H2O2也可通过GSH-Px 的催化和还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成H2O，同时生成氧化型谷胱甘肽。 许多研究表明，植物提取抗氧化成分不仅能防护体内抗氧化酶，还能增强机体内抗氧化酶活性，如黄酮类中的槲皮素能减少胰岛β细胞的氧化损伤，同时还能恢复Fe2+致肾细胞损伤动物的SOD、GSH-Px 和CAT 的活力；皂苷类物质对氧自由基本身影响较少，但大多能提高体内SOD、CAT 等抗氧化酶的活性，从而增强机体抗氧化系统功能。 此外，一些天然物质可在基因与转录水平上诱导体内抗氧化酶如SOD 的表达，发挥其抗氧化作用。 （二）抗氧化成分之间互补和协同作用 植物提取物抗氧化成分之间存在相互补充、相互协调的关系，在体内通过电子和/ 或质子转移、作用于氧化酶和抗氧化酶、螯合钝化过渡金属离子、影响基因表达等途径联合发挥抗氧化作用。 研究发现不同浓度的茶多酚和西洋参之间均存在明显的协同增效作用，并且随着浓度上升，协同增效作用也相应增强。VE 和VC对鹰嘴豆抗氧化多肽的还原能力有显著的增效作用，且VC与鹰嘴豆抗氧化多肽的协同作用较VE更强，所有的协同作用随添加量和作用时间的增加而增强。 （三）直接清除或抑制自由基 植物提取物能够作为氢质子或电子的供给体，直接猝灭或抑制自由基，终止自由基的连
植物芳香油的提取_教案
课题1 植物芳香油的提取 ★课题目标 （一）知识与技能 1、设计简易的实验装置来提取植物芳香油 2、了解提取植物芳香油的基本原理 （二）过程与方法 初步学会用水蒸汽蒸馏法和压榨法提取植物芳香油 （三）情感、态度与价值观 形成严谨、科学、求实的态度和精神 ★课题重难点 植物芳香油的提取技术；针对原料的不同特点，采取不同的提取方法 ★教学方法 启发式教学 ★教学工具 多媒体课件 ★教学过程 （一）引入新课 在生物组织中，不但含有蛋白质和DNA ，而且含有很多人们需要的有效成分，如食用油、芳香油、植物色素、药物成分等。从这节课开始，我们学习植物有效成分的提取。 （二）进行新课 1．基础知识 1．1 1．2芳香油的性质：挥发性强（物理性质），以萜类化合物及其衍生物为主（化学本质）。 1．3芳香油的提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。 （1）水蒸气蒸馏法 原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。 适用范围：易挥发、不溶于水、化学性质稳定的植物成分，如：玫瑰油、薄荷油等。 方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。 水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。 水汽蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。 优点：简单易行，便于分离 不足：有些原料不适宜于水蒸气蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。 （2）压榨法 原理：通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油。 适用范围：适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取。 优点：生产成本低，以保持原料原来的结构和功能。 不足：分离较为困难，出油率相对较低。 （3）萃取法 原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂蒸发后得到芳香油。 适用范围：挥发性强、易溶于有机溶剂的植物芳香油提取，要求原料尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中。 优点：易分离，出油率高。 不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质。 2．实验设计 2．1玫瑰精油的提取 （1）玫瑰精油性质：浅黄色至黄色，化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，能随水蒸气一同蒸馏 （2）实验流程： 鲜玫瑰花+清水→水蒸气蒸馏→油水混合物NaCl ????→加入分离油层24Na SO ??????→加入无水除水??? →过滤玫瑰油 ①采集玫瑰花：采集盛花期（5月中上旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。 ②装入蒸馏原料：称取50g 玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL 蒸馏水。
几种抗氧化酶的作用
一?超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶, 广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损塞，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD 的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜(Cu)锌(Zn)金属辅基的称(Cu.Zn—SOD),最为常见的一种酶，呈绿色， 主要存在于机体细胞浆中；第二种是含猛(Mn) 金属辅基的称(Mn—SOD),呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁(Fe)金属辅基的称(Fe-SOD),呈黄褐色, 存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶(SOD)能催化如下的反应：O2-+H+fH26+6,。2淋为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种,具有极强的氧化能力，是生物氧毒塞的重要因素之一°SOD 是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有蚩的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有蚩的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会 立即将其分解???专 为完全无蚩的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这
鸡蛋清中提取溶菌酶方法的研究
第7卷第3期大连民族学院学报V ol.7 No.3 2005年5月 JOURNAL OF DALIAN NATIONALITIES UNIVERSITY May 2005 鸡蛋清中提取溶菌酶方法的研究 大连民族学院生命科学学院2001级高威孙纯义 溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶. 因其对人体细胞没有毒性作用，故在医学、食品科学等领域广泛应用. 蛋清中溶菌酶的含量约2‰，但杂蛋白的含量很高，使得在制取高纯度溶菌酶时操作比较复杂，成本较高. 本文介绍的方法操作简便，成本低，收率高. 1 实验材料与方法 1.1 实验材料 实验原料：新鲜的鸡蛋清. 试剂：冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G-250、磷酸、95%乙醇（以上试剂均为国产分析纯级），CM Sepharose FF（Parmacia公司生产）. 仪器：TDL—50B低速台式大容量离心机、752紫外可见分光光度计、TA2104H电子天平、恒温水浴锅等. 1.2 实验方法[1] 取100mL纯净水，用醋酸调pH值为3.5，水浴加热到85℃. 加入50mL新鲜蛋清，搅拌加热5min.将所得液体3000r/min离心10min，收集上清液. 将上清液加入处理好的CM Sepharose FF层析柱中，控制流速在200mL/h 左右. 吸附完毕用纯净水冲洗吸附柱，以除去杂蛋白. 用100mL 0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱溶菌酶，流速200mL/h. 收集洗脱液，检测酶活力. 1.3 检测方法[2] 溶菌酶活力测定：将处理好的黄色小球菌用生理盐水稀释，使其在波长450nm处，吸光度在0.3~0.8之间. 用生理盐水做空白相，在比色皿中加入20μL洗脱液，然后加入3mL稀释好的菌液，于波长在λ450处，测量1min 内的吸光度下降值. 酶活力单位定义：每分钟引起ΔOD450下降0.001为一个酶活力单位. 溶菌酶活力=ΔOD450/0.001×W（W为加入溶菌酶质量）. 蛋白浓度的测定：采用考马斯亮蓝染色法. 以溶菌酶标准品为标准蛋白. 2 结果与分析 2.1 溶菌酶的提取及初步纯化 溶菌酶属于碱性蛋白酶，化学性质非常稳定，pH在3.0~7.0时其结构几乎不变，仍保持原酶活性. 在中性介质的条件下，溶菌酶能与鸡蛋清中其他蛋白质形成络合物，大大提高了其稳定性. 在这种情况下，溶菌酶的析出被抑制，但如果在该体系加入酸，降低体系pH值，就可破坏上述络合物的形成，使得溶菌酶与酸作用生成相应的盐，这样溶菌酶就可很好地被水提取. 同时，由于大多数的蛋白质分子的等电点都处在酸性或弱酸性范围内，所以也可去除部分杂蛋白，达到初步纯化的目的. 溶菌酶具有较好的热稳定性，当温度不是很高时，短时间的热处理，酶活力不会有明显的变化，而一般的杂蛋白分子会在较低的温度下变性沉淀. 将体系温度升高到85℃时，鸡蛋清中大量的其他蛋白质凝聚，而溶菌酶由于其耐热性较高则不会凝聚，仍在上清液中，这样也可以促进溶菌酶与其他蛋白质分开. 这样通过调节体系的pH值及温度，可达到从蛋清中较好地提取溶菌酶的目的. 2.2 用CM Sepharose FF高度纯化 CM Sepharose FF是弱酸性阳离子交换树脂，对溶菌酶有较高的吸附能力，与传统离子交换剂相比具有吸附速度快,能够快速洗脱的特点. 可使溶菌酶比活力由吸附前874U/mg上升到18 830U/mg，蛋白活力提高了22倍，且收率较高. 3 结论 查溶菌酶标准曲线可得洗脱液中溶菌酶的含量为1.05mg/mL，总得率为0.19%. 以黄色小球菌测定，酶活力为18 830U/mg. 所得酶活力与传统提取工艺相比纯度有较大的提高，同时具有操作简便、成本较低、收率较高、生产周期短等优点. 参考文献： [1] 张文会，王艳辉. 离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶[J]. 食品工业科 技，2003（6）24：57-59. [2] 林亲录，马美湖. 鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J]. 食品科学， 2002（2）23：43-46.
溶菌酶提取
方法对比讲稿用 2.1 结晶法 溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。 2.2 离子交换法 离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。 （联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。） 2.3 色谱法 以亲和力为基础，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，制备成具有特异亲和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，依据待分离物质的特性再利用相应组成的溶液洗脱而达到分离提取需要物质的目的，这就是 20 世纪 80 年代末发展起来的亲和色谱技术。亲和色谱技术是诸多色谱法的一种，选择性高、快速、高效，适合蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。随着生产对技术要求的提高，研发人员以传统的膜处理为基础，利用固定离子亲和色谱和膜分离相结合，制备固定金属亲和膜，因其具有良好的分离性能，可用于蛋白质的分离纯化。多方研究结果表明固定金属亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好。如若将间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法相结合，用于溶菌酶分离纯化，蛋白质回收率和吸附剂利 用率都会有明显提高。 2.4 亲和分离法 亲和力为基础，借助物质间的特异性结合力，使目的物质或者杂质与相应的配基结合而达到分离纯化目的物的目的，即亲和分离法，包括亲和沉淀法、亲和膜分离法、亲和过滤法、亲和层析法等。尤以亲和层析法和亲和沉淀法的应用广泛。亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具
酶促褐变
青岛农业大学 果蔬加工新进展课程论文 酶促褐变在果蔬加工中的研究进展Research Advances of Enzymatic Browning During the Processing of Fruits and Vegetables 姓名：董立君 学号：200707109 专业：农产品加工及贮藏工程 中国·青岛 2008年1月
酶促褐变在果蔬加工中的研究进展 董立君200707109 (青岛农业大学266109) 摘要：介绍了酶促褐变的机理和发生酶促褐变的物质条件，综述了在果蔬加工中控制酶促褐变的方法。 关键词：酶促褐变；机理；物质条件；控制方法 Abstract: This paper introduces the principles and the physical conditions of enzymatic browning, then reviews control methods of enzymatic browning during the processing of fruits and vegetables. Key words: enzymatic browning; principles; physical conditions; control methods 果蔬褐变是果蔬成熟老化生理衰退的特征之一。由于发展快，造成果蔬品质变化，贮藏期缩短，成为贮藏保鲜的主要障碍，也成为果蔬采后研究的热点。Smock 等人在苹果的贮藏研究中发现有八类生理失调反应，包括冻害、冷害、组织衰老、缺钙、高二氧化碳、低氧、机械伤等均能引起果实褐变，由此可见造成果实褐变的原因是多方面的。果蔬的褐变从本质上可分为两大类，即非酶褐变和酶促褐变。其中酶促褐变是组织中的酚类物质在酶的作用下氧化成醌类，醌类聚合形成褐色物质从而导致组织变色。果蔬褐变以酶促褐变为主，一直是采后生理研究的重点。一、酶促褐变的机理 在果蔬加工过程中，完整细胞中酚类化合物和醌类化合物之间的动态平衡被破坏，由于空气中氧的侵入和原果蔬中多酚氧化酶的催化作用，多酚类物质被氧化成邻醌，然后，在酚羟基酶作用下进行二次羟基化作用，生成三羟基化合物，邻醌具有较强的氧化能力，可将三羟基化合物氧化成羟基醌，羟基醌进一步聚合由红色变为褐色，最后变成黑褐色的黑色素物质[1]。 1.1酚、酶的区域分布假说 质膜是活细胞与环境之间的界面和屏障，能有效保证膜内外物质交换有效的进行。在正常发育的植物组织中，由于多酚类物质分布在细胞液泡内，而PPO分布在各种质体或细胞质内，因此即使它们与氧同时存在也不会发生褐变。一旦细胞壁和细胞膜的完整性被破坏，酶与PPO接触，在氧的参与下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变[2]。
几种抗氧化酶的作用
一.超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD 的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶（SOD）能催化如下的反应：O2-+H+→H2O2+O2，O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD 是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）会立即将其分解
为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子推出新一个电子后，它也变成自由基，又要去抢夺细胞膜或细胞核分子中的电子，这样又称会产生新的自由基。如，超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代失常等，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾，能够促使某些疾病的发生和机体的衰老。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下人体细胞也存在着清除自由基、抑制自由基反应的体系，它们有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。像SOD就是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。 SOD能专一地清除体有害的自由基，以解除自由基氧化体的某些组成成分而造成的机体损害。如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都与活性氧的毒性有关。实验证明，SOD 能够清除自由基，因此可消除上述疾病的病因。此解毒反应过程是两
鸡蛋溶菌酶提取
鸡蛋溶菌酶提取 溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶） 是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 性质： 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适 pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌 作用： 溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。 提取工艺： （一）鸡蛋清中提取溶菌酶 方法一——食盐盐析 一．材料： 原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂） 仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机 二．工艺流程： 原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH 值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装
-植物芳香油的提取
-植物芳香油的提取
植物芳香油的提取 目标导航 1.了解植物芳香油的来源和发展史以及主要化学成分。2.了解提取芳香油的三种基本方法和原理。 一、基础知识 1．植物芳香油的来源 (1)来源：天然香料的主要来源是________和________。可用于提取植物芳香油的植物器官中，营养器官有________、________、________，生殖器官有______、______、________。 (2)植物芳香油的特性：提取的植物芳香油具有很强的______。 (3)植物芳香油的组成成分比较复杂，主要包括__________及其________。 2．基本方法有三种 采用哪种方法是根据________________来决定的。 (1)________________是常用的方法 ①原理：水和芳香油的沸点不同，利用________将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成________________，再冷却分离。
②分类：根据蒸馏过程中原料放置的位置，可以将水蒸气蒸馏法划分为________蒸馏、________蒸馏和________蒸馏。 ③适用范围：适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。 (2)________(主要为冷压榨) ①原理：含芳香油较多的果皮经冷磨或机械冷榨的方法将芳香油压榨出来，经分离水分后可得到冷压精油。 ②优点：此法生产过程在常温下进行，确保了芳香油中萜烯类化合物不发生化学反应，从而使精油质量提高，香气逼人，如含精油较多的柠檬、鲜橘、佛手柚等果皮均可通过压榨或割伤而得到。 (3)________ 萃取是有机化学实验中用来提纯和纯化化合物的手段之一，通过萃取从固体或液体混合物中提取出所需要的化合物。 ①液—液萃取法的基本原理：利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中的溶解度不同，使化合物从一种溶剂内转移到另一种溶剂中。经过反
抗氧化酶的作用
重要的抗氧化酶和抗氧化剂的作用 超氧化物歧化酶（SOD）是美国的McCord和Fridovich在1969年发现的一种清除超氧阴离子自由基的酶。SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，按金属辅基的成分不同主要分成三类,第一类含铜和锌，称为CuZn-SOD，是最常见的一种，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内。第二类含锰，称为Mn-SOD，呈粉红色，主要存在于原核细胞体、真核细胞的细胞浆和线粒体内。第三类含铁，称为Fe-SOD，呈黄褐色，主要存在于原核细胞中。另外，在牛肝中还发现一种CoZn-SOD[8]。 正常生理状态下，机体产生的自由基和清除自由基的速率处于动态平衡状态。但当机体内自由基产生增多，就会对机体的蛋白质、脂质和DNA造成损伤，导致机体疾病的发生。SOD是生物体内对抗氧自由基的一种最重要的抗氧化酶，是专门清除超氧阴离子自由基的。它的作用是将氧自由基歧化，发生 2O 2-+2H+SOD H 2 O 2 + O 2 的反应。由于H 2 O 2 在SOD活性部位生成，会对SOD 本身产生杀伤。催化产生的H 2O 2 如果不被及时清除，它会与O 2 -反应生成毒性 更大的羟基自由基。衰老自由基学说认为，代谢产生的自由基对机体造成的损害可引起衰老，SOD可有效的清除自由基，在一定程度上延缓衰老。此外，SOD还具有增强机体免疫力，提高机体对自由基引发的疾病的抵抗力，消除运动性疲劳等生理功能[3]。 过氧化氢酶（CAT）是一种末端氧化酶，广泛存在于动植物和微生物体内，酶分子结构中含有铁卟啉环，1个分子酶蛋白中含有四个铁原子[9]。CAT的生 物学功能是催化过氧化氢分解为水和氧，2 H 2O 2 CAT 2H 2 O + O 2 。过氧化氢 酶（CAT），广泛存在于动植物和微生物体内的一种末端氧化酶。它的生物功能是 催化细胞内的过氧化氢分解，起抗氧化作用，即2H 2O 2 2H 2 O+O 2 ，它可防 止过氧化氢含量过高对机体组织造成损伤，对细胞起到保护作用。 本研究结果显示，力竭运动后，大鼠的心组织、肝组织和肺组织中CAT活性均表现出升高，这可能是由于运动应激造成大鼠组织过氧化物质增多，使得组织CAT活性对应升高。同时，结果显示，联合补充谷氨酰胺和番茄红素对力竭运动大鼠肝组织和肺组织的抗氧化能力提高的效果最为明显，而单纯补充番茄红素对心脏组织的抗氧化能力提高优明显作用。这说明对于力竭运动大鼠的肝和肺组织，联合补充这两种物质起到协同抗氧化的作用。对于心脏组织，联合补充的效果不如单独补充一种的效果好，此机理尚待探讨。 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），为水溶性四聚体蛋白，含有四个亚基，每个亚基含有一个硒原子[10]。主要存在生物体的线粒体和细胞液中，它的生理功能是不仅可以清除过氧化氢，同时还可以清除脂质过氧化物，所以说它也是机体内重要的抗氧化酶之一，在反应过程中还原性谷胱甘肽作为还原物
抗氧化酶测定实验方法
植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定 一、原理 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。 二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在 450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1) D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。
一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法
(10)授权公告号 (45)授权公告日 2014.11.12 C N 103114082 B (21)申请号 201310069093.9 (22)申请日 2013.03.04 C12N 9/36(2006.01) (73)专利权人浙江工业大学 地址310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人张健 金志敏 夏春年 姚小武 张岩 (74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人黄美娟 王兵 CN 1108381 C,2003.05.14, 陈若飞.从蛋壳中提取溶菌酶的研究..《沈 阳化工学院院报》.2008, 卢庆祥.用聚丙烯酸凝聚提取溶菌酶..《化 学教学》.1995, M. Sternberg 和D. Hershberger.Separation of proteins with polyacrylic acids..《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 》.1974,(54)发明名称 一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的 方法：用水将鸡蛋清溶解，调节pH 至4.0～5.0 并加热至80℃左右，使杂蛋白沉淀、过滤除去，获 得滤液；再在弱酸性条件下，用木质素磺酸钠与 滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀；然后，将沉淀物 在碱性条件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解 离，过滤得滤液；最后，向滤液中加入无水乙醇使 其结晶，过滤、干燥即得溶菌酶；本发明使用的原 材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、 生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工 业化生产。(51)Int.Cl.(56)对比文件 审查员 孙彦珂 权利要求书1页 说明书5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利权利要求书1页 说明书5页(10)授权公告号CN 103114082 B
我们常见的有抗氧化成分植物的比较有哪几种
我们常见的有抗氧化成分植物的比较有哪几种？ 生活中大家都喜欢养生，保持年轻，通过食物（如植物提取物）来达到这个抗氧化的目的，那抗氧化到底是怎么来的呢？下面我们来比较一下。 一种比较是几种植物提取物不同的检验，在检测试验中抗氧化活性差异,采用ABTS法、FRAP法、β-胡萝卜素漂白法、鱼油氧化体系中的TBARS法以及对总酚含量的测定,评估了松树皮、葡萄籽、绿茶、蓝莓、苹果和丹参提取物的抗氧化活性.结果发现,无论是总酚含量,还是单一因素清除测得的抗氧化性活性(ABTS法,FRAP法),与在复杂的脂肪酸或真实食品体系中生成的氧化产物(β-胡萝卜素漂白法,TBARS法)的抑制能力的相关性较差.因此,植物提取物的抗氧化活性需要结合不同的检测方法进行综合评价，才能达到更好的结果。 另一种比较分析3种金花茶植物提取液的抗氧化活性。方法：通过测定过氧化值（POV）、羟自由基（.OH）清除率、超氧阴离子自由基（O2.-）清除率、DPPH.清除能力和还原能力来综合考察3种金花茶植物提取液的抗氧化活性。结果：3种金花茶提取液的抗氧化活性实验效果理想,且呈量效关系,毛瓣金花茶提取液的抗氧化活性较其他2种为好。结论：3种金花茶提取液具有良好的抗氧化活性,具有较高的开发利用价值。 而生姜根、番石榴叶、番石榴籽、橙皮、芝麻种皮、米糠和小麦胚芽等植物提取物的抗氧化活性和热稳定性.方法比较了乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、正己烷和石油醚等不同溶剂提取物的抗氧化活性,分别采用Fo-lin-Ciocalteu法和三氯化铝比色法测定不同植物提取物的总多酚和总黄酮量,并进一步通过加热处理和Rancimat法研究了巴科医药植物提取物的热稳定性和对葵花籽油的诱导时间.结果生姜根的石油醚提取物具有最高的抗氧化活性,生姜根、橙皮、番石榴叶的提取物具有超过α-生育酚的抗氧化活性.不同植物提取物的抗氧化活性与它的总多酚和总黄酮量呈显著正相关.生姜根、番石榴叶和芝麻种皮显示比α-生育酚更好的热稳定性,而抗氧化性与α-生育酚类似.结论生姜根、番石榴叶和芝麻种皮可作为潜在的天然抗氧化剂来源,应用于食品和医药工业中。
第一节 溶菌酶的提取
第一节溶菌酶的提取 一、简介 1.Lz的结构及组成 溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特 别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。 鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链（见图6-1），有四 图5-1 溶菌酶的分子结构 对二硫键，分子量为14300。结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。 2.Lz的基本性质 Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。其酶蛋白性质稳定，热稳定性很高。 （1）Lz的热稳定性 Lz在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对Lz仅有较小的活力损失。在pH4.5（100℃，3min）、pH5.29（100℃，3min）下加热，Lz是稳定的。一般认为Lz在酸性条件
下稳定，在碱性条件下不稳定。 糖和烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCL对Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时对Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则抑制作用愈强。具有—COOH和—SH3OH基的多糖对Lz活力有抑制作用。 （2）加工过程中的化学变化 蛋白质和过氧化的脂类作用对食品的储藏有着重要的影响，自由基使不饱和脂肪酸过氧化产生H2O2,导致产品的破坏，这类反应的一个特征是产品的溶解性下降。溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养，导致蛋白质溶解度的下降和增加了溶解部分的分子质量，这是由于在Lz中产生了游离基，而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用，研究表明Lz中游离基浓度随水分活度的上升而下降。 在150℃~300℃焙烤对溶菌酶和酪蛋白的作用中，溶菌酶被作为一个纯蛋白质样品在250℃几乎所有溶菌酶的氨基酸被分解，色氨酸，含硫氨基酸、碱性氨基酸和β-OH氨基酸，较酸性氨基酸、脯氨酸、芳香族氨基酸(除色氨酸外）、有烷侧链的氨基酸容易分解这在氨基酸和还原糖间形成风味和有色物质的美拉德反应中是很重要的。 （3）络合作用 溶菌酶和许多物质形成络合物导致其失活。人们发现等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活力；脱水全蛋中仅保留部分溶菌酶的活力；蛋黄污染的蛋清仅有两个离子交换色谱峰，而不是无污染的三个峰；对全蛋的色谱分离无溶菌酶。据此，研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。 3.Lz的用途 溶菌酶作为一种活性物质可应用在各个领域，我国的食品工业、酶工程、发酵工业、医学和科学研究对溶菌酶有较大的需求。 由于溶菌酶对多种微生物有抑制作用，因此可以用于食品保鲜。目前主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜的方面。 此外在发酵工业领域，酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。另外溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。由此可见溶菌酶的用途极其广泛。 4.Lz的来源及分布 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，将溶菌酶分为以下三类： （1）动物源溶菌酶 动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应
酶促褐变
果蔬在采后，由于组织衰老、失水、低温冷害、高CO2伤害、机械损伤、病原微生物浸染或其他逆境胁迫会引起褐变，从而影响了其外观、食用和销售［1］。本文就果蔬酶促褐变的形成条件、褐变机理以及抑制方法进行了综述。 1 酶促褐变的条件 酶促褐变是指果蔬在受到机械损伤或处于异常环境（受冻、受热）下，在氧化酶作用下将酚类物质氧化形成醌，醌的多聚化以及它与其他物质的结合产生黑色或褐色的色素沉淀，从而导致果蔬的营养丢失。酶促褐变反应的发生需要三个条件：底物、酶类物质和氧。 1.1 底物 底物，即酚类物质。酚类物质按酚羟基数目分为一元酚、二元酚、三元酚及多元酚。 酚类物质的合成途径有两条：其一是由苯丙氨酸脱氨基而形成，其二由莽草酸或与之一个的环己烷生物直接芳香化而形成。其中，第一条途径是高等植物中最主要的途径［2］。 酚类物质的氧化是引起果蔬褐变的主要因素［1］，在果蔬贮存过程中随贮存时间的延长含量下降，一般认为是多酚氧化酶氧化的结果。这些酚类物质一般在果蔬生长发育中合成，但若在采收期间或采收后处理不当而造成机械损伤，或在胁迫环境中也能诱导酚类物质的合成。 1.2 酶类物质 催化酶促褐变反应的酶类主要为多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）。 在果蔬细胞组织中PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度不同而有差异。PPO在大多数果蔬中存在，如马铃薯、黄瓜、莴苣、梨、番木瓜、葡萄、桃、芒果、苹果、荔枝等，在擦伤、割切、失水、细胞损伤时，易引起酶促褐变［1，3，4］。 PPO 催化的酶促褐变反应分两步进行：单酚羟化为二酚，然后二酚氧化为二醌。PPO以铜离子为辅基［3］，其活性的最适pH值范围为5～7，有一定耐热性，其活性可以被有机酸、硫化物、金属离子螯合剂、酚类底物类似物质所抑制［6］。POD在H2O2存在条件下能迅速氧化多酚物质，可与PPO协同作用引起苹果、梨、菠萝等果蔬产品发生褐变［7］。 1.3 氧 氧是果蔬酶促褐变的必要条件。正常情况下，外界的氧气不能直接作用于酚类物质和PPO 而发生酶促褐变。这是因为酚类物质分布于液泡中，PPO则位于质体中，PPO与底物不能相互接触。在果蔬贮存、加工过程中，由于外界因素使果蔬的膜系统破坏，打破了酚类与酶类的区域化分布，导致褐变发生［5］。 2 酶促褐变的机理 2.1 酚、酶的区域分布假说 质膜是活细胞与环境之间的界面和屏障，能有效保证膜内外物质交换有效的进行。在正常发育的植物组织中，由于多酚类物质分布在细胞液泡内，而PPO分布在各种质体或细胞质内，因此即使它们与氧同时存在也不会发生褐变。一旦细胞壁和细胞膜的完整性被破坏，酶与PPO接触，在氧的参与下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变［2，3］。 2.2 自由基伤害假说 自由基袭击生物大分子和膜脂，会导致膜脂过氧化加剧，膜系统结构和功能的破坏，膜透性增大，进而导致代谢障碍和膜系统的破坏和解体。正常情况下，由于机体内存在防御系统，故自由基代谢保持平衡。但在干旱、高盐分、SO2、O3、低温或水分亏缺时，由于自由基产生过多，此时活性氧的产生和清除平衡体系被打破，会导致植物细胞受到伤害，从而引起褐变的发生。 2.3 保护酶系统假说 通常情况下，植物组织中有较高的还原势，正常的氧化还原代谢平衡使氧化形成的醌类物质通过还原氧化或转化而未聚和。保护酶系统包括两类物质：一是氧化酶系统，主要有超
科普 植物提取物在化妆品中的作用
在化妆品中使用植物提取物，是为了让化妆品具有一定的功效。目前，国内外应用于化妆品的植物约有500种，它们在化妆品中的作用大致可以分为以下几类： 抑菌止痒 此类植物提取物具有抗致病皮肤真菌和细菌的生物活性。常见有茶叶提取物、金银花提取物、芦荟提取物、甘草提取物、川芎提取物、薄荷叶提取物、鼠尾草提取物等。 保湿滋润 此类植物提取物能滋润柔软皮肤角质细胞，有助于皮肤处于润湿、柔软状态。常见有海藻提取物、柠檬提取物、燕麦提取物、芦荟提取物、益母草提取物、绞股蓝提取物等。抗敏美白 这类植物提取物可保护皮肤黏膜，能美白皮肤，还有防腐和防止化脓作用。常见有葛根提取物、金缕梅提取物、马尾草提取物、佛手柑提取物、牡丹提取物、芍药提取物等。调理滋养 这类植物的提取物具有保护皮肤、活血、调理滋养皮肤、促进皮肤机能等作用。常见有茶叶提取物、油茶提取物、芦荟提取物、鼠尾草提取物、七叶树提取物、薰衣草提取物、人参提取物、绞股蓝提取物、山金花提取物、迷迭香提取物等。 美白祛斑 这类植物提取物能抑制酪氨酸酶活性，去除黑色素，起到美白祛斑的作用。常见活性木瓜素、当归提取物、桔梗提取物、柠檬提取物等。 防晒作用 这类植物提取物是天然的紫外线吸收剂，其对紫外线的吸收波长极大值在280nm左右，所以能防止紫外线对皮肤的损伤，一般搭配物理防晒剂使用。常见有当归提取物、槐花提取物、薏苡提取物、紫草提取物、芦荟提取物、母菊提取物等。 滋润保护 主要是植物油脂类，具有防裂作用，能保护皮肤，防止干燥和皲裂。常见有乳木果油、米糠油、霍霍巴油、橄榄油、红花油、椰子油、茶籽油、乌柏油等。 抗氧化防腐 化妆品在贮藏过程中由于微生物的作用或因其所含油脂成分的酸败会发生变质现象。可作为防腐剂与抗氧化剂应用于化妆品的植物提取物，根据化学组成可分为：甾醇类防腐剂与抗氧化剂，如黄芩、黄柏、牛膝、白花蛇舌草等提取物；醌类防腐剂与抗氧化剂，如虎杖、大黄、决明等提取物；酚类、酸类防腐剂与抗氧化剂，如白芍、花青素、牡丹、徐长卿、连翘等提取物。