新环肽的研究
摘要：从非核糖体肽合成酶的C末端硫酯酶（TE）的结构域（NRPSs ）催化在多样的生物活性分子的生物合成的最后一步。在许多系统中，硫酯酶结构域参与呈现为线性前体的大环酰基-S-酶中间体。从tyrocidine切除的硫酯酶域NRPS已经显示出催化的肽的硫酯基，模仿自然酰基-S-的酶底物的环化反应。在这项工作中，我们探讨环由孤立的TE催化结构域的通用性。使用合成肽的硫酯基的6至14个残基的长度，我们表明，从短杆菌酪肽NRPS切除TE域可用于生成环肽具有可比动力学效率的大小的阵列。我们还研究了从该生物合成的对称环十肽短杆菌肽S与环状lipoheptapeptide枯草A.两个TE结构域表现出预期的环化活性的NRPSs的切下的TE域：从短杆菌肽?NRPS的TE域催化的头- 尾环化十肽硫酯，以形成短杆菌肽S，并且从枯草NRPS的TE域催化立体特异性环化以形成枯草的大环内酯类似物。并着眼于由TE催化产生环状分子的文库，我们报告的固相合成和的线性肽硫酯池小TE-介导的环化反应。这些研究提供的证据是TE催化的合成一系列大环化合物的一种手段一般效用。正文：非核糖体肽合成酶（NRPSs ），1个聚酮合成酶（PKSs ）和混合NRPS / PKS系统产生的生物活性分子的一个令人难以置信的多样化（图1）（1,2）。许多这些分子具有大环结构，包括免疫抑制剂环孢菌素，抗生素红霉素和达托霉素，和抗癌剂的埃坡霉素。相比其线性类似物的大环结构减小分子的构象灵活性，这可以将其限制为具有生物活性的构象。非核糖体肽合成酶的模块化组织促进不同结构的合成。每个NRPS模块包含几个半自治的酶域（图2A）（1-4）。一种腺苷酸（A ）结构域激活一个特定的氨基酸为氨腺苷酸，这后来成为共价键被拴硫酯连接到一个包含phosphopantethiene肽载体蛋白（PCP）。在这个阶段中，栓系氨基酸可以通过额外的域，包括差向异构化，N -甲基化，并heterocyclization 域被修改。链伸长率通过缩合（C）结构域的夫妇从上游PCP域到下游氨酰-S- PCP ，最终在完成线性肽的产生生长链前体系在最C端的PCP域（肽催化- S -PCP ）。
最终产物的释放通常是由一个C -末端硫酯酶（TE）域，其催化的最C端的PCP （图2B）的脱酰化催化。TE催化的机理涉及到从终端的PCP域转移的线性肽以在TE域的活性位点丝氨酸残基而形成的肽-O -TE的中间体（5 ，6）。中间体的脱酰涉及任水解释放的直链肽，或在环状产物，分子内的亲核试剂的反应的情况下。用于环化的TE域，TE提供多样性和复杂性的来源为各种基团可以在环化反应，包括N末端氨基基团的亲核试剂（导致头- 尾环化反应），如肽抗生素tyrocidine A（7）和短杆菌肽S（8），其侧链的亲核试剂（从而产生支链环状分子），为在抗生素杆菌肽A（9）和达托霉素（10），和THEA -羟基AA-羟基脂肪酸如枯草A（11）（图1）。
图1：通过NRPS ，PKS ，以及混合NRPS / PKS系统产生的大环结构，例如可以按照类型组织由TE的催化环化反应形成联动：头- 尾环化反应，低聚反应/环化，或支链的环化反应。该生物合成过程中由TE催化形成的图是由阴影标出。
图2 ：（一）tyrocidine示意图，短杆菌肽S和枯草非核糖体肽合成酶。方块代表个人蛋白质结构域：一，腺苷酸化;五氯酚，肽载体蛋白; E，差向异构化; C，冷凝，TE ，硫酯酶（阴影部分）。上海代表phosphopantetheine和OH的TE活性位点丝氨酸。在本文中，TE从每个合成是通过克隆切除的研究，表达，和分离的结构域的纯化。硫酯酶催化结构域（二）机构：肽-O -TE酰基- 酶中间是通过来自终端的肽基载体蛋白（PCP）的phosphopantethiene转让的肽链的活性位点丝氨酸形成在TE域。用于水解的TE域，中间被水捕获，生成直链肽;对于TE的环化域的分子内的亲核试剂捕获中间，产生了环状产物。最近，我们从硫酯酶催化环化的通用性克隆的TE域（TycC TE ）。
图3：肽环化由（A ）催化切除的硫酯酶域硫酯基的tyrocidine NRPS ，（二）短杆菌肽NRPS ，和（C ）的枯草NRPS 。的肽的硫酯基模拟肽-S- PCP，天然底物的TE域。
该tyrocidine NRPS亚基TycC （724 kDa）的，并表示它是一个孤立的28 kDa的结构域（12）。
合成肽Nacetylcysteamine硫酯（肽SNAC ）作为模拟连接到最C端的PCP （多肽- PCP）的phosphopantethiene全长线性肽。肽SNAC的分离TycC TE高效催化headto - 尾环化反应以形成环状抗生素tyrocidine A（图3A）。不同衬底残基，发现该TE是在其环化底物类似物的能力相当宽松。只有两个残基中，一个十肽底物的每个端部附近，被证明是所需的有效的环化：在N末端的D-苯丙氨酸所提供的绝对立体化学和侧链的要求进行环化，变更ORN相邻的C-末端残基成Glu急剧降低的环化率（12）。进一步探讨了用于环化的肽主链的要求表明，靠近环化结一些主链的酰胺键所需要的有效的环化（13）。已经从这些研究中出现的模型表明，它满足这些最低要求各种基材由TE催化环化（13 ）。
并着眼于探讨孤立的TE域的一般合成程序，我们着手研究了三种不同的TE域，从tyrocidine切除，短杆菌肽S，和枯草合成酶。在确定了TycC TE能够催化十肽硫酯基的环化反应，在这里我们探讨其催化环化，以形成环肽从6至14个残基不等的大小的能力。此外，我们克隆，表达和纯化的短杆菌肽?NRPS （GrsB TE ）孤立的TE域，并从枯草NRPS （SRFA -C TE），并评估自己的能力，催化环化，形成短杆菌肽S和的枯草A中的脂肽类似物分别（见图3）。最后，我们报告的肽的硫酯的池小的固相合成和测试TycC的TE中，以将其转换为相应的环肽的池的功能。这些研究提供了证据，该方法对大环化合物的合成的一般效用。
EXPERIMENTAL PROCEDURES实验步骤
克隆和TycC TE ，GrsB TE和SRFA -C TE域的表达。TycC TE被克隆，表达和纯化，如先前所述（12）。对于GrsB TE和SRFA -C TE ，基因片段通过PCR方法从染色体DNA上使用排气聚合酶（New England Biolabs公司）进行扩增。
GrsB TE （含有GrsB残基4163-4452 ）中的扩增使用寡核苷酸5'- TTT CCA TGG TTA CAC ATA AAG AAT CAG AA -3'和5'- ATA GGA TCC TTT
TAC TAC AAA TGT CCC TTG -3'从染色体DNA ofBacillus短ATCC 9999 ，消化withNcoI和BamHI （Amersham）上，并连接intoNcoI / BglII位消化pQE60 （Qiagen公司），该追加的C-末端His6标签的表达的蛋白质。使用寡核苷酸5'- ATA AGA TCT AAC GGG GGC TCT GAT GG -3'和5'- TGA TAT GGA TCC AAC CGT TAC GGT TTG的SRFA -C TE的编码序列（含SRFA -C的残基1041至1274年），扩增TG -3' ，从芽孢杆菌属subtilisJH642的染色体DNA ，消化withBamHI andBglII ，并连接到pQE60预先用BglII消化，并用CIP （New England Biolabs公司）脱磷酸化，得到的载体pQE60 -TE （SRFA -C）。标准方法用于所有的DNA操作（14）。克隆产物经测序与ABI PRISM 310遗传分析仪证实。对于表达，所述重组质粒转化到大肠杆菌coliM15 / pREP4的盒（Qiagen ）。细胞生长至OD）0.5（600纳米），诱导用0.2mM的IPTG ，然后在24℃下为pQE60 -TE （GrsB ），并在30 ℃下的pQE -TE （SRFA -C）6小时生长。所表达的蛋白进行的Ni-NTA affininty色谱法（图4）进行纯化并透析至25mM的HEPES，50mM的NaCl和10％甘油，pH为7.0 。
标准肽SNAC Synthesis.Peptide硫代酯基，但不包括肽硫酯LIB1 （下面详述）的文库，合成了一个两步过程涉及固相肽合成之后solutionphase硫代酯的形成。肽合成上进行使用二异丙基（DIPCDI ）一种PerSeptive公司Biosystems公司9050合成仪（0.3毫摩尔规模）/羟基苯并三唑（HOBt）化学和2 - 氯三苯甲基树脂衍生的L-列伊。联轴器进行用Fmoc -保护的氨基酸（Novabiochem ），除了对N- terminalD -苯丙氨酸GLPsubstrates的，这是Boc保护。侧链保护基团用BOC为ORN和Trp ，叔丁基对酪氨酸，苏氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸，以及三苯为天冬酰胺和谷氨酰胺。在substratesSLP - 1RandSLP -1S的合成的最终偶联，分别，R-和S-3 -羟基丁酸被用于（Aldrich公司）。1：1：3的混合物的乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷来切割从树脂（3小时，24℃）的肽。然后将树脂过滤除去，将肽沉淀withn - 己烷，使溶剂通过旋转蒸发除去。被保护的肽溶解在THF中，并通过加入DCC （1.2当量），然后添
加HOBt （1.2当量），和NAC （3当量）的硫酯的形成引发。在搅拌for1h （24℃）后，K2- CO3 （0.6当量）并将该反应搅拌另外2小时。然后将反应物过滤并通过旋转蒸发除去溶剂。3 ：1 TFA /二氯甲烷/ NAC （3小时，24 ℃）用16 peptideSNAC的脱保护影响。将反应物沉淀用冷乙醚（4℃），并用乙醚洗涤两次沉淀物。将反应产物通过制备型HPLC 用reversedphase （C18）柱纯化，用20％至60 ％乙腈的梯度在0.1％TFA /水，经40分钟。冻干得到的肽- SNAC ，为白色粉末。肽SNACs的身份和纯度通过分析型HPLC和MALDI -TOF 质谱进行评估。在> 95％纯度生成与该异常GLP14 ，其中contained~50 ％游离酸的估算通过MALDI-TOF MS中的底物。ForGLP14 ，50％纯度，假定用于动力学分析。
固相肽合成SNAC 。对于四肽硫酯，LIB1一个小水池固相合成的酰基磺酰胺安全的副渔获物连接器是利用（15 ）。4 Sulfamylbutyryl树脂（NovaBiochem ）用Ingenito和同事（16）的方法加载用Fmoc -L -LEU 。的树脂（13.5克，1当量）溶液洗涤，用CH2Cl2
并悬浮在50mL CH2Cl2中。二异丙基10当量）和Fmoc -L -LEU （5当量），并将该混合物在24℃下搅拌20分钟。将混合物然后冷却至20 ℃，加入PyBOP （5当量）。8小时后，将反应物过滤并用二氯甲烷。偶联步骤重复（总共三个连接循环）。的树脂载量为0.1毫摩尔/克的评估通过用20％哌啶并释放Fmoc基团的定量。随后的氨基酸偶联进行使用自动化DIPCDI /添加HOBt偶合器与受保护的氨基酸如上述。合成肽混合物与多元在位置3和4中的野生型tyrocidine序列，利用1.5当量每OFL-苯丙氨酸和L-丙氨酸（用于位置3），每个D - Phe和D-色氨酸的1.5当量（对于位置4）。活化和裂解的树脂进行如每Shin等人的方法。（17）。简单地说，该树脂通过加入NMP（4mL）和DIEA （200μL ）的活化，接着通过碘乙腈（180μL ），将其通过碱性氧化铝预过滤。搅拌在24℃下24小时后，将树脂用NMP 然后加入THF 。硫代酯的形成是通过用8 ％的N -乙酰半胱胺在THF中的树脂的搅动实现的（24小时，24 ℃）。该树脂通过过滤除去，并通过旋转蒸发除去溶剂。肽脱保护进行了16：3 ：1解决方案TFA /二氯甲烷/ NAC （3小时，24 ℃）。肽SNACs的池，然后用冷乙醚（4℃）沉淀，溶解在20 ％CH 3 CN /水，冷冻干燥，providingLIB1as白色固体。Assays.试验
反应在400微升体积进行的，在24℃下，用25mM MOPS，pH为7.0 ，1 mM氯化钠和甘油（0.02-1 ％）的不同量。存量的解决方案酶稀释到所需的浓度为10 ×10毫米的NaCl 和10mM MOPS，pH为7.0 。反应通过添加酶来引发，并通过加入25μL猝灭的1.7％TFA /水，快速冷冻用液体N2，并保存于-80 ℃。时间零反应通过加入0.1 ％TFA /水25μL ，以事先将反应混合物进行以引发反应的。将反应物解冻，85 μL乙腈溶液，样品，通过HPLC （贝克曼系统金色）用反相（C18）分析柱（性Vydac ）与20％的梯度至100％的0.1％TFA /乙腈中的0.1％TFA /水35分钟。实验确定exinction系数（）在220nm的肽SNACs被用来确定在反应混合物中的肽- SNACs ，水解和环状产物的浓度，假定等于在220nm 。产物的形成与TycC TE与野生型substrateTLPand GrsB TE带看作是线性的，以2分钟的野生型substrateGLP10was （数据未示出）。环化所有GLPsubstrates动力学的测定是由初始速率的方法进行，用1分钟的时间点。对于SRFA -CTE ，稳态周转条件下，产物的形成是线性至40分钟（数据未显示）。动力学为SLP- 1R与SRFA -C TE的反应通过初始速率的方法测定，用10分钟的时间点。（数据未示出）的任何检测的底物24小时后，没有检测到未催化的产物的形成。
产品特性。在分析HPLC峰的任务是通过使用生物系统PerSeptive公司旅行者德仪器在Dana Farber癌症研究所，分子生物学核心设施的MALDI -TOF质谱进行。计算并观测质量在表中给出的肽SNACs inLIB1and的标识相应的周期性产品和液相色谱串联质谱分析ofSLP - 1R cyclewere进行使用HewlettPackard 1100高效液相色谱仪连接到的Finnigan -MAT LCQ离子阱质谱仪在霍华德·休斯医学研究所/哈佛医学院的生物聚合物工厂。
多肽合成方法
多肽合成中肽键形成的基本原理 一个肽键的形成（生成一个二肽），从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键（酰胺键）连接，同时脱去水。 在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸（A）的羧基部分，第二个氨基酸（B）则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽（A－B）。如果羧基组分（A）的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能开有成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物A－B混在一起。所以，在多肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。 因此，多肽合成－即每一个肽键的形成，包括三个步聚： 第一步，需要制备部分保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在； 第二步，为形成肽键的两步反应，N－保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后形成肽键。这一耦合反应既可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行。 第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行，但为了继??? 续肽合成，选择性脱除保护基也是必需的。 由于10个氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和Cys）含有需要选择性保护的侧链官能团，使肽合成变得更加复杂。因为对选择性的要求不同，所以必须区分临时性和半永久性保护基。临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护，在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除，有时也在合成过程中脱除。 在理想状态下，羧基组分的活化和随后的肽键形成（耦合反应）应为快速反应，没有消旋或副产物形成，并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是，还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比，适用于实际合成的方法很少。 在肽合成过程中，参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连（甘氨酸是唯一的例外），存在发生的消旋的潜在危险。 多肽合成循环的最后一步，保护基要全部脱除。除了在二肽的合成中需要全脱保护以外，选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。合成策略要深思熟虑地规划，依战略选择，可以选择性脱除Nα－氨基保护基或羧基保护基。“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。一般来说，在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。在溶液中进行肽合成（也指“常规合成”），对困难序列，多数情况下，用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。要合成更长的肽时，目标分子必须分割成合适的片段，并确定在片段缩合过程中，它们能使能C端差向异构化程度最小。在单个片段逐步组装完成后，再连接产生目标化合物。肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。 最初的固相多肽合成（SPPS）只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化，其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上，由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。今天，为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。在聚合物载体上，也可以进行片段缩合反应。
脂肽抗生素的研究概况 ()
6脂肽抗生素的研究概况 脂肽（Lipopeptide）又名脂酰肽（Acylpeptide），是一类重要的抗菌肽，主要来源于一些由细菌、酵母菌、真菌分泌的代谢产物，其种类繁多、结构复杂，是一类由脂肪链和肽链组成的具有两亲结构的微生物次级代谢产物（Kosaric，1987）。脂肽一般来源于植物、动物和微生物，但大多数脂肽来源于微生物，而其中又以来源于细菌的脂肽居多。在细菌中，脂肽一般是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的代谢产物。1968年，Arima等首次从枯草芽孢杆菌株发现脂肽类表面活性剂，呈晶状，商品名为表面活性素（surfactin）（Arima，1968）。目前发现的抗菌脂肽主要有表面活性素（surfactin）、芬荠素（Fengycin）、伊枯草菌素（iturin）、和杆菌霉素（Bacillomycin），抗霉枯草菌素（mycosubtilin）、制磷脂菌素（plipstatin）等。脂肽分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基。由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽除了具有抗菌活性之外还具有生物表面活性剂的特性（Stein，2005）。脂肽在环境治理，医药、微生物采油等领域有重要的应用前景（Jitemdra，1997；Banat，2003）。 6.1 脂肽抗生素的种类及结构特性 芽孢杆菌产生的抗菌脂脂肽的分子结构由脂肪酸链和肽链两部分组成，分子中的多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，β-羟基或者氨基脂肪酸的烃链形成亲油基，即是具两亲性的生物表面活性剂。其中亲水的氨基酸通过肽键相互连接，再与脂肪烃链上的羧基和β-羟基或者氨基结合形成环状，因此，抗菌脂肽一般是以内脂或者酰胺键结合而成的环脂肽（刘向阳，2005；吕应年，2005；Wang，2004）。芽孢杆菌脂肽抗生素主要包括表面活性素（Surfactin），伊枯草菌素（Iturin），芬荠素（Fengycin）三大类。 6.1.1 表面活性素（Surfactin） Surfactin类群的脂肪酸的碳链长度在13~16个，具有LLDLLDL的手性七肽通过一内酯键与脂肪酸链碳原子的β-羟基基相连，其在水溶液中分子成“马鞍状”构像，该家族成员包括枯草芽孢杆菌产生的表面活性素（Surfactin），地衣芽孢杆菌产生的地衣芽孢杆菌素（Llichenyishin），短小芽孢杆菌的表面活性剂（Pumilacidin）、埃斯波素（Esperin），其中Liehenyishin、Pumilacidin、Esperin主要应用于工业和环境治理（Meiji et al.，1969.；Yakimo et al.，1995；Naruse et al.，1990）。而Surfactin是一种脂肽类抗菌物质，它是由β-羟基脂肪酸和7个氨基酸残基的小肽组成，肽链的第7位氨基酸上的羧基和
噬菌体展示肽库技术的研究及应用进展
2010.01
2010.01 的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L 型天然氨基酸形成的短肽。 3噬菌体肽库的筛选技术 如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌 体是肽库技术的关键。经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有 Streptavidin 的磁珠上对噬菌体进行筛选。3.1 宿主菌直接洗脱 经典筛选过程中，一般利用pH 的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。 3.2双层膜筛选系统 获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特 异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。针对这种情况，Skerra 等[8]建立了双层膜筛选系统。第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选 效率。 3.3选择性感染噬菌体筛选系统 传统的筛选系统中基因重组的噬菌体仍有野 生型的gene Ⅲ蛋白的存在，因重组噬菌体具有感染能力，这导致在筛选后扩增时特异性和非特异性的噬菌体均可以进入宿主菌增殖。选择性感染噬菌体筛选系统把筛选和扩增合并为一步，只有特异性的噬菌体才能感染宿主菌扩增，而非特异性噬菌体却不能。此筛选系统是以噬菌体感染宿主菌的机理为基础，其基本原理是把其中之一用特定的多肽或蛋白替代，使噬菌体丧失感染力，再通过这些多肽与其配基的结合恢复感染能力。这样只有特异性的噬菌体可以通过配基配体结合才能恢复感染能力，进入宿主菌细胞内繁殖[9]。具体的做法有两种，其一是将噬菌体所有P Ⅲ外壳蛋白的N 端用所展示的多肽或蛋白取代，使其丧失感染能力，再把与所筛选的目的多肽或蛋白的特异配基同P Ⅲ蛋白的N 端相连作为筛选的探针，只有特异 性噬菌体才能与连接有P Ⅲ蛋白N 端的配基相结合，这种结合使噬菌体重新具有P Ⅲ蛋白的N 端，因而具有感染力；其二是将作为配基的多肽或蛋白融合在E.coli 的纤毛上，这样纤毛失去了介导的能力，只有特异性的噬菌体可与修饰了的纤毛结合，从而恢复纤毛的介导能力，使特异性的噬菌体进入细胞体内增殖，这一系统显示了较高的筛选效率。 4噬菌体肽库的应用4.1 抗原表位的研究 传统的抗原表位分析主要是通过分析抗原经 物理化学降解得到的片段或人工合成一系列来源于抗原的肽段与相关抗体的结合活性而得到，此方法成本高，必须首先确定蛋白质的氨基酸序列，才能合成相应的肽，而在实际研究中，许多蛋白质的序列并不清楚。噬菌体肽库技术将抗体作为受体暴露于肽库中，筛选到能与特异性抗体相结合的重组噬菌体肽的序列，弥补了合成肽筛选的不足。在抗原-抗体的识别研究中，不必源于天然抗原，可以从随机肽库中直接筛选出能和抗体结合的表位。尽管有时与天然表位在氨基酸顺序上可能不一致，但是
多肽类抗生素
多肽类抗生素：具有多肽结构特征，其包括多粘菌素类（多粘菌素B、多粘菌素E）、杆菌肽类（杆菌肽、短杆菌肽）和万古霉素。 具有多肽结构特征的一类抗生素。包括多粘菌素类（多粘菌素B、多粘菌素E）、杆菌肽类（杆菌肽、短杆菌肽）和万古霉素 多粘菌素类：大多数革兰氏阴性杆菌有较好抗菌作用，对革兰氏阳性菌无效 杆菌肽及短杆菌肽：均是由肽链连结的氨基酸组成，两种抗生素对大部分革兰氏阳性细菌有高度抗菌活性；对革兰氏阴性杆菌则完全无效；为这两种抗生素均有严重肾脏毒性 万古霉素：对革兰氏阳性菌具有强大的抗菌作用 多肽类抗生素属杀菌剂，其抗菌谱窄，但具独特的抗菌作用，且细菌一般不易产生耐药性，长期用于敏感菌所致的感染包括严重感染、院内感染、耐药菌感染、免疫缺陷者感染其疗效确切，是抗感染疗法的重要药物。然而，大多数品种的毒性较突出，尤以肾毒性为显著，故临床适应证严格，一般不作为首选药。 多肽类药物的优势是：它属于蛋白类药物，来源于自然，生物活性高，在人体内不结存，无副作用。其劣势是在体内降解快，稳定性低，给药途径有限制，水溶性较差，生产成本高。多肽类抗生素具有抗菌、抗肿瘤、促进创伤面愈合等多种生物学特性，尤其是替代广谱高效抗菌医药的开发潜力巨大。
多肽类抗生素从多粘杆菌或产气孢子杆菌的培养液中提取制得。常用的多肽类抗生素有多粘菌素B、多粘菌素E、杆菌肽（枯草菌肽）、万古霉紊（凡可霉素）等。 多肽类抗生素中，不同的抗生素所具有的抗菌作用不同，可分别对抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、绿脓杆菌、真菌、病毒、螺旋体、原虫的感染，对败血症、呼吸道感染、泌尿道感染、牛乳腺炎等疾病有较好的治疗作用。小剂量时抑菌，大剂量时杀菌。多肽类抗生素的作用机理也各不相同，多粘菌素类可改变细菌胞浆膜的功能，而杆菌肽则作用于细胞壁和细胞质。多肽类抗生素的最大优点是细菌不易产生耐药性，但缺点为毒性较大，除对细菌细胞膜损伤外，对动物细胞膜也起作用，主要对肾、神经系统有一定毒性。 下面介绍几种常用的多肽类抗生素的使用方法： （1）硫酸多粘菌素B：本品为白色或淡黄色粉末，无臭或带有微臭。易溶于水，在PH值为5．7～7．5时的水溶液最稳定，在碱性液中不稳定。主要对革兰氏阴性杆菌有较强的杀伤作用，临床上主要用于绿脓杆菌等敏感菌引起的肺部、泌尿系统感染及败血症等病症。用法用量为：肌内注射，一日量，每1公斤体重马、牛、猪、羊1万单位，分2次注射；牛乳室灌注每乳室5～10万单位；牛子宫灌注10万单位。 应注意按兽医推荐剂量使用，否则使用剂量较大可引起肾脏损害及神经系统功能紊乱等。另本类抗生素内服不吸收，不能用于全身感染。肌内注射也吸收不良。 （2）硫酸多粘菌素E（硫酸粘菌素、硫酸抗敌素）：本品为白色或微黄色粉末，微臭，味苦，易溶于水，在酸性溶液中稳定。本品对大多数革兰氏阴性杆菌有较强的抗菌作用，特别是对绿脓杆菌作用效果更为显著，主要用于绿脓杆菌、大肠杆菌引起的呼吸道感染、泌尿系统感染、败血症等病症，细菌一般对本品不产生耐药性，但本品与多粘菌素B之间有交叉耐药性。使用方法和剂量为：肌肉注射，一日量，每1公斤体重马、牛、猪、羊1万单位，分2次注射。 本品不宜与氨基甙类抗生素联用，因联用可导致神经系统中毒而产生肌无力和呼吸暂停的危险；不宜与磺胺嘧啶钠、碳酸氢钠、氢化可的松、细胞色素C、氯霉素等配伍，以免产生沉淀或降效。 （3）杆菌肽：是由一种苔藓样杆菌所产生的多肽类抗生素。为白色或淡黄色粉末，无臭或微臭，味苦，有吸湿性。易溶于水，但水溶液在室温很快变质失效。故加锌使成杆菌肽锌，并制成1克中含杆菌肽锌100毫克（4000单位）或1克中含杆菌肽锌150毫克（6000
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用
噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用 1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd 作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白——D蛋白融合而被展示。2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质[6]。3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直
大环内酯类简介
具有大环内酯的一类抗生素，多为碱性亲脂性化合物。对革兰氏阳性菌及支原体抑制活性较高。大环内酯基团和糖衍生物以以苷键相连形成的大分子抗生素。由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素。 目前沿用的大环内酯类有红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、柱晶白霉素。大环内酯类新品种（新大环内酯类）有阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素等，其对流感嗜血杆菌、肺炎支原体或肺炎衣原体等的抗微生物活性增强、口服生物利用度提高、给药剂量减小、不良反应亦较少、临床适应证有所扩大。 广义的大环内酯类抗生素系指微生物产生的具有内酯键的大环状生物活性物质，其中包括一般大环内酯(狭义的大环内酯)、多烯大环内酯、安莎大环内酯与酯肽等。 一般大环内酯分为一内酯与多内酯。常见的一内酯有：十二元环大环内酯类抗生素(如酒霉素等)、十四元环大环内酯类抗生素(如红霉素等)和十六元环大环内酯类抗生素(如柱晶白霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素及交沙霉素等)，至今最大者已达六十元环，如具有抗肿瘤作用的醌酯霉素A1，A2，B1。多内酯中二内酯有：抗细菌与真菌的抗霉素、稻瘟霉素、洋橄榄霉素、硼霉素等。 适应证 1. 红霉素（含琥乙红霉素、依托红霉素、乳糖酸红霉素）等沿用大环内酯类： （1）作为青霉素过敏患者的替代药物，用于以下感染：①β溶血性链球菌、肺炎链球菌中的敏感菌株所致的上、下呼吸道感染；②敏感β溶血性链球菌引起的猩红热及蜂窝织炎；③白喉及白喉带菌者。 （2）军团菌病。 （3）衣原体属、支原体属等所致的呼吸道及泌尿生殖系统感染。 （4）其他：口腔感染、空肠弯曲菌肠炎、百日咳等。 麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素及交沙霉素，主要用于革兰阳性菌所致呼吸道、皮肤软组织、眼耳鼻喉及口腔等感染的轻症患者。 新品种 除上述适应证外，阿奇霉素可用于军团菌病，阿奇霉素、克拉霉素尚可用于流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌所致的社区获得性呼吸道感染，与其他抗菌药物联合用于鸟分枝杆菌复合群感染的治疗及预防。克拉霉素与其他药物联合，可用于幽门螺杆菌感染。 注意事项
环肽的合成方法及技巧
环肽的合成方法(1) 多肽药物在治疗上的重要性，越来越引起广大药学工作者的重视。根据肽链的构成可将多肽分为同聚肽（Homomeric）和杂聚肽（Heteromeric）两大类，前者完全由氨基酸组成，后者是由氨基酸部分和非氨基酸部分组成的，如糖肽。根据肽键的结构又分为直链肽和环肽。其中直链肽的研究最为广泛和深入，尤其在直链肽的合成技术方面无论是液相法还是固相法都已成熟。虽然许多直链肽体外具有很好的生物活性和稳定性，但是进入体内后活性很快消失。因为体内环境复杂，存在各种各样的酶。直链肽在酶的作用下很快降解，导致活性丧失[1-2]。另外，直链肽在液相里的构象柔性使得不大容易符合受体的构象要求。这些不利因素造成多肽药物仍有许多问题有待解决。为了得到生物活性优秀半衰期长，受体选择性高的多肽，文献报道过很多多肽改造的方法，其中包括将直链肽改造成环肽[3-8]。这种大环分子具有明确的固定构象[9]，能够与受体很好地契合，加上分子内不存在游离的氨端和羧端使得对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低[10-12]。一般地说，环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽[13]。鉴于环肽的诸多优点，近年来对多肽研究的热点已转移到环肽的合成和生物评价上。 根据环肽的环合方式又分为首尾相连环肽（Head-to-tail）、侧链和侧链相连环肽(Sidech ain-to-sidechain)[14]、侧链和端基相连环肽（Sidechain-to-end）[15]、含二硫桥的环肽（D isufide-bridge）[16-18]、以及含有其他桥连结构的环肽[19-23]。从合成方法上讲，首尾相连的环肽的合成难度最大。因为环肽的前体-直链肽的肽键具有很强的p键特征，分子更偏爱形成反式构象，呈舒展状态，造成属于反应中心的端基的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内缩合反应，有利于分子间缩合。 首尾相连的环肽通常是N端和C端游离的直链肽在稀溶液中（10-3~10-4M）由羧基和氨基形成酰氨键来合成。直链前体中的氨基酸种类和数目对成环的难易程度和环肽的收率起着至关重要的作用。甘氨酸、脯氨酸或D-构型氨基酸具有诱导b-转角（b-Turn）的作用，常被认为可增加成环的可能性和收率[24-25]。 1. 合成首尾相连环肽的经典方法 合成首尾相连环肽的经典方法是在稀溶液(10-3~10-4M) 中，将保护的线性前体选择性地活化并环合。常用活泼酯法和迭氮法。 1.1 活泼酯法 活泼酯法中活化羧基和环合反应是分两步进行的。活泼酯相对很稳定，一般不需要纯化可直接用于环合反应。几乎所有可用于偶联反应的活泼酯都可用于合成环肽，主要有对硝基酚酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酯和2,4,5-三氯苯酚酯。线性多肽的C端羧基与对硝基酚、N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚或2,4,5-三氯苯酚，在DCC或其他缩合剂存在下，于低温反应，很容易得到相应的活泼酯。这种N端通常带有BOC或Z保护的活泼酯在酸性条件下脱去保护基，形成活泼酯的氢卤酸盐，在弱碱性稀溶液中，如在吡啶，DMF或二氧六环一类介电常数较大的溶剂中，保持pH 8~9，加热（60~100°C）或室温搅拌数小时至数日，最终可得到环肽。 1.1.1对硝基酚酯法 对硝基酚酯法合成环肽的通式如Scheme 1[26]
多肽类抗生素论文
多 肽 类 抗 生 素 的 进 展 和 应 用 学院：专业：姓名：学号:
多肽类抗生素的研究进展及其应用 摘要多肽抗生素是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽, 一般具有抗细菌或真菌的作用。按照化学结构的不同, 多肽抗生素可分为5 类: 具有螺旋结构的线性多肽;富含某种氨基酸的线性多肽; 含有一个二硫键的多肽; 含有两个或两个以上二硫键的多肽; 羊毛硫抗生素。根据作用机理的不同, 多肽抗生素又可分为裂解细胞膜的裂解肽和非裂解肽。多种动物的免疫系统中都含有多肽抗生素。这些多肽抗生素具有广泛的抗菌谱多肽。抗生素已经开始用于医药、食品和植物抗病基因工程等方面, 并且有着很大的发展潜力。 关键词：多肽抗生素; 自然免疫; 研究进展败血症裂解肽; 作用机理 ABSTRACT As for the μopioid receptor, there are some disputes about the domains involved in the selective recognition of ligands, the relative spatial orientation of the amino acids within the T M affect the affinities of selective lig ands. Regulation of opioid receptor activities does not appear to involve in their ability to promote the association of GTP onto the G proteins and the subsequent dissociation of heterotrimers. It is not very clear if phosphorylation correlates with agonist- induced receptor desensitization. The celluar processing of μ opioid receptors requires
大环内酯类抗生素
吴萌萌 2120100855 微生物专业 大环内酯类抗生素研究进展综述 摘要 大环内酯类抗生素是近年来临床常用的一类处方药。改善耐药性、扩展抗菌谱、增加抗菌活性依然是大环内酯类杭生素研究的主攻方向。而近年来的研究主要集中于寻找抗耐药菌并能扩大抗菌谱的新化合物, 包括酮内酯类、酸内酯类、脱水内酯类等新品种的开发与临床应用。研究发现包括细胞穿透作用、促胃肠动力作用、抗肿瘤作用、防治心血管疾病等抗菌以外作用等临床新应用。新型高效的大环内酯类杭生素将不断涌现, 临床应用也在不断拓展。本论文将着重介绍第三代大环内酯类抗生素的作用机理和临床应用。 关键词：大环内酯类；抗生素；机理；临床应用 Abstract Macrolide antibiotic is a kind of prescription drugs used clinically in recent years.Improving drug tolerance,expanding antibacterial spectrum,increasing antibiosis activity will be the major direction in macrolide antibiotic research.In recent years,researcher focus their attention on finding drug tolerance bacterium and compounds to expend antibacterial spectrum,which include ketone lactones,acid lactones and dehydration lactones.Nowadays,new findings exclude antibiosis,include cell penetrates function, promoting gastrointestinal function, antitumor function, preventing cardiovascular diseases and so on were applied in clinical trial.The high-efficient macrolide antibiotic will spring up.Now,I will place emphasis up on introducing mechanism and clinical practice of the third generation macrolide antibiotic. Key words:Macrolide; Antibiotic; Mechanism; Clinical practice 引言 大环内酯类抗生素是近年来临床常用的一类具有共同化学结构和相近抗菌作用的抗菌药。按其大环结构含碳母核的不同，可分为14，15和16元环大环内酯类抗生素，是一组庞大的抑制蛋白质合成的快速抑菌药。在市场需求的推动下，该类药物与头孢菌素、氟喹诺酮、半合成青霉素构成了抗生素市场的鼎足之势。大环内酯类抗生素主要作用于需氧革兰氏阳性菌和阴性球菌、厌氧菌，以及军团菌、胎儿弯曲菌、衣原体和支原体细菌等，在临床治疗中发挥了重要作用。大环内酯类抗生素的经典药物红霉素及其衍生物经过不断发展，已由第一代发展到第三代品种。 1.大环内酯类抗生素发展概况
多肽合成
多肽合成技术 多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，Fred Sanger发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel 化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍 多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因
噬菌体随机肽库_中文说明书_phage_display
目录 简介 (2) 培养基和溶液 (5) 常规M13方法 (6) 淘选程序（固定靶分子） (8) 结合克隆的特征 (12) 其他淘选方法（液相结合法） (15) 其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16) 附录：优化肽结合相互作用 (19) 文库的氨基酸分布 (21) 试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）： ?随机十二肽噬菌体展示文库100 μl, 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度~2.7×109个转化子。 ?-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/μl ?-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/μl, 1 pmol/μl ?E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。 ?链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg ?生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。 概述 噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因
多肽合成技术
精心整理 多肽合成技术多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，EmilFischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，FredSanger 发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield 提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，LouCarpino首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍 多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln，Thr，Tyr。
2019年继续教育公共课好医生《抗菌药物临床应用指导原则》答案
（）可用于治疗重症或伴血流感染的尿路感染患者C、碳青霉烯类 （）是新大环内酯类抗生素E、阿奇霉素 （）是最常见的社区获得性感染A、急性上呼吸道感染 （）与氟胞嘧啶联合治疗隐球菌脑膜炎时，前者的剂量可适当减少，以减少其毒性反E、两性霉素B （）与异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇联合是各型肺结核短程疗法的基石B、利福平 BSI肺炎链球菌对（）耐药者多见，需注意药敏试验结果D、红霉素或克林霉素 艾滋病患者隐球菌性脑膜炎的首选药物是（）E、氟康唑 氨基糖苷类的抗结核药是（）A、链霉素 氨基糖苷类抗生素不宜与呋塞米合用的原因是（）A、呋塞米增加其耳毒性 氨基糖苷类药物的不良反应不包括（）C、肝毒性 百日咳的治疗药物首选（）D、红霉素 不属于时间依赖性杀菌剂的是（）D、阿奇霉素 初治菌阳/或菌阴结核疗程一般是（）个月E、6 达托霉素为（）抗菌药物E、环脂肽类 大环内酯类（）禁止与特非那定合用，以免引起心脏不良反应B、克拉霉素 滴虫阴道炎的宜选药物是（）C、甲硝唑 对多黏菌素类药物，错误的描述是（）E、快速杀菌剂 对磺胺类药物不敏感的细菌是（）B、立克次体 对青霉素过敏的细菌性脑膜炎病人，可选用（）B、氯霉素 对庆大霉素的描述，下列说法错误的是（）C、耐药菌少 对尚未发生侵袭性真菌感染的高危患者进行（）A、预防性治疗 对厌氧菌无效的药物是（）A、克林霉素 对厌氧菌无效的药物是（）A、克林霉素 对于实施隧道式血管导管或药盒置入术的患者，建议（）A、不推荐预防用药 对于实施下腔静脉滤器植入术的患者，关于预防性应用抗菌药物的建议是（）B、不推荐常规预防使用抗菌药物 对于实施主动脉内支架植入术的高危患者，建议预防性使用抗菌药物（）次A、1 对于头霉素类药物的适应证描述错误的是（）B、大肠埃希菌等肠杆菌科细菌、拟杆菌属等需氧菌引起的腹腔感染 多黏菌素类药物适用于以下哪类感染（）D、铜绿假单胞菌 复杂性血流感染需全身使用抗菌药物（）E、4～6周 肝病时避免应用以下哪种抗菌药物（）C、两性霉素B 肝功能减退的患者在应用林可霉素时，应（）E、肝病时减量慎用 革兰阴性杆菌脑膜炎疗程至少为（）D、4周 钩端螺旋体病治疗时为避免治疗后出现（），初始治疗阶段抗菌药物的剂量宜小C、赫氏反应 钩端螺旋体中、重度感染可选头孢曲松（）g，静脉滴注，qdE、1 关于白喉抗毒素说法正确的是（）A、青霉素不可代替白喉抗毒素 关于达托霉素，以下说法正确的是（）E、不可用于治疗肺炎，因其可被肺泡表面活性物质灭活 关于对氨基水杨酸，下列描述错误的是（）E、严重肾病者可使用本药 关于感染性心内膜炎的治疗原则叙述有误的是（）B、根据病原选用杀菌剂，应单一用药