SDS-PAGE凝胶电泳操作

一、常规试剂的配制

1.30%聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺150g ,甲叉双丙烯酰胺4g,双蒸水500ml,滤纸过滤后，棕色瓶避光4 C保存；

2.L，pH Tris-HCI 分离胶缓冲液：Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4 C 保存；

3.L, pH Tris-HCl 分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4 C

保存；

4.10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；

5.10% AP溶液：AP （过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；

6.1X SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris （L），192mM甘氨酸（L ），%SDS（ 1g/L ），pH ;

7.染色液：考马斯亮蓝R-250 溶解于45ml 甲醇，45ml 水，10ml 冰醋酸，过滤除去杂质；

8.脱色液：45ml 甲醇，45ml 水，10ml 冰醋酸；

9.固定液：50ml 甲醇，40ml 水，10ml 冰醋酸；

10.2X SDS-PAGEh样缓冲液：10%SDS，Tris-HCl （pH ），甘油，1% 溴酚兰10 卩L，3 - 疏基乙醇100卩L，加水定容至1ml，分装后-20 C保存。

二、样品的处理

1.蛋白含量较低的酶制剂或原料样品

（1 ）粉剂（或颗粒）样品

称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解仆（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心

上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤

液吹干，加入适量（1-3ml ）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。

（2）液体样品

液体样品经离心后，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去

离心上清液，用70%勺丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml ）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。

2.蛋白含量相对较高勺酶制剂或原料样品

（1 ）粉剂（或颗粒）样品

称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解仆（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液用于电泳实验。

（2）液体样品

液体样品经离心后，取离心上清液用于电泳实验。

3.未知样品

对未知样品进行归类（是否为酶制剂，是哪一类酶），根据已知电泳图谱确定该类物质

能跑出清晰电泳条带的蛋白浓度范围，在对未知样品进行电泳实验前，测定其蛋白含量，根

据其结果进行适当处理。

三、凝胶的配制

1.设备检漏

将电泳玻璃板按顺序装好并固定，在电泳玻璃板间注满蒸馏水，静置15-20min，观察是否有水浸出，若无则进行下一步操作，反之，则拆除进行重新安装，并重复检漏至无液体

浸出。

注：如样品数量不多，一块凝胶板就已足够，则另一边使用凝胶隔板，防止跑胶时短路。

2.分离胶的制备

根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳

将检漏的蒸馏水倒出，按下表进行SDS-PAGE分离胶的配制（使用凝胶试剂盒）

注：如室温高于30 C，可适量减少TEMED30-50%防止胶过快凝结;

如室温低于20C，可适量增加TEMED30-50%防止胶过慢凝结。

常用分离胶的浓度为10%按上表进行配制，所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，迅速进行注胶，注胶过程要平稳，避免产生气泡，注胶完成后用蒸馏水进行水封（水封的目的是

为了使分离胶上延平直，并排除气泡，且防止氧化），凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形

成清晰的界面。

3.浓缩胶的制备

分离胶制备完成后，静置60-90min，确保分离胶凝结完全后，倒出水封液体并用滤纸

把剩余的水分吸干，按下表进行SDS-PAGE浓缩胶的配制。

所有试剂加入烧杯中，充分混匀后，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样

梳（样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平），静置40-60min。

4.制样

吸取经预处理后样品25 ^1与25 ^1上样缓冲液混合均匀后，于沸水煮3-5min去掉亚

稳态聚合，冷却后4000rpm离心4min。

5.上样

浓缩胶凝结后，向上槽内倒入适量电泳缓冲液，拔出样梳（要使锯齿孔内的气泡全部排

出，否则会影响加样效果），向每孔内加样10卩I （加样时移液枪要始终竖直，且加样迅速，为避免边缘效应，最好选取中部孔注样）。

6.跑胶

加样完成后，在电泳槽内加入适量电泳缓冲液，连接好冷凝水，接通电源，进行电泳，

稳压90V，电泳90min左右，进入分离胶后，电压改为120V,待溴酚蓝距凝胶边缘约5mm 时，停止电泳。

7.凝胶板剥离与固定

电泳结束后，取开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内（剥胶时要小心，将凝

胶保持完好），用蒸馏水小心清洗1-3次，加入固定液进行固定40-60min，倒出固定液，蒸馏水清洗3-5次。

8.染色

固定清洗结束后，倒入染色液，染色40-60min。

9.脱色

染色结束后，蒸馏水清洗3-5次，倒入脱色液进行脱色，30-60min后更换1次脱色液

后，脱色至蛋白条带清晰即可。

10. 清洗

电泳结束后，将电泳玻璃版及烧杯仔细清洗，并用蒸馏水进行漂洗后，归

将电泳所用物品置原位。