2021年环状RNA在心血管疾病中的研究进展(全文)
2021年环状RNA在心血管疾病中的研究进展（全文）
心血管疾病（CVD）在世界上是人类的主要杀手，也是导致我国居民死亡的主要非传染性疾病之一。我国目前有冠心病患者约1100万人，每年行冠状动脉（冠脉）介入的患者已超过50万例，而且冠心病的发病率和致死率正呈持续上升趋势，给我国经济和社会的持续发展带来沉重负担。冠心病的发生是环境和遗传因素共同作用的结果，是一系列基因异常表达导致的复杂病理生理过程。
血管发生病变是引起冠心病发生和死亡的主要原因，内皮功能障碍是引起血管疾病的关键因素，而增殖、迁移和平滑肌细胞的表型转换是血管疾病发生的进一步标志。炎症细胞通过释放分泌的生长因子和细胞因子，以及对损伤永久反应的细胞间的相互作用进而加重血管疾病的发生。在经典的基因表达模型（中心法则）中，由基因组所编码的基因脚本以RNA 分子的形式表达于每一个细胞中，每一个RNA分子由线性的化学"碱基"串联组成。人类基因组计划产生的大量数据显示，人体中具有编码蛋白质功能的基因仅占总基因组序列的1％，其余的序列转录产物均为不具有蛋白质编码功能的RNA，经典中心法则中对RNA的定义正逐渐被完善。近年来，非编码RNA（non－codingRNA，ncRNA）已成为分子生物学领域的研究热点。最近的研究发现，非编码RNA作为表观遗传学的重要内容，在基因表达调控、细胞生长发育、疾病发生发展中发挥了重要作用。
研究发现，非编码RNA与血脂异常、动脉粥样硬化、血栓形成、心力衰竭等心血管疾病关系密切，不仅可作为疾病的生物学标志，还有可能作为分子靶向药物用于疾病的治疗[1－3]。非编码RNA包括微小RNA （microRNA，miRNA），长度大于200nt的长链非编码RNA（long non －coding RNA，lncRNA），以及环状RNA（circular RNA，circRNA），一种通过反向剪接形成的环形lncRNA的特殊亚型[4]。科学家们在装满古怪RNA的匣子中看到最新的玩意：天然生成的环状RNA分子影响了基因表达。
环状RNA是一类广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中，具有调控基因表达作用的内源性非编码RNA。目前研究表明，circRNA在心肌细胞的分化过程，起到十分关键的作用，并在许多心血管疾病中扮演重要的角色[5]。最近几年关于circRNA的研究有许多进展，本文从以下几方面对circRNA进行综述。
一、环状RNA的发现和特征
（一）环状RNA的发现
越来越多的研究发现，遗传因素和表观遗传学因素对心血管疾病的进展有着重要影响。目前，非编码RNA已成为研究心血管疾病及相关异常
发生发展机制的新热点，既往普遍认为circRNA表达丰度低，很可能是在剪接中错误表达。在二十年前，科学家们将从植物类病毒、酵母线粒体以及乙型肝炎病毒中鉴定的circRNA视为异常剪切后产生没有调控功能的副产物。随着生物信息学新测序方法发展，circRNA逐渐被重新认识，并在几个生物体进行检测和调查，通过高通量测序和新颖的计算方法说明了他们广泛大量的存在于真核细胞转录组内。circRNA是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA 外切酶影响，表达更稳定且不易降解，已被证明广泛存在于多种真核生物体内，且具有调控基因表达的作用，在各种细胞进程中扮演重要角色。随着转录组学基因测序技术的发展，近年来的研究表明，circRNA在动物细胞、植物细胞、原生动物、真菌及古生菌中均有大量表达，可能是真核生物基因表达程序进化过程中古老且保守的一部分。近几年来，多个研究小组发表了有趣的结果，揭示了circRNA的生物发生及其可能的机制。
（二）环状RNA的结构特征
circRNA是一类3’端和5’端相接的闭合式非编码RNA，和传统线性RNA含有5’帽子和3’多聚A尾不同，circRNA是通过前体RNA首尾反向剪接形成。circRNA根据其来源可分为三类：外显子来源的circRNA （exonic circRNAs），内含子来源的circRNA（circular intronic RNAs）以及由外显子和内含子共同组成的circRNA（retained－intron circRNAs）。环状RNA通过已知RNase P RNA合成，一些sno RNA
和16s，23s rRNA通过3′－5′连接环化形成环状的RNA加工中间体[6]。有了这一发现，circRNA现在被分为许多组，到目前为止所有类别都是通过剪接过程生物合成的。
根据目前研究结果，反向剪接所形成的circRNA具有如下特点：首先，circRNA呈共价闭合环状结构，不具有3’末端和5’poly A尾，因此不易被RNA核酸外切酶或RNase R降解，相对于线性RNA，其具有更高的稳定性；其次，circRNA种类繁多，在一些情况下，circRNA的丰度是相应的线性mRNA的10倍以上，是比mRNA丰度更高的主要转录本[7]；再次，circRNA大部分是由外显子组成的，少数来源于内含子或内含子片段，主要存在于细胞质中。然后，circRNA的吸附作用预示着miRNA 靶标多态性显著减少，一些来自内含子或具有内含子的外显子的circRNA “保留”于外显子之间并且主要位于真核细胞的细胞核中可以调节基因表达[6]。外显子来源的circRNA表现出许多作用：比如参与调节线性剪接，过度结合蛋白质并且调节它们的活性，以及作为miRNA海绵结合miRNA 从而抑制miRNA的表达。大多数circRNA由外显子构成且主要存在于细胞质中，暗示其可以被装载到核糖体中翻译成多肽。因此，从传统上讲，circRNA不参与翻译，然而仍有很小的一部分有编码蛋白质的潜能，这是众所周知的一小部分circRNA的功能，除此之外，circRNA还具有较强的物种保守性。总而言之，这些特征提示circRNA具有在转录和转录后水平发挥重要作用并在疾病诊断中成为理想生物标志物的潜能。
二、环状RNA的作用机制
过去曾认为环状RNA是剪接异常的产物，本身不具备功能，但近期研究发现，环状RNA主要在miRNA海绵、转录调控、结合蛋白等多个方面发挥作用。由于circRNA具有丰富的进化保守性，因此已经预测了circRNA的几种潜在功能。
（一）miRNA海绵
除了小部分通过内含子环化产生的circRNA位于细胞核中，大部分的circRNA主要定位于细胞质中。近年来，有大量的研究发现定位于细胞质中的circRNA可以和mRNA竞争miRNA的靶向结合位点，从而调控mRNA的表达。胞浆中的circRNA包含miRNA结合位点，称作miRNA 的应答元件（MRE），这使得circRNA可作为竞争性、内源性RNA（ceRNA）发挥作用，因此circRNA的存在或不存在会影响miRNA的活性。circRNA 可以竞争性结合到miRNA上，从而导致miRNA分子的减少，因为miRNA 对它们的靶基因有抑制作用，所以当miRNA被circRNA海绵吸附时，它对靶基因的抑制作用会得到缓解。circRNA含有多种miRNA的MRE，同时对于单个miRNA也有多个结合位点，因此，circRNA能够瞬间结合大量miRNA，从而高效地发挥其调控作用。
鉴于circRNA调节miRNA的活性并因此影响miRNA的靶标调控，研究circRNA与其配偶miRNA的相互作用为了解某些疾病的发展过程提供了新的方向。
（二）调节细胞转录和翻译
circRNA可以释放进入胞浆，甚至可以在细胞外作为生物标记物发挥作用。然而在很小的程度上，一部分circRNA仍存在于细胞核内，这些核circRNA可以与宿主基因启动子区域的RNAPol II发生反应并调节转录。circRNA可以通过多种途径调节细胞转录，大多数circRNA和EIcircRNA 存在细胞核中，而且不含有许多miRNA结合位点，这提示circRNA和EIcircRNA有着不同于circRNA的作用机制[8]。EIcircRNA可以通过RNA －RNA作用招募U1小RNA蛋白复合物（U1 snRNP），EIcircRNA－U1 snRNP复合体能和真核聚合酶II复合体结合，从而促进亲本基因的表达，亲本基因的表达也能够促进EIcircRNA的生成，从而形成正反馈作用。
（三）蛋白质海绵
circRNA不仅有miRNA结合位点，同时也可通过RNA介导间接与蛋白质发生关联，作为蛋白质海绵发挥作用，影响蛋白质功能，当circRNA 绑定它们的靶蛋白时，会抑制相应蛋白的功能。circMBL是由剪接因子muscleblind（MBL）的第二个外显子通过MBL蛋白相互配对环化形成，circMBL序列中包含有许多MBL蛋白结合位点，可以和MBL蛋白结合并
发挥作用[9]。当MBL蛋白表达过多时，可以结合在RNA两侧的内含子上，导致RNA环化形成circMBL，同时线性转录表达的MBL蛋白水平下降，生成的circMBL结合MBL蛋白，又降低MBL蛋白在细胞内的水平，从而抑制MBL蛋白的作用，究其原因可能是形成自身的负反馈系统，从而调节MBL蛋白在细胞中的水平。
（四）蛋白质编码
外显子circRNA含有翻译序列即开放阅读窗，所以有潜在的翻译功能。研究表明，当RNA分子中含有内源核糖体进入位点（IRES）或原核核糖体结合位点时，即可以从circRNA中翻译出多肽，对于要翻译成蛋白质的基因，翻译起始复合物的形成是至关重要的，该复合物的合成需要识别mRNA的5′末端的5′－帽子结构。由于circRNA没有5′－帽子结构，因此通常不编码蛋白质，然而最近报道表明，人类肌肉细胞中的circZNF609[10]可以编码蛋白质，这种环状RNA都能够与核糖体相互作用，并以不依赖5’－帽子的方式编码蛋白质。Yang等人解释了5′－帽子非依赖性蛋白质编码的机制，指出这是发生在circRNA起始密码子附近的N6－甲基腺苷（m6A）修饰的结果，这种m6A修饰可以作为内部核糖体进入位点（IRES）并导致翻译起始[11]，另外，还确定了许多circRNA与多核糖体之间的联系。这些对circRNA蛋白编码能力及其进一步表征的新见解可能最终揭示了大量迄今未被鉴定的蛋白质种类，并揭示它们参与的
过程，因此越来越清楚的是，除了最初提出的ncRNA的调控作用外，circRNA还可能代表一种新型的蛋白质编码RNA。
三、环状RNA和心血管疾病的关系
随着研究的深入，circRNA在各种生命活动中都显示出其不可忽视的功能，circRNA的表达具有组织细胞以及发展阶段特异性。已经有大量的研究发现circRNA的表达影响着细胞的发展，包括增值、分化、凋亡、衰老等细胞事件，以下就根据circRNA与心血管系统的关系进行探讨。
（一）环状RNA与心脏发育
由于先进的测序技术和数据分析方法，已经在人类和小鼠心脏中识别出越来越多的circRNA[12]。对人心肌组织进行高通量检测发现超过上万种的circRNA，其中富集最多的是定位在胞浆中的circ SLC8A1－1，仅最长的转录本TTN产生了超过415种不同的外显子circRNA。另有研究表明，在对人、小鼠、大鼠心脏组织进行测序分析和实验检测中发现，有很多circRNA来源于肌联蛋白（titin，Ttn）的基因，Ttn参与着心脏成熟的选择性剪接，在新生和成年大鼠心脏中发现了Ttn来源的circRNA的差异性表达，提示circRNA的形成可以调节Ttn剪接。除了Ttn，兰尼碱受体（ryanodine receptor 2，RYR2）基因在人的心脏中可以表达出超过100种的circRNA，所以心肌中高表达的circRNA的存在为后续研究奠定了基础。
最近研究表明，选择性剪接不仅可以调节心脏发育，其反向剪接也可以在心脏发育过程中起关键作用[5]。随着研究进展，大量circRNA逐渐被发现，部分circRNA参与调控心血管疾病的发生及发展过程，不同心血管疾病中的circRNA表达量有显著差异，进一步研究这些circRNA的功能及发病机制，可能为心血管疾病的治疗提供新的靶点。
（二）环状RNA与血管发育
circRNA在胚胎发育中的作用延伸到血管发育，缺氧是血管生成的关键诱导因素，锌指结构域的转录因子（ZNF292）在内皮细胞中表达水平高，但其在内皮细胞中的生理功能尚不清晰[13]。
一项研究发现，hsa_circ_000595在缺氧主动脉平滑肌细胞中显著上调，在人主动脉平滑肌细胞中沉默hsa_circ_000595可发挥miR－19a的调控作用，从而抑制细胞凋亡[14]。据报道，hsa_circ_0003575在氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的脐静脉内皮细胞中明显上调，沉默
hsa_circ_0003575可促进细胞增殖和血管生成，该研究提示circRNA在血管内皮细胞损伤诱导的动脉粥样硬化中具有重要调控作用[15]。
（三）环状RNA在心肌梗死中的作用
心肌梗死（MI）是冠状动脉急性闭塞引起的，在心肌梗死发展过程中，长时间的心肌缺血参与心肌细胞的凋亡过程，导致心肌细胞的丢失，由缺血应激引起的瘢痕形成和病理性左心室重构促使心功能不全，最终导致心力衰竭。心肌细胞具有终末分化特征，细胞疗法在修复心肌梗死损伤后心肌细胞丢失方面已引起高度重视。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，在急性心肌梗死过程中对心肌细胞的损失有很大的贡献，因此人们还努力探索心肌细胞凋亡丢失的分子机制，然而心肌梗死后心肌细胞凋亡的机制尚不完全清楚。
心肌梗死及并发症是社会与医疗保健体系巨大的经济负担，虽然大量研究证实心脏干细胞移植到缺血心脏后可改善心功能[16]，但其治疗心肌梗死仍处于初级阶段，因而对心肌梗死发生机制的研究以及找到更多的治疗手段极为重要。Wu等[17]使用微阵列分析，发现了63种候选circRNA，包括circRNA CDR1as，它在小鼠正常心肌组织和由心肌梗死所导致心衰的心肌组织中差异性表达。同时，Geng等另一项研究也报道了circRNA CDR1在心肌梗死损伤中的作用机制，在心肌梗死和缺血受损的心肌细胞中，CDR1as的表达水平随心肌梗死面积的增大而上调，miR－7a的表达下调，而miR－7a的靶基因PARP、SP1可在CDR1as的调控下表达增强，过表达的CDR1as可使PARP、SP1的表达上调，心肌梗死面积增大，由此推测CDR1as可能通过海绵作用抑制miR－7a的活性，由此导致miR －7a的靶基因过表达，进而促进细胞凋亡[18]。
（四）环状RNA在心肌病中的作用
心肌病包括肥厚型心肌病和扩张型心肌病，是一种影响心肌的心脏病理学表现。当左心室心肌变得比正常情况更厚时，会发生肥厚型心肌病（HCM），导致舒张期充盈不完全，这最终会导致心力衰竭和死亡；当左心室或右心室受损时发生扩张型心肌病（DCM），可导致心室扩张、心力衰竭和死亡。Wang等报道，心脏相关的circRNA HRCR具有预防心肌肥厚和心力衰竭的作用[19]，在该研究中，当小鼠注入异丙肾上腺素并经受主动脉缩窄手术时，HRCR表达被下调。通过使用生物信息学预测和AGO2免疫共沉淀分析，该研究证明HRCR与miR－223相互作用，在细胞质中保留该miRNA，并抑制miR－223的促肥大活性。Khan等[20]另一项研究证实心肌病间的异常circRNA剪接事件，通过对来自肥厚型心肌病和扩张型心肌病患者的心脏样本进行测序分析，作者找到了800多个反向剪接点，他们使用qRT－PCR验证了测序结果，并确认10种外显子钙/钙调素依赖性蛋白激酶2δ（Camk2d）和Ttn基因的circRNA与心肌病相关，Camk2d的circRNA在肥厚型心肌病和扩张型心肌病患者中均下调，而Ttn基因的circRNA仅在扩张型心肌病中下调，这些circRNA可能在心肌病中起重要作用。
（五）环状RNA在心肌纤维化中的作用
心肌纤维化是指间质性心肌胶原网络中的多种定量和定性变化，这些变化是针对心脏缺血性损伤，全身疾病，药物影响循环系统或心脏本身的其他有害刺激而发生的，心肌纤维化改变心肌的结构，促进心脏功能障碍的发展，也诱发心律失常，影响心力衰竭患者的临床过程和结果[21]。心肌纤维化可作为多种心脏疾病发生的部分发病机理，例如心肌梗死和糖尿病，有研究工作提示，circRNA可参与心肌纤维化的调节。Zhou等[22]研究糖尿病小鼠心肌组织中的circRNA表达谱，发现43个circRNA异常表达，包括24个上调的circRNA和19个下调的circRNA，在Ang II处理的糖尿病小鼠心肌成纤维细胞中，发现circRNA_010567显著上调。生物信息学分析预测circRNA_010567可吸附miR－141，抑制miR－141的表达，并通过双荧光素酶活性实验进行了验证，功能实验表明，沉默circRNA_010567可上调miR－141的表达，进而下调TGF－β1的水平，并抑制纤维化相关蛋白Col I、Col III和α－SMA的表达，
circRNA_010567/miR－141/TGF－β1在糖尿病小鼠心肌纤维化模型中起着重要的调节作用。该研究表明，circRNA－miRNA－mRNA通路在糖尿病小鼠模型心肌纤维化过程中可能发挥着重要作用。
Tang等的一项研究表明，小鼠myo9a基因反向剪接的
circRNA_000203与心肌纤维化相关[23]。在血管紧张素II诱导的糖尿病小鼠心肌成纤维细胞中circRNA_000203的表达上调，该研究还发现，抗纤维化的miR－26b－5p是circRNA_000203的直接靶标。如果miR－26b－5p被circRNA_000203海绵吸附，通过激活I型胶原蛋白a2
（Col1a2）和结缔组织生长因子可促进心肌成纤维细胞的增殖，过表达circRNA_000203可降低miR－26b－5p在心肌纤维化中的抗纤维化作用。此外，阻断miR－26b－5p与过表达circRNA_000203一致，均可促进心肌纤维化作用。circRNA Acta2也被报道通过“海绵吸附”作用于miR－548f－5p，进而调控α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA）的表达和功能[24]。总之，circRNA_000203和circRNA Acta2通过与相应的miRNA 互作进而调控心肌纤维化的这一发现为circRNAs在心血管疾病中的研究提供了新的视野。
（六）环状RNA在心衰中的作用
心衰是全世界人类死亡的主要原因之一，心脏肥厚的终末病程会发展为心衰，然而这一发展过程的具体机制并不清楚。Wang，K等人发现一类和心脏相关的circRNA（HRCR），可以通过HRCR－miR－223－ARC （含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子）抑制心脏肥厚进程，防止心衰发生[25]，HRCR作为miR－223的海绵，同ARC基因竞争结合miR－223，从而调控ARC基因的表达。
ARC蛋白是一类重要的心脏保护蛋白，在心脏细胞中大量表达，之前已经有报道表明ARC蛋白与心肌细胞肥大及凋亡相关[26]。ARC基因的3’端非编码区含有miR－223的结合位点，miR－223可以通过结合在ARC 基因的3’端非编码区，靶向调控ARC基因在细胞内的表达。成熟心肌细
胞的更新非常低，并且一旦它们分化为成熟形式就不足以克服心脏损伤，心肌细胞也经历称为心脏衰老的病理性衰老。Du等报道，外显子circRNA Foxo3可诱导心脏衰老[26]，外源性的circRNA Foxo3可加重心脏衰老和阿霉素诱导的心肌病，这可以通过敲除circRNA Foxo3来逆转。circRNA Foxo3通过与分化抑制因子1（ID1），转录因子（E2F1），粘着斑激酶（FAK）和缺氧诱导因子1α（HIF1α）结合来促进心脏衰老，一旦与circRNA Foxo3结合，上述因子仍保留在细胞质中，导致心脏产生应激反应。
（七）环状RNA在动脉粥样硬化中的作用
动脉粥样硬化是一种血管疾病，由血管内皮损伤导致胆固醇积聚，最终阻塞血管，动脉粥样硬化是很多心血管疾病共同的病理基础，是世界范围内导致人类死亡的主要原因之一。circRNA在心血管疾病中的作用是从发现INK4/ARF基因簇反义非编码RNA（antisense non－coding RNA in the INK4 locus，ANRIL）在动脉粥样硬化中的作用开始的，动脉粥样硬化可能具有遗传易感性，研究发现，位于第9号染色体短臂（9p21.3），邻近INK4/ARF基因簇的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）与ASVD的易感性有关，该段基因的多态性通过调节ANRIL的转录从而调节INK4/ARF基因的表达，ANRIL的表达水平反过来也可以影响INK4/ARF基因的表达[27]。该段基因簇编码3种已知的抑癌基因：p16ink4a，p15ink4b和p14arf，这些基因的表达产物可
抑制细胞的生长和增殖，与ASVD发病相关的基因位于邻近ANRIL编码基因120kb的区域，研究发现，ASVD的发生与p16ink4a，p15ink4b，p14arf和ANRIL基因表达水平下降有关，这些抑制增殖的基因表达水平下降可导致单核细胞增殖或血管增生，从而导致动脉粥样硬化的发生与发展[28]。ANRIL具有19个外显子，研究者发现其转录过程中存在“外显子跳读”的现象，INK4/ARF基因簇反义环状非编码RNA（circRNA ANRIL）不能造成INK4/ARF相关抑癌基因的沉默，从而可以减少罹患心血管病的风险。Holdt等人展示了一种环状ANRIL亚型的分子机制[29]，circRNA ANRIL通过与60S核糖体装配因子PES1结合从而损害核糖体的成熟，导致核应激和p53活化，最终导致平滑肌细胞和巨噬细胞的失活，同时诱导细胞凋亡，这是动脉粥样硬化的关键细胞功能。总之，circRNA ANRIL 通过调控核糖体生物合成来提供动脉粥样硬化保护，表明长链非编码RNA 的环化可能改变RNA功能和预防人类疾病，因此，circRNA ANRIL可以预防动脉粥样硬化。
四、环状RNA可作为心血管疾病的新型生物标志物
在所有非编码RNA中，circRNA可能是未来疾病生物标志物的最佳候选者。原因如下：首先，circRNA由于是封闭环状结构，所以没有5’－3’的极性，也没有polyA尾巴，因此比线性RNA稳定，不容易被RNA 核酸外切酶或者RNase R降解，所以它们的半衰期在细胞外释放后更长，这使得circRNA在细胞外液中更加稳定和丰富，易于检测，有证据表明，
在健康人的唾液细胞里就发现了400种以上的circRNA；其次，深度RNA 测序研究已经在人和小鼠中发现了数百至数千种细胞和/或组织特异性circRNA[30]；第三，circRNA存在于全血，血浆和细胞外囊泡如外泌体中，表明血液的大部分成分（如外周血单核细胞，外泌体，血小板，血浆和血清）可用于生物标志物的研究。
例如，一项关于人血小板的有趣研究表明，用RNase R去除血小板中的线性RNA后，发现血小板中富含的circRNA大约是剩余线性RNA 的14至26倍，这表明血小板中的线性RNA比环状RNA降解更快[31]。同样地，心血管疾病与circRNA的表达失调有关，人们越来越关注circRNA作为心血管疾病的潜在生物标志物。赵等人的一项研究表明了circRNA_0124644在冠状动脉疾病患者的血液中表达上调，并提出circRNA_0124644可作为冠状动脉疾病的潜在临床生物标志物[32]。尽管关于环状RNA作为心血管疾病潜在生物标志物的报道不多，但是与其他非编码RNA相比，环状RNA作为心血管疾病生物标志物的功效由于其出众的稳定性而显着增加。
五、结论
circRNA高度保守，结构稳定，具有细胞和组织特异性表达以及发育阶段特异性表达的特征，circRNA具有多种生物学功能，主要是作为miRNA海绵，通过与miRNA相互作用从而与多种疾病相关联。目前，
circRNA在心血管疾病中的研究刚起步，仅发现几种与心血管疾病相关的circRNA，随着研究的深入可能会发现更多与心血管疾病相关的circRNA 及其作用机制，为心血管疾病的诊断及治疗提供新的思路。
目前，环状RNA在RNA领域中非常引人注目，内源的circRNA是一种丰富、多样、稳定和保守的RNA分子，代表了一种新型的非编码RNA，关于circRNA如何起作用以及调节多种生理和病理过程的知识很少，这肯定会延迟circRNA在临床上的应用，直到对它们建立足够的认识[33]。先前所涉及人类受试者的研究中仅包含一小部分患者和健康受试者，因此该领域需要具有更大群组的研究，使其可以提供关于circRNA的病理生理学机制及其作为生物标记物的更令人信服的数据资料，此外，不同组之间的结果通常存在很大差异，并且缺乏数据重复性，这主要归根于缺乏用于测量体液和组织中circRNA水平的标准化方法，上述限制使得将circRNA 作为心血管疾病的生物标记物应用于临床还存在一定风险，并且也不容易得到批准。
circRNA的数量庞大，功能复杂，目前的研究还处在起步阶段，随着二代测序技术的完善，基因芯片及高通量测序检测疾病状态下差异表达的circRNA，为筛选在心血管疾病中有重要调节作用的circRNA提供了理论基础[34]。回顾既往的相关研究不难发现，通过高通量技术筛选建库，随后进行定量PCR对差异表达的circRNA进行验证，是circRNA作为疾病
生物标记物的研究策略，除检测circRNA的表达外，还可同时检测相关miRNA的表达量，深入研究circRNA与miRNA的相互作用也是当前相关研究的主要关注点。此外，利用基因过表达和基因敲除的方法，可以探索circRNA的下游通路和分子机制，进而阐明其在疾病发展中的作用。
六、展望
心血管疾病是全球死亡率最高的疾病，其治疗与预后是一个重大难题，除了常规的治疗方式，目前基因的诊疗技术为治疗心血管疾病提供了新视角。采用疾病特异性相关的反义miRNA分子来抑制疾病已进入临床试验阶段，在分子水平上对miRNA的反义核苷酸链进行化学修饰可提高miRNA与细胞的亲和力，使其更有效地到达治疗靶点。而LNA－GapmeRs技术则直接靶向lncRNA，与目标lncRNA结合后可迅速激活核糖核酸内切酶（RNase H），降解lncRNA。
目前对circRNA的研究日渐广泛，其分布、特点、形成机制和功能逐渐被发现，检测技术越来越精确。与miRNA和lncRNA不同，环状RNA 能抗核酸外切酶从而可在体内稳定存在，因此更有潜力成为基因治疗的新工具，随着新技术的发展，将发现更多的circRNA及其新的功能。circRNA 可充当“分子海绵”，与某个特定的miRNA相结合，从而抑制靶基因的表达，已有报道证实在体外人工合成的circRNA分子可靶向调控与丙型肝炎病毒密切相关的miR－122，进而抑制丙型肝炎病毒复制和病毒蛋白的形
成，缓解疾病进展[35]。环状RNA还可通过调控基因表达，蛋白质翻译和生成等机制发挥作用，因此人工合成的环状RNA也可能以靶基因或蛋白质为靶点，直接作用于疾病。近年来也有研究发现一些circRNA可通过不同途径调控心血管疾病的相关信号通路，还有许多circRNA在心血管疾病的血浆、组织与细胞中表达差异较大，这些circRNA也可能参与疾病的发生发展过程，然而，在我们充分了解circRNA在心血管疾病中的分子机制之前，还需要做更多的研究。虽然circRNA的研究已经很广泛，但大多数研究还不够深入，很多功能机制尚不清楚，未来的研究中将会体现出circRNA更多的功能优势和生命活动的意义，对于了解基因转录的复杂性提供分子基础，为临床疾病的诊断和治疗提供理论依据。