细胞工程实验操作
1.什么是细胞工程
细胞工程按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。细胞工程所涉及的范围很广，按生物类型可以分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程，按实验操作对象可以分为细胞与组织培养、动物融合、细胞核移植、染色体操作、转基因生物等。以细胞工程为基础，发展派生出了不少以工程冠名的新领域，如组织工程、胚胎工程、染色体工程等。
2. 什么是消毒disinfection
是指杀灭或去除外环境中媒介物携带的病源微生物的过程。
3. 什么是干细胞stem cell
干细胞是指具有自我更新和分化潜能的细胞。
4.什么是细胞融合cell fusion
又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。5.什么是细胞培养cell culture
是指生物细胞在离体条件下的生长和增殖，细胞的离体培养称为细胞培养。
6.基因治疗gene therapy
指将外源功能性目的基因导入患者体内，通过调控目的基因表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的。
7.转基因动物transgenic animal
借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后岁细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定的遗传给后代的动物。
8.ES细胞embryonic stem cell
当细胞团的细胞分离出来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代，同时还保持其全能性。这种干细胞称为胚胎干细胞即ES 细胞。他是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。
9. 什么是克隆clone
克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。
10. 什么是染色体Chromosome
染色体是细胞内具有遗传性质的物体,易被碱性染料染成深色,所以叫染色体(染色质),其本质是脱氧核甘酸.
11.什么是细胞污染cell contamination
在细胞培养中，凡是与培养无关的杂质的混入培养系统称为污染
二、简答题
1.重组DNA技术的一般步骤
（1）目的基因的获取目前，获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工合成法。
（2）DNA分子的体外重组体外重组是把载体与目的基因进行连接。
（3）DNA重组体的导入把目的基因装在载体上后，就需要把它引入到受体细胞中。导入的方式有多种，主要包括转化、转导、显微注射、微粒轰击和电击穿孔等方式。转化和转导主要适用于细菌一类的原核生物细胞和酵母这样的低等真核生物细胞，其他方式主要应用于高等动植物的细胞。（4）受体细胞的筛选与鉴定由于DNA重组体的转化成功率不是太高，因而，需要在众多的细胞中把成功转入DNA重组体的细胞挑选出来。应事先找到特定的标志，证明导入是否成功。
（5）基因表达目的基因在成功导入受体细胞后，它所携带的遗传信息必须要通过合成新的蛋白质才能表现出来，从而改变受体细胞的遗传性状。目的基因在受体细胞中要表达，需要满足一些条件。
2、细胞融合一般采用哪几个方法，一般经历哪几个步骤
方法：诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离
子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。
步骤：以动物细胞为例
（1）细胞准备。分贴壁和悬浮细胞两种。前者可直接将两亲本细胞混合培养，后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。
（2）细胞融合，加促融因子于将行融合的细胞之中，诱导融合。
（3）杂种细胞选择。利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，而让杂种细胞存活。
（4）杂种细胞克隆。对选出的杂种细胞进行克隆（选择与纯化），经过培养，就能获得所需要的无性繁殖诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。
3、细胞生长的测定方法
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其原理为活细胞的线粒体脱氢酶能使将染料MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，经酸性异丙醇溶解后呈现的色度可反映出生活细胞的代谢水平。而死细胞无此酶活性。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
微生物细胞数目的检测方法
1．总细胞计数法显微镜直接记数法和比浊法(1)血球计数板法(2)涂片计数法（3）比浊法。
2．活菌计数法（平板菌落记数法）：是通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数的方法．故又称平板计数法（1）涂布平板法（2）倒平板法
3 滤膜过滤法：样品同过微孔滤膜后，细菌收集在滤膜上，然后将滤膜放在培养基中培养，通过菌落计数求出样品活菌落。
(二)微生物生长量和生理指标的测定方法测定微生物生长量及相关的生理指标，常用以下方法：1．湿重法2．干重法
(三) 测定含氮量（2）测定DNA（3）其他生理指标：如测定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸)的含量等。
4、细胞培养中消毒的原则是什么
体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。
1.培养前准备根据实验要求，将所需器具和材料准备好，以合适的方法进行消毒和灭菌。
2.操作室消毒无菌培养室每天都要用1‰的新洁尔灭拖洗地面―次(拖布要专用).紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，―些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
3.洗手和着装平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，操作前要用75％酒精消毒手。出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
4.无菌培养操作
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作都需在火焰近处并经过烧灼进行。金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。
进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。
三、问答题
1、二级生物安全主要处理哪些材料，具体要求是哪些
材料：对人和动物有致病性，但对实验人员、动物和环境不会造成严重危害的动物致病微生物，具有有效的预防和治疗措施。
要求：使用个体防护设备。当微生物的操作不可能在生物安全柜内进行而必须采取外部操作时，为防止感染性材料溅出或雾化危害，必须使用面部保护装置（护目镜、面罩、个体呼吸保护用品或其他防溅出保护设备）。在实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。
离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内。不得穿着外出，更不能携带回家。
用过的工作服应先在实验室中消毒，然后统一洗涤或丢弃。当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套。如可能发生感染性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。
不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。
实验室设计和建造的特殊要求：
生物安全防护二级实验室必须满足本标准中各款的要求。应设置实施
各种消毒方法的设施，如高压灭菌锅、化学消毒装置等对废弃物进行处
理。应设置洗眼装置。实验室门宜带锁、可自动关闭。实验室出口
应有发光指示标志。实验室宜有不少于每小时3～4次的通风换气次
数。
2、原生质体分离有何优缺点
机械分离法优点：可避免酶制剂对原生质的破坏作用
缺点：获得完整的原生质的数量比较少
酶解分离法优点：可以用于几乎所有植物和植物材料，以获得大量的原
生质体
缺点：这些酶制剂常污染有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以
及酚类物质，会影响到原生质体的活力
3植物组织培养的方法和步骤
植物组织培养是在含有营养物质及植物生长物质的培养基中，培养离体植物组织，并诱导使其长成完整植株的技术。离体培养的细胞、组织或器官发育形成完整植株是通过体细胞胚胎发生和器官形成两种方式实现的。他们均受植物激素和加到培养基中的其他因子控制。利用植物组织培养技术可以研究被培养部分在不受植物其他部分干扰下的生长和分化规律，并且可以用各种培养条件印象他们的生长和分化。
培养材料的采集
要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。
这一方面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。
第一步，用自来水流水冲洗5min，然后用中性洗衣粉液进行清洗，最后用自来水流水冲洗30min，以备药剂灭菌。清洗过程勿伤实验材料。
第二步清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。药剂灭菌必须根据培养材料的特点，选择适合的药剂种类、浓度和消毒时间，原则上要求即达到灭菌能目的，又不能损伤植物组织和细胞。对一些具有特俗生物特性的植物材料需要特殊的处理。
（一）培养基的选择、培养基的制备、培养基的灭菌
（二）接种
在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种1－2个，以防止交叉污染
（三）封口
接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。
（四）温度
培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。增殖外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。
组培苗的炼苗移栽
试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。
4．鸡胚成纤维组织为例，如何制作原代细胞
选取受精鲜鸡蛋，置孵化箱或温箱中37℃孵育，一般采用9~12d的鸡胚，根据需要取材后进行组织细胞的分离，再进行单层细胞的培养，建立原代细胞系。
保存：用冻融方法或低温保护剂来保存细胞，常用35L液氮罐储存法。
复苏：一般以很快的速度升温，1~2min内回复到常温，使细胞迅速通过最易受损的-5~0℃。
4.细胞系和细胞株的鉴定方法和指标
1.鉴定指标
1）纯度：分析以何种细胞为主，所占比例有多少，混杂有哪些其他细胞；
2）细胞学特征：观察细胞的形态、结构、染色体组型、生长曲线、分裂指数、倍增时间等是否与来源细胞一致；
3）稳定性：观察细胞在传代过程中，细胞学特征在传代过程中是否发生变化；4）污染情况：检查是否有微生物和其他细胞系的污染；
2. 鉴定方法
1）.细胞形态学观察：光镜和电镜观察其形态特征；
2).绘制生长曲线，计算分裂指数；
3).染色体组型和带型分析；
4).同工酶酶谱检测。
6.奶牛场能做到性别控制吗，如果能，是怎么控制的
四、论述题
1、显微注射法培育转基因动物
答：1）目的基因的制备与纯化目的基因可以来源于：1通过限制性内切酶预先分离的某一基因；2逆转录法得到的cDNA；3人工合成的
DNA片段；4聚合酶链式反应（PCR）扩增的特定基因片段。目的
基因的克隆可以通过载体方式进行，通常选择质粒作为载体。将目
的基因与质粒结合形成重组子，然后转化至 E.coli，扩增质粒，再
分离纯化重组质粒DNA，用适当的限制性内切酶消化，制成线状基
因片段备用。目的基因的克隆也可以通过PCR来实现。
2）卵供体母鼠和假孕母鼠的准备定期准备相当数量的卵供体母鼠和假孕母鼠以及一批相对稳定的正常雄鼠和结扎雄鼠。
3）超排卵与取卵选择4~6周龄母鼠，注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后，隔42~48h再注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），注射
HCG后10~13h剖腹取卵，用培养液保存，置CO2培养箱备用。
4）基因显微注射用专门的持卵管和注射针在显微注射仪是哪个操作，将纯化的目的基因注射到受精卵的雄性原核内（雄性原核较
雌性原核大）。
5)受精卵移植转基因受精卵在单细胞至桑葚胚阶段移植到受
孕后0.5d的假孕母鼠的输卵管，在囊胚期则移植到受孕后2.5d的
假孕母鼠子宫。每只假孕母鼠移植20~30个转基因卵为宜。
6）目的基因的表达整合鉴定和检测从假孕母鼠产下的幼鼠尾尖提取DNA，用PCR、FLSH等方法在染色体及基因水平上进行整合鉴
定，并通过RNA印迹和蛋白质印迹等方法在转录及蛋白质水平上
进行表达检测。经检测获得阳性Founder小鼠。
7）建系将阳性Founder小鼠与同一品系的正常小鼠交配，检测F1代仔鼠的阳性率，当繁殖到阳性率为50％左右时基本上可以
判断外源目的基因为单一位点的整合。经扩大增殖，从中选择外
源目的基因表达效果好，适应性好的转基因小鼠进行近亲繁殖。
然后从子代中选择理想的纯合子个体进行全同胞兄妹交配，建立
遗传基因小鼠近交系。
2、绵羊乳腺生物反应器制备方法、优势、存在问题。P148
答:1、表达载体的构建
目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元
件，主要有四类乳腺定位表达调控元件；第一类是B2乳球蛋白（BLG）；
第二类是酪蛋白基因调控序列；第三类是乳清酸蛋白（WAP）基因调
控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。
2、目的基因的选择
选择目的基因的基本要求是正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其
他表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔。
3、体外重组
选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。
4、基因转导
将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。
5、胚胎移植
利用胚胎移植技术将制备好的转基因受精卵植入代孕母体子宫内，生
产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳
汁来获得目的基因表达产物。
6、鉴定
转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面
进行鉴定。
1）DNA水平上的测定可以用PCR、斑点杂交、印迹分析等方法进行鉴定。在实验中按照常规方法提取模板，根据启动子调控序列和目的基因精心设计特异的引物和探针。
2）表达产物上的鉴定建立乳腺生物反应器的目的是获得具有生物活性的蛋白，因此可以对分泌的蛋白进行检测。检测方法主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附实验、免疫印迹分析等方法。
优点：1、产品质量稳定
2、产品成本低
3、研制开发周期短
4、无污染
5、经济效益显著
缺点：1、外源基因在动物体内的位点整合问题
2、乳蛋白基因表达组织特异性问题
3、目的蛋白的翻译后修饰问题
4、转基因表达产物的分离和纯化问题
5、转基因的技术与方法问题
6、伦理道德问题
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
细胞工程实验方案设计
目录一、基本原理 （一）基本概念 （二）细胞冻存及复苏原理 二、操作器材、设备及灭菌处理（一）准备室的设备 （二）配液室的设备 （三）培养室的设备 （四）细胞培养用液的配制器材与试剂（五）灭菌操作 三、基本用液的配置 （一）水的制备 （二）PBS的制备与消毒 （三）胰蛋白酶溶液的配制与消毒（四）血清的灭活 四、实验步骤 （一）传代前准备工作 （二）取材 （三）原代培养 （四）传代培养
（五）细胞纯化 （六）细胞系的建立 （七）细胞冻存 （八）冻存细胞的复苏 五、实验记录及基本注意事项（一）基本注意事项 （二）实验记录
小鼠肝脏上皮细胞系的建立 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的中，让这些和增殖。这个实验方案就是选取小鼠肝脏上皮利用动物细胞培养技术建立细胞系。 一、基本原理 （一）基本概念 1、原代培养（primary culture） 直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。这种培养称之为原代培养。 2、传代培养（subculture） 细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。 （二）细胞冻存及复苏原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
大鼠骨骼肌细胞培养实验指导
大鼠骨骼肌细胞培养 骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。 肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。 体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据. 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。瓶口消毒后室温待用。 取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。 无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、骨骼肌提取 眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。 吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。 将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。 轻轻摇匀，室温静置消化30分钟 收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。 轻轻吹打混匀组织块悬浮液。
细胞工程实验课题
盐城师范学院海洋与生物工程学院 ——细胞工程实验微课题设计 细胞工程微课题实验方案 不同浓度磷元素对鱼肝细胞的活性 的影响 专业：生物技术 班级：技术14（1）班 成员：14243148杨永周14243150朱剑秋14243146 王宁14243138 胡峰 14243140 李强14243136 陈一帆 14243137 贡森森 日期：2016年11月
磷元素对鱼肝细胞活性的影响 一、实验目的 随着农业的不断高速发展，我国农村为了更高的产量施大量的氮磷钾肥，虽然极大提高了农作物的存活率，但是肥料过剩所产生的水质问题也日趋显著。在这些问题中尤为突出的就是磷元素对水质的影响，调查发现，磷元素过多会使水富营养化从而产生水华破坏水中鱼类的生存环境导致大量鱼类死亡，所以我们今天想研究磷元素过多对鱼的细胞有什么影响，从而警醒人们关注水质安全不要过多施肥。 二、实验原理 草鱼是我国目前养殖产量最大的淡水鱼类之一，在人工养殖过程中，由于水质、饲料等因素易出现以脂肪性肝病为特征的营养性疾病。肝脏作为鱼体最大的解毒和营养代谢器官，在营养物质的消化吸收和保障鱼体健康方面起着重要作用。体外肝细胞分离和原代培养是研究肝细胞功能的有效方法，培养体系中的肝细胞可以很好的模拟体内肝脏的生理环境，用不同浓度的的磷化合物对其进行耐性实验，测试其生物活性。 三、实验器材 （1）设备 培养箱，超净工作台，倒置显微镜，高压蒸汽灭菌锅，低速离心机，冰箱，分析天平，细胞培养瓶8个，移液器，青霉素空瓶6个，血球计数板等。 （2）试剂 D-Hanks 液、PBS缓冲液、胰蛋白酶、牛跟腱胶原、10%胎牛血清、牛胰岛素、100 IU / mL 青霉素、100 μg / mL 链霉素，DMEM培养基，红细胞裂解液、细胞活性鉴别染液台盼蓝染色剂，不同浓度的磷酸溶液。 1：D-Hank’s液的配制称取KCl:0.1g，KH2PO4:0.03g，NaCl:4.0g，NaHCO3:0.175g，Na2HPO4`12H2O:0.04g，溶于双蒸水，混合均匀，定容至500ml，调节pH值7.0-7.4，高压蒸汽灭菌，4℃保存。 2：DMEM培养基的配制：血清的灭活：常用小牛血清，新鲜血清要在56℃水浴灭活30min，再经抽滤分装，即可加入培养基中；吸取配制好的青霉素、链霉素加入到50mlDMEM培养基中（不含小牛血清及双抗），再吸取5ml灭活的小牛血清和2ml 双抗加入培养基中混匀，小牛血清的含量为10%,置于4℃冰箱待用。 4：配置磷酸溶液母液，实验时候稀释成所需的浓度。 实验动物：市场售卖的鱼
大学细胞工程试题及答案
细胞模拟试题及答案 一、填空（每空一分，共25分） 1.实验室的物理防护是由隔离的设备、实验室的设计、实验实施等三个方面组成，根据其密 封程度的不同，分为P1、P2、P3、P4四个生物安全等级。典型的P4实验室由更衣区、过滤区、缓冲区、消毒区、核心区组成。 2.细胞系是原代培养经初步纯化获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一细胞 群体。 3.细胞株是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细 胞增殖形成的细胞群。 4.干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞的增殖特性为缓慢性和自稳性。 5.培养细胞的生长特点为贴附、接触抑制和密度抑制。 6.植物细胞培养的原理是基于动物细胞的全能性。 7.植物细胞悬浮培养的方法为分批培养法、连续培养法和半连续培养。 8.植物组织培养中培养材料的消毒过程中，消毒的基本原则是既要杀死附着其上的微生物又 不损伤材料。 9.细胞生长测定的一般方法为：细胞计数、测定细胞密实体积、细胞鲜重或干重。 10.体外培养的细胞根据其生长方式主要分为贴附型细胞和非贴附型细胞。 11.人工种子的组分包括胚状体、人工胚乳和人工种皮。 12.细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合几 个步骤。其中细胞桥形成是最关键的一步。 13.花粉单倍体植株的鉴定方法有形态鉴定、细胞学鉴定、杂交鉴定、分子标记鉴定。 14.胚胎工程主要是对哺乳类动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育， 获得人们所需要的成体动物。 15.人工诱导单倍体形成的方法包括：远缘杂交、延迟授粉、核置换、射线照射、花药培养等。 二、单项选择题（每题1分，共10分） 1.人参皂甙粉是人参中重要的药用成分，以前只能从人参中提取产量极低，因而价格昂贵。 目前人参皂甙粉可以通过下列哪项技术迅速大量获取（B） A．基因工程 B．植物组织培养 C．植物体细胞杂交 D．发酵工程
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
细胞培养实验指导
细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林
实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告)
细胞工程实验报告
原理，实验步骤或实验方法，实验结果与分析，注意事项，实验感悟 实验一培养基母液的配制 一、实验目的 通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法 二、实验原理 配置培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配置，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配置即可。 三、实验材料、试剂和仪器设备 1.试剂 NH 4NO 3 ,KNO 3 ,KH 2 PO 4 , CaCl 2 ·2H 2 O ,MgSO 4 ·7H 2 O,FeSO 4 ·7H 2 O Na 2-EDTA,MnSO 4 ·4H 2 O,ZnSO 4 ·7H 2 O, , KI,CuSO 4 ·5H 2 O,CoCl 2 ·6H 2 O,肌醇，甘氨酸， 盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水NAA,6-BA 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml、1000ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。 四、实验步骤 1 大量元素母液的配制 先用量筒称量适当蒸馏水放入500ml烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取： NH 4NO 3 ,KNO 3 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 ·7H 2 O, CaCl 2 ·2H 2 O，待第一种化合物完全溶解后再 加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 2 微量元素母液的配制 按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO 4·4H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O H3BO3 , KI, Na 2 MoO 4 ·2H 2 O，CuSO 4 ·5H 2 O, CoCl 2 ·6H 2 O,按制备母液I的方法逐个 溶解，转移至容量瓶中，然后定容至500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。 3铁盐母液的制备
细胞工程 实验一
细胞器的分离、制备与观察 [目的要求] 1．掌握差速离心法的原理。 2．了解甲基绿-派洛宁、中性红-詹姆斯绿的染色原理和着色现象。 3. 掌握细胞核、线粒体等细胞器的染色方法。 [实验原理] 球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。 差速离心法（differential centrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。 细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。 分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。 细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和替他微体、核糖体和大分子物质。 线粒体内膜上分布细胞色素氧化酶，能使詹纳斯绿B燃料保持在氧化状态呈现蓝绿色，而胞质中的颜料被还原成无色。 [实验用品] 1．器具：匀浆器、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5 ml Ep管、载玻片、10 ml滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml烧杯。 2．材料：动物肝脏。 3．试剂：生理盐水、PBS、0.25 mol/L的蔗糖溶液、0.34mol/L的蔗糖溶液、0.88mol/L 的蔗糖溶液、95%乙醇、丙酮、甲基绿—派洛宁、中性红—詹纳斯绿、蒸馏水、冰。 4. 甲基绿-派洛宁染液：0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.8)：冰醋酸1.2ml，加蒸馏水至100ml；醋酸钠2.72g溶于100ml蒸馏水中; 使用时两液按2：3比例混合. A液：5%派洛宁水溶液4ml、2%甲基绿水溶液14ml、蒸馏水16ml；B液：0.2mol/L。醋酸缓冲液(pH4.8)16ml。使用时临时将A液与B液混合(5:2)。 5．）中性红-詹纳斯绿B染液： A: 将3滴詹纳斯绿B饱和水溶液(溶解度5.18％)加到5ml无水乙醇中，然后再加入1ml 1:15000中性红溶液(中性红10mg溶于
细胞工程知识点
细胞工程知识点 1、细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。 2、细胞工程的应用： 1)动植物快速繁殖技术：植物组织培养、人工种子、试管动物、克隆动物 2)新品种的培育：细胞融合、细胞水平的重组 3)细胞工程生物制品：单克隆抗体制备、疫苗生产 4)细胞疗法与组织修复： 2细胞工程理论基础 1、细胞全能性：每个活的体细胞都具有像胚性细胞那样，经过诱导能分化发育成为一个新个体的潜在能力，并且具有母体的全部的遗传信息。 2、细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程。 3、细胞的脱分化：在一定营养和刺激因素作用下,具有特定结构与功能的植物组织的细胞被诱导而改变原来的发育途径,逐步失去原来的分化状态,细胞特性消失,转变为具有分生机能的细胞,并进行活跃的细胞分裂,这一过程称为去分化。 3细胞工程技术 1、实验室条件：组成：准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室。 2、无菌技术、显微技术、细胞观察与分析、细胞分离、细胞保存与复苏 （1）细胞保存方法传代培养保存法低温冷冻保存法(低温、超低温保存) 液体固化的方式（形成冰晶、形成无定型的玻璃化状态） 玻璃化指液体转变为非晶态（玻璃态）的固定化过程，在此状态时，水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化，因此不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。 冷冻方法（缓慢冷冻法、快速冷冻法预冷冻法包括逐级冷冻和两部冷冻） 细胞复苏按一定复温速度将细胞悬液由冻存状态恢复到常温的过程。 复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 细胞培养和代谢调控：
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
细胞工程实验报告
细胞工程实验报告 专业：生物技术班级：0801 姓名：励丹学号：30804305 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的相关实验器材以及实验前器材的清洗与消毒、无菌室灭菌与消毒等基本方法，以建立起无菌操作的概念。 2、了解和掌握动物细胞原代培养的基本方法，熟悉组织块法和消化法培养的基本操作过程。初步掌握无菌操作技术。 3、学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。 4、掌握ELISA测定抗体效价的方法，细胞的超低温冻存和复苏，及MTT法测定细胞活性的方法。 5、学习和掌握制备饲养层细胞的方法，为杂交瘤细胞的制备做准备。 6、学习从脾脏组织制备免疫细胞的方法，从免疫脾脏中制备免疫细胞悬液，用于杂交瘤细胞的融合。 7、学习和掌握动物细胞融合的基本方法，通过免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，并进行选择。 8、学会细胞形态的观察和分析，细胞技术等细胞培养中常见的问题。 二、实验原理 1、原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后直到第一次传代为止。原代培养首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或经消化分散成单个游离的细胞，在人工培养条件下，使其不断地生长、繁殖。 2、细胞活性测定——MTT法 MTT法是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶四氮唑蓝还原成难溶的蓝紫色结晶——甲瓒，经二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在490nm处测吸收值，其吸收值可间接反映细胞的活性状态及活细胞数量。 3、培养细胞的超低温冻存于复苏 为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞
细胞工程
细胞工程学复习资料 一、名词解释 1、细胞工程按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。 2、接触抑制由于细胞的移动而互相靠近发生接触时，细胞不再移动的现象。其实质是由于细胞接触而抑制细胞运动的现象。 3、密度抑制当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分的减少，代谢产物的增多。细胞因营养的枯竭和代谢物的影响而导致细胞分裂停止的现象。 4、无血清培养基是指不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 5、原代培养即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。 6、传代培养当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代培养。 7、饲养细胞也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素C作用后失去分裂能力，供其他细胞附着的细胞层。 8.细胞系原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。 9.细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选购方法,由单细胞增殖形成的细胞群. 10.单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术: 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。 11.外植体把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。 12.愈伤组织脱分化的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性、松散的细胞团。是植物细胞体外再生的第一步，关键一步。 13.继代培养指培养组织在培养基上生长一段时间后，营养物质枯竭，水分散失，并已积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养。14脱分化：分化的细胞在一定条件下，可以转变为胚性状态，重新获得分裂能力。 15再分化：是脱分化后的分生细胞在一定的条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株。 16组织工程是指应用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的机制，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替代物的一门学科。其核心是有种子细胞核生物活性材料构成的三维空间复合体。 17顶体反应是指精子在进入卵丘细胞后由精子头部释放顶体小泡中的内含物，有助于精子穿过透明带的反应过程。 18胚胎发育阻滞是指体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不在发育，这种现象及胚胎发育阻滞。 二、填空题 1、以细胞工程为基础，发展派生出了不少以工程冠名的新领域，如组织工程、胚胎工程、染色体工程等 2、动物细胞工程实验室的设置严格要求无菌环境，避免微生物及其它有害因素的影响。一
植物生理学实验指导
植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020
植物生理学实验指导
目录
植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
《细胞生物学与细胞工程实验》
细胞生物学与细胞工程实验 课程编号：2511240 英文名称：Cell Biology and Cell Engineering 课程负责人：王昌留 师资队伍：王昌留、黄玲、李清、曲明娟、孙振兴 适用专业：生物科学 开课学期：秋季学期 课程类型：专业基础必修课 实验课性质：独立设课/非独立设课 先修课程：植物学实验/2511110、动物学实验/2580070、生物化学实验/2501040 总学时：理论学时实践学时 36 课外学时 总学分：1 采用教材及参考书： 1. 安利国主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2004 2. 杨汉民主编：《细胞生物学实验》第二版，高等教育出版社，1997 3. 李志勇：《细胞工程》第一版，科学出版社，2003 4. 徐承水，党本元主编：《现代细胞生物学技术》，青岛海洋大学出版社，1995 5. 王金发主编：《细胞生物学实验教程》，科学出版社，2003 内容简介： 本课程是一门理论性和技术性都很强的课程，是在学生已修完生物学、生物化学、细胞遗传学、细胞生物学与细胞工程、微生物学、免疫学基础上而设立的，是生物科学专业的必修课程。 本课程既包括细胞生物学基础实验又包括细胞工程综合实验，是一门对实验仪器要求较高的课程。开设本课程的目的是使学生掌握细胞生物学与细胞工程实验设备的操作方法，具备观察和研究细胞结构、功能与生命活动的基本方法，学会发现问题和解决问题的基本技能，为毕业后从事生物学相关的科研和教学工作奠定基础。 本课程考核成绩由平时成绩（占30%）、实验报告成绩（占30%）和终期考核成绩（占40%）三部分构成。 本实验包括的实验项目包括：
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
细胞工程实验小结
细胞工程实验小结 专业：生物技术班级：0801 姓名：励丹学号： 在本次暑期短学期的细胞工程实验课上，我们做了细胞工程中基础的几个实验——饲养层细胞的制备、动物细胞的原代培养（组织块法培养小鼠肝脏细胞，消化法培养小鼠肾脏细胞）、免疫脾细胞的制备、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合、细胞的超低温冻存与复苏及活性测定（MTT法检测）、抗体IgG的检测（ELISA 法），让我受益菲浅。其中很多知识在平时的学习中都是无法学习到的，其中很多实验都开阔了我们的视野，让我们获得了许多平时课堂上得不到的知识。在细胞工程实验课即将结束的时候，我对这个短学期的学习进行总结，总结细胞工程课程试验来的收获与不足。 这次的实验分成了8个小组，因为细胞工程的实验都须在无菌室内进行，而无菌室较小，所以各小组轮流进无菌室进行实验操作，故没轮到进无菌室的小组在外面的实验室进行简单的操练，所以较为轻松。 我们中的大多数人都是第一次进无菌室，对无菌室充满了好奇。而进无菌室也需要一重重地灭菌，以确保无菌室内的安全。首先需要用新吉尔灭溶液对需要带进无菌室的物品及我们的手进行消毒灭菌，然后进入缓冲间穿戴无菌服、帽、手套及口罩。在进入无菌室后还需要用酒精棉擦拭手、超净台以及一些物品。在无菌室内的操作都需在超净台上进行，而且需要在酒精灯边上进行，不可以远离超净台，否则可能使培养的细胞或培养液等受到污染，从而造成实验失败。 我们小组在细胞培养的实验中较为成功，细胞生长状态良好，没有出现染菌现象。在进行细胞超低温冻存于复苏实验时，我们组将两只小鼠的细胞混在一起，是的细胞数增加，相对的在冻存中损伤的细胞数也增多，这个实验应该算不成功的。 通过9天的细胞工程实验，我发现实验是细胞工程学学的实践，我们学到的许多理论都会最终作用于实验，也学到了许多其他专业课上没有教到的理论。很多实验都是需要花费许多心思去学习的，也是非常复杂的。我们学习理科的同学，更加要重视实验课，因为理论与实际结合是最重要。在每次实验之后，我们都要做实验报告，通过实验讲义和自己参阅资料，得知本次实验的目的、原理、所需仪器、实验步骤、实验中的要求及注意事项等问题。实验操作当然是细胞工程
第一节 植物细胞工程实验室设置与培养条件.ppt.Convertor
第一章植物细胞工程原理与技术 第一节实验室设置及培养条件 第二节培养基 第三节植物材料的接种 一实验室设置及内部设备 二培养环境条件 第一节实验室设置及培养条件 一实验室设置及内部设备 实验室建设应考虑的问题： 1、实验的性质 2、实验室的规模 细胞工程实验室: 基本实验室:准备室、无菌操作室、培养室 辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室 贮藏室 温室 基本实验室 1、准备室 完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装及高压灭菌；器皿、材料的洗涤等工作。 主要设备 纯水器工作台药品厨天平电磁炉冰箱玻璃器皿酸度计高压灭菌锅干燥箱等 ◆ 培养容器 2、无菌操作室（接种室） 用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。 接种室应用推拉门，设有缓冲间，面积2m2为宜。进入接种室前更衣换鞋，减少带入接种室杂菌。 接种室主要设备 超净工作台 每次实验前要用紫外灯灭菌20min，关掉紫外灯开始工作，工作过程中注意一直开着吹风机。 无菌操作用具 离心机 细胞融合仪 ◆ 接种用具 3、培养室 用于接种材料的培养。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。
控制：温度、光照、湿度。 培养室主要设备： 1、培养架放置培养物，每层顶部装有灯管进行照明，可用灯管数量来调节光照强度。培养架多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔40cm左右，培养架高 1.7m左右。培养架长 度根据日光灯长度设计， 如采用40W日光灯，则 长1.3m，30W的长lm， 宽度一般为60cm。 2、空调 3、时控器自动开灯、关灯 4、温度自动记录仪 5 、摇床 培养室主要设备： 培养箱 辅助实验室 1、细胞学实验室：对培养材料进细胞学鉴定和研究。 由制片室和显微观察室组成。 主要设备:切片机、磨刀机、温箱及切片染色设备； 实体显微镜、倒置显微镜、生物显微镜、 照相设备 显微观察室 生化分析实验室 植物细胞工程实验室布局 南 北 二培养条件 1.一般控制在 25土2℃。最低15oC，最高35oC。 2.不同植物最适温度不同。如百合20℃；月季25－27℃。 （一）温度 （二）光照 1.光强1500－3000lux ★影响外植体细胞的增殖、组织和器官的分化。 ★愈伤组织一般在黑暗或弱光下诱导；光照强，幼苗生长健壮；光照弱，幼苗生长弱小，容易徒长。 ★不同波长的光对细胞的分裂和器官的 分化有影响。 2.光质 ★红光促进杨树愈伤组织的生长， 蓝光阻碍其生长。 （二）光照 3.光照时间
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。