乙酰胆碱酯酶生物传感器法测定蔬菜水果中有机磷农药残留
※分析检测食品科学2007, Vol. 28, No. 02
229乙酰胆碱酯酶生物传感器法测定蔬菜水果中
有机磷农药残留
魏福祥，王振川，王金梅
(河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018)
摘要：研究一种快速简便测定蔬菜水果中有机磷农药残留的方法。利用乙酰胆碱酯酶生物传感器技术，以苹果、黄瓜为样品，采用标准加入法进行分析，测定蔬菜水果中有机磷农药残留。实验结果表明，该方法回收率在
96.45%～100.12%，相对标准偏差为2.76%～3.09%，对马拉硫磷和甲基对硫磷的检出限分别为4.80×10－11、2.93×10－10
mol/L。
关键词：乙酰胆碱酯酶；生物传感器；标准加入法；蔬菜水果；有机磷农药残留
Determination of Organophosphorus Pesticide Residues by An Acetylcholinesterase
Biosensor in Vegetables and Fruits
WEI Fu-xiang，WANG Zhen-chuan，WANG Jin-mei
(College of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China)
2007, Vol. 28, No. 02食品科学※分析检测
1.2.1胆碱酯酶生物传感器工作原理[4]
以碘化乙酰硫代胆碱作底物，向电解池的两支铂电
极上施加一个恒定的微电流进行电解。乙酰胆碱酯酶催
化底物碘化乙酰硫代胆碱分解生成具有电化学活性的物
质硫醇，记录电解过程中电位E随时间t的变化值，得
一典型的S型曲线。该去极化曲线的斜率dE/dt反映了
水解速率，即酶的催化速率。反应如下：
CH3COS(CH2)2N(CH3)3I + H2O HS(CH2)2N(CH3)3 I + CH3COOH
在一定条件下，酶活性越强，酶促反应越快，去极化曲线的斜率dE/dt越大。加入有机磷农药后，酶活性被抑制，酶促反应进行的不完全，去极化曲线的斜率dE/dt减小。通过比较酶被抑制前后dE/dt的大小，对有机磷农药进行定量测定。
1.2.2实验步骤
1.2.2.1准确称取2.0000g样品(蔬菜或水果)切碎，置于100ml具塞锥形瓶中，加入50ml 0.1mol/L pH7.0的BR 缓冲溶液作提取试剂，剧烈振荡10m in，使蔬菜水果中的有机磷农药残留充分溶入溶液中，倒出提取液，静置3 ～5min，备用。
1.2.2.2标准加入法样品测定取5份等体积5ml的上农药标准浓度(μg/L)
0012.7912.3713.0512.74 c00.2519.2819.6419.7519.56 2c00.5025.8026.1125.9925.97 4c0 1.0036.4836.6637.2336.79 8c0 2.0056.6756.4555.8156.31表1 标准加入法测定苹果样品中马拉硫磷农药残留数据Table 1 Standard additions determination data of malation
pesticide residue in apple
表2 标准加入法测定黄瓜样品中敌敌畏农药残留数据
Table 2 Standard additions determination data of dichlorvos
pesticide residue in cucumber
农药标准浓度(μg/L)
抑制率(%)
123R 009.829.649.759.71 c00.2516.3016.8716.5416.57 2c00.5023.9724.2824.8924.38 4c0 1.0033.0333.6733.9833.56 8c0 2.0060.7860.1159.8660.25 (加入5μg/L的马拉硫磷标准溶液)，以苹果样品为例(样品中含有马拉硫磷农药)，实验数据见表1。以黄瓜样品为例(样品中含有敌敌畏农药)，实验数据见表2。
A C h E
将表1数据以农药浓度和农药平均抑制率作图，得
231
※分析检测食品科学
2007, Vol. 28, No. 02农药的回收率在96.45%～100.12%之间数据见表3。2.4
精密度及检测限
以苹果样品为试材选取3组样品(样品中含有马拉硫磷农药)，每组样品重复测定11次结果见表4。
根据表4数据，得出相对标准偏差RSD 为2.76%～3.09%。通过对3个样品标准偏差的计算，确定方法对马拉硫磷的检出限为4.80×10－11
mol/L 。同样方法确定
对甲基对硫磷的检出限为2.93×10－10mol/L 。
2.5
方法对比
为了验证方法的可靠性，取同一蔬菜水果样品(以苹果样品为例)，用已建立的乙酰胆碱酯酶生物传感器法与国家标准法气相色谱法和分光光度法相比，三者综合特性比较见表5。
作等优点。3
结 论
采用乙酰胆碱酯酶生物传感器法测定蔬菜水果中的有机磷农药残留，引入标准加入法进行分析，该法可作为蔬菜、水果的日常农残监测和质量管理的快速检测手段，是非常经济和有效的，具有广泛的实用性，也可作为质量监督部门监督抽查检测的方法。该法对加强食品安全质量管理，促进无公害食品的发展具有重要的意义。
参考文献：
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魏福祥, 韩菊, 刘庆洲, 等. 乙酰胆碱酯酶活性的计时电位法测定[J].分析测试学报, 2004, 23(2): 9-11.
检测方法设备投资检测时间操作预处理检测结果(μg/L)(n=3)生物传感器法小0.5h 易易 1.411气相色谱法大4h 难难 1.437分光光度法
小
2h
易
难
1.398
表5 方法对比
Table 5 Methods comparison
从表5的比较可以看出，乙酰胆碱酯酶生物传感器法具有简便、快速、设备简单，预处理方便，易操
全血胆碱酯酶活性的测定
全血胆碱酯酶活性的测定 ——羟胺三氯化铁法 实验目的 1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。 2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。 3. 学会末梢血的采集。 实验原理 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。试剂和材料 蒸馏水 盐酸溶液(1＋2) 碱性羟胺溶液 磷酸盐缓冲液(PH＝7.20) 三氯化铁溶液 氯化乙酰胆碱标准液分光光度计 10mL比色管 漏斗 恒温水浴箱，控温±0.5℃采血针头 血色素吸管 采样、运输和保存 用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。 实验步骤 A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30min B 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血37℃水浴5min +1.0mL水37℃水浴30min C 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min + 1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴30min D 空白管1.0mL 磷酸盐缓冲液37℃水浴5min +1.0mL水 37℃水浴30min
水浴之后对A 、B 、C 、D 四个试管分别进行以下操作： 1.加入 4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇 2min ； 2.加入 2.0mL 盐酸溶液，充分振摇 2min ； 3.加入 2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇； 4.滤纸过滤，520nm 比色。 实验结果 表1-1 520nm 波长下样品的吸光度 样品编号 A B C D 吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000 结果计算 ①计算酶活性的绝对值 带入得： Xs=7538 .0299.0003.0538.0?-+=3.149μmol Xs ：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL ·37℃·30min)； A ：以 试剂空白为参比的在波长520nm 处样品管的吸光度值； B ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处对照管的吸光度值； C ：以试剂空白为参比的在波长520nm 处标准管的吸光度值。 ②计算酶活性的相对值 Y=10060 .1149.3?=197 Y —酶活性的相对值，%； Xs —被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL ·37℃·30min)； Xc —正常人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL ·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL ·37℃·30min) 讨论 1.由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女：3.19 ± 0.398 μmol ；因3.149μmol 在3.19 ± 0.398 μmol 的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。 2.各组所测数值偏差较大，可能与操作差异如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导
实验八胆碱酯酶抑制法测定有机磷农药残留量(精)
实验八胆碱酯酶抑制法测定有机磷农药残留量 一、实验原理 根据GB/T 5009.199-2003，有机磷类(OPS)和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶(AchE)的活性具有很强的抑制作用。向样品中添加一定量的乙酰(或丁酰)胆碱酯酶，如果样品中含有上述两大类农药，即会对酶的活性产生抑制作用。当向含有农药的样品中添加底物(碘化硫代乙酰胆碱)和显色剂(二硫代二硝基苯甲酸)时，酶由于丧失活性而不能催化底物分解并完成显色反应；相反，如果样品中不含农药，胆碱酯酶则能催化底物分解并完成显色反应。通过分光光度计于412nm波长下比色，能测出颜色变化造成的吸光度之差，再通过吸光度的变化计算出酶的抑制率。酶的抑制率越大，说明样品中残留农药的含量越高。 二、实验试剂 磷酸盐缓冲溶液：3.2g KH2PO4和11.9gK2HPO4配成1000mL，PH8.0。 显色剂：160mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。 底物：取25.0mg碘化硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后4℃冰箱中保存备用，保存期不超过2周。 胆碱酯酶溶液：称取0.040g丁酰胆碱酯酶(粉剂)或乙酰胆碱酯酶，加入2mL 磷酸盐缓冲溶液，溶解后低温保存，1周内可用。 三、实验仪器 农药残留快速测定仪或分光光度计分析天平恒温烘箱。 四、测定步骤 ⑴取蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm见方的碎片，取样1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲液振荡1～2min，倒出提取液，静置3～5min备用。 ⑵对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲液，再加入0.1mL胆碱酯酶溶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上(每批样品测试时放置时间应一致)。加入0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色，应立即用1cm比色皿放入农药残留快速测定仪(或分光光度计)，记录反应3min的吸光度变化值△A0。 ⑶样品溶液测定：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶
实验2 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药
K 0 K t 吸光度A 实验二 乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药 目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。 一、 实验目的 1． 了解果蔬中残留农药的分析方法； 2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。 二、 实验原理 有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。 以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。 根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下： %1000 0?-= K K K Y t K 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值 K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜 率值 其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。 在样品的测量过程，选取每隔等步长时间测定一次吸光度值，3分钟内共测定7个数据点。设数据点如下 表： t 1 2 3 4 5 6 7 A A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 则线性回归所得A ～t 曲线的斜率K 为： 2 22272176543212 2 )721(7 1 )721() ()721(71 )765432()(7171 +++-++++++?+++-++++++= -- = ∑∑∑∑∑ A A A A A A A A A A t t A t A t K i i i i i i
2341农药残留量测定法
2341 农药残留量测定法 第五法药材及饮片（植物类）中禁用农药多残留测定法 1. 气相色谱-串联质谱法 色谱条件用(50%苯基)-甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱（柱长为30m，柱内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm）。进样口温度250℃，不分流进样。载气为高纯氦气（He）。进样口为恒压模式，柱前压力为146kPa。程序升温：初始温度60℃，保持1分钟，以每分钟10℃的速率升温至160℃，再以每分钟2℃ ） ， ％ 监测离子对、碰撞电压（CE）见附表2。为提高检测灵敏度，可根据保留时间分段监测各农药。 3. 对照溶液的制备 3.1 混合对照品溶液的制备精密量取禁用农药混合对照品溶液（已标示各相关农药品种的浓度）1ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
3.2气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1ml含1.0mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1ml含0.1μg的溶液。 3.3 空白基质溶液的制备取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。 3.4 基质混合对照溶液的制备分别精密量取空白基质溶液1.0ml（6份），置氮吹仪上，40℃水浴浓缩至约0.6ml，分别加入混合对照品溶液10μl、20μl、50μl、100μl、150μl、200μl，加乙腈稀释至l ml，涡旋混匀，即得。 4. 供试品溶液的制备 4.1 直接提取法 取供试品粉末（过三号筛）5g，精密称定，加氯化钠1g，立即摇散，再加入乙腈50ml，匀浆处理2分钟（转速不低于每分钟12000转），离心（每分钟4000转），分取上清液，沉淀再加乙腈50ml，匀浆处理1分钟，离心，合并两次提取的上清液，减压浓缩至约3~5ml，放冷，用乙腈稀释至10.0ml，摇匀，即得。 4.2 快速样品处理法（QuEChERS）法 取供试品粉末（过三号筛）3g，精密称定，置50ml聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15ml，涡旋使药粉充分浸润，放置30分钟，精密加入乙腈15ml，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡（每分钟500次）5分钟，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末（4：1）7.5g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡（每分钟500次）3分钟，于冰浴中冷却10分钟，离心（每分钟4000转）5分钟，取上清液9ml，置预先装有净化材料的分散固相萃取净化管[无水硫酸镁900mg，N-丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷键合硅胶300mg，硅胶300mg，石墨化碳黑90mg]中，涡旋使充分混匀，置振荡器上剧烈振荡（每分钟500次）5分钟使净化完全，离心（每分钟4000转）5分钟，精密吸取上清液5ml，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4ml，加乙腈稀释至1.0ml，涡旋混匀，滤过，取续滤液，即得。 4.3固相萃取法 固相萃取净化方式包括以下三种： 方式一：量取直接提取法制备的供试品溶液3～5ml，置于装有分散型净化材料的净化管[无水硫酸镁1200mg，N-丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷键合硅胶
中国药品检验标准操作规范2010年版中药补充部分24有机磷类农药残留量测定法
有机磷类农药残留量测定法 1 简述 很多有机磷类农药具有毒性，其残留严重危及人体健康。《中国药典》2010年版一部收载了有机磷类农药（对硫磷、甲基对硫磷、乐果、氧化乐果、甲胺磷、久效磷、二嗪农、乙硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷）的测定方法。 本法通过提取、净化和富集等步骤制备供试品溶液，采用气相色谱法，氮磷检测器测定。 2 仪器与用具 2.1 气相色谱仪，带有氮磷检测器（NPD），载气为高纯氮（纯度>99.9999%）。 2.2 超声仪。 2.3 旋转蒸发仪。 2.4 多功能真空样品处理器（如SUPELCO,isiprep TM DL）。 2.5 活性炭小柱（120~400目，石墨碳填料0.25g，内径0.9cm，3ml）。 2.6 氮吹仪（如Organomation Associates，Inc.,N-EV AP TM 112 nitrogen evaporator）。 2.7 色谱柱：DB-17MS或HP-5弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）或类似极性的毛细管柱。 2.8 具塞锥形瓶、250ml平底烧瓶、棕色量瓶、移液管等。 3 试药与试液 3.1 无水硫酸钠为分析纯。 3.2 乙酸乙酯、正己烷（农残级或分析纯试剂经过全玻璃蒸馏装置重蒸馏，经气相色谱法确认，符合农残检测的要求）。 3.3 农药对照品：对硫磷、甲基对硫磷、乐果、氧化乐果、甲胺磷、久效磷、二嗪农、乙硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷，由国家标准物质研究中心及农业部环境保护科研检测所提供，其纯度大于99%；也可以使用国际认可的、纯度要求等符合规定的进口标准物质。 4 色谱条件与系统适用性试验 进样口温度：220℃；检测器温度:300℃。不分流进样。程序升温：初始120℃，每fenzh 10℃升至200℃。每分钟5℃升至240℃，保持2min，每分钟20℃升至270℃，保持0.5min。理论板数按敌敌畏峰计算应不低于6000，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。 5 操作方法 5.1 对照品储备液的制备精密称取对硫磷、甲基对硫磷、乐果、氧化乐果、甲胺磷、久效磷、二嗪农、乙硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷农药对照品适量，用醋酸乙酯分别制成每1ml约含100μg的溶液，即得。 5.2 混合对照品储备液的制备精密量取上述各对照品储备液1ml，置20ml棕色量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，即得。 5.3 混合对照品溶液的制备精密量取上述混合对照品储备液，用乙酸乙酯制成每1ml 分别含0.1μg、0.5μg、1μg、2μg、5μg的溶液，即得。 5.4 供试品溶液的制备药材取供试品粉末（过二号筛）约5g，精密称定，加无水硫酸钠5g，加入乙酸乙酯50~100ml，冰浴超声处理3min，放置，取上层液滤过，药渣加乙酸乙酯30~50ml，冰浴超声处理2min，放置，滤过，合并两次滤液，用少量乙酸乙酯洗涤滤纸及残渣，与上述滤液合并。取滤液于40℃下减压浓缩至近干，用乙酸乙酯转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，精密量取1ml，置活性炭小柱［120~400目，0.25g，内径0.9cm（如Supelclean ENVI-Carb SPE Tubes,3ml活性炭小柱），用乙酸乙酯5ml预洗］上，置多功能真空样品处理器上，用正己烷-乙酸乙酯（1:1）的混合溶液5ml洗脱，收集洗脱液，置氮吹仪
纸片法和速率法测定胆碱酯酶的比较
纸片法和速率法测定胆碱酯酶的比较 【关键词】 CHE；纸片法；速率法 ［摘要］目的：了解胆碱酯酶（CHE）纸片法和速率法两种方法的相关性，便于临床上对有机磷中毒患者的疗效观察和预后估计。方法：在日立7060全自动生化分析仪上测得CHE减少的标本(其中包括有机磷中毒患者、肝病患者、低蛋白血症等各类患者标本)，采用美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）EP9A文件方案，每天再从其中随机选取8份标本，并分别用纸片法和速率法按顺序1周~8周同时进行测定，再按相反顺序8~1重复测定，共测定5 d，记录结果，然后对两种方法得出的结果进行单位比较。结果：纸片法的结果只有几个单位值，受主观因素影响，而速率法是国际单位数值大且较精确，要做统计学比较是不现实的，只能从数值上做粗略的估计。纸片法的0 u~8 u应该是速率法的1 000 u以下，纸片法的15 u~19 u 应该是速率法的1 000 u~2 000 u，纸片法的23 u~26 u应该是速率法的2 200 u~3 500 u，纸片法的30 u~34 u应该是速率法的3 600 u~4 300 u。结论：纸片法是目测的试验，比色板只有简单几个单位值，而且受主观因素影响较大，误差较大，准确性和不高，难以标准化。速率法不受人为因素影响，而且准确性和重复性高，易于标准化。两者要做统计学比较是不现实的，只能从数值上做粗略的估计。建议临床上对有机磷和氨基甲酸酯类中毒的患者，进行疗效观察和预后估计时，动态观察CHE以速率法检测为准。 ［关键词］ CHE；纸片法；速率法
血清或血浆胆碱酯酶(CHE)是临床上对有机磷和氨基甲酸酯类中毒以及肝病患者的一项重要检测指标。过去对有机磷和氨基甲酸酯类中毒鉴别和中毒程度鉴定常用方法是用纸片法测定CHE，现在由于全自动生化仪广泛应用，日常对有机磷和氨基甲酸酯类中毒以及肝病患者测定CHE多采用速率法，但是夜间为了对有机磷中毒患者鉴别和中毒程度鉴定，测定CHE还多采用纸片法。由于两种方法采用单位不同，这就给临床上观察有机磷中毒患者的疗效观察和预后估计造成一定困难。目前还没有对速率法和纸片法相关性的报道，为了解这两种方法的相关性，分别用这两种方法同时对临床上各种CHE减少的患者进行检测。 1 材料和方法 1 仪器 日立7060全自动生化分析仪，37 ℃恒温箱，计时器。 2 试剂 速率法用山东3 V试剂公司生产的CHE试剂盒，纸片法用潍坊市康华公司生产的CHE试纸。 3 原理 纸片法：血清中CHE与含有氯化乙酰胆碱和溴麝香草酚蓝混合液的纸片作用，生成胆碱与醋酸，由于醋酸可使pH下降，纸片由深蓝变成黄绿色，经一定时间后，取出纸片与比色板对照可得CHE活性。速率法：丁酰硫代胆碱＋Н2О。表1 纸片法和速率法结果比较（略）注：i为标本号，X1、X2、分别为速率法两次测定结果和平均值，Y1、Y2、分别为纸片法两次测定结果和平均值。纸片法如果值太低延长一
乙酰胆碱酶抑制剂
乙酰胆碱酯酶抑制剂，即抗胆碱酯酶药。能抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)的活性，使胆碱能神经末梢释放的ACh不致被AChE水解，导致ACh浓度增高，使ACh的作用延长并增强。因此是间接的拟胆碱药。根据抗胆碱酯酶药与AChE结合后水解速率的快慢，可分为可逆性和不可（难）逆性乙酰胆碱酯酶抑制及两类。 （一）可逆性乙酰胆碱酯酶抑制 生物碱，季铵类，叔胺类。 毒扁豆碱(Physostigmine) 是一种生物碱，为用于临床的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂。化学结构中甲氨基甲酸酯部分是抑酶作用的必要结构，当与AChE的催化部位结合后，生成无活性的氨基甲酰化的AChE，其水解速率较乙酰化的AChE 慢的很多，但最终还是可以被水解，释放出活性的AChE，因此为可逆性的抑制剂。毒扁豆碱为氨基甲酸芳酯类，性质不稳定。对其结构改造发展了合成的抗胆碱酯酶药，用于临床的有溴新斯的明(Neostigmine Bromide)，溴吡斯的明(Pyridostigmine Bromide)。一些用于临床的季铵类抗胆碱酯酶药有依酚氯铵(Edrophonium Chloride，亦称腾喜龙)和安贝氯铵(Ambenonium Chloride，亦称酶抑宁，酶斯的明)。氢溴酸加兰他敏Galantamine Hydrobromide)为一种生物碱，作用均与新斯的明类似。加兰他敏和一些新开发的吖啶类抗胆碱酯酶药，目前正研究用于治疗老年性痴呆。众多研究发现一些具有乙酰胆碱酯酶抑制的活性成分，主要为生物碱类、萜类和香豆素类等结构类型的化合物，表1、图1分别对其活性和结构进行了归纳。其中生物碱类乙酰胆碱酯酶抑制剂如石杉碱甲、加兰他敏等因活性高、选择性强而受到广泛的关注。 不可（难）逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂 即，有机磷农药
蔬菜中农药残留检测方法研究
蔬菜中农药残留检测方法研究 【摘要】随着栽培技术的不断进步，农药残留的问题越来越严重，对消费者的身体健康构成了严重威胁。开展蔬菜中农药残留检测方法的研究是控制农药残留保证食品安全的基础，具有重大的意义。本文介绍了蔬菜中农药残留检测的各种方法并对前景进行了展望。 【关键词】蔬菜、农药残留、检测、研究进展 随着栽培技术的不断进步，蔬菜的生长期已越来越短，而随着环境污染的加剧，蔬菜的病虫害也越来越重，绝大部分蔬菜需要连续多次放药后才能成熟上市。农药污染较重的有叶类蔬菜，其中韭菜、油菜受到的污染比例最大。茄果类蔬菜如青椒、番茄等，嫩荚类蔬菜如豆角等，鳞茎类蔬菜如葱、蒜、洋葱等，农药的污染相对较小。农药残留监测体系的建立，对农药残留的监测手段和检测水平提出了更高要求，并促进了农药残留快速检测方法的研究和应用进展，使农药残留检测技术朝着更加快速方便、灵敏可靠的方向发展，逐渐以农药残留专业检测机构的少量检测为中心，向现场检测及实验室的大量检测辐射翻。 1 仪器分析法 由于农药的活性成分大多是小分子有机化合物，故多使用气相色(GC，)~41、高效液相色谱(HPLC，)~、气相色谱一质谱联用(GC-MS)嘲和高效液相色谱一质谱联用(HPLC—Ms)同等技术。其中研究最多的是色质联用技术。因为色质联用特别适合于多种标样残留分析，所以国外把它也划为农药残留快速检测技术之列。大部分农药(如有机氯、有机磷、拟除虫菊酯等)残留可使用GC—MS检测昀，检出限一般为1～10 b~g／kg，但对分子量较大、极性或热不稳定性太强的农药及其化合物，GC-MS不适用，需采用高效液相色谱一质谱联用(HPLC-MS)和其他的方法来检测。 1．1 固相萃取技术 固相萃取法是1种基于液相色谱分离机制的样品制备方法，已广泛应用于农药残留检测工作。它根据液相分离、解析、浓缩等原理，使样品溶液混合物通过柱子后，样品中某一组分保留在柱中，选择合适的溶剂把保留在柱中的组分洗脱下来，从而达到分离、净化的目的。SPE克服了液一液萃取技术及一般柱层析的缺点，具有高效、简便、快速、安全、重复性好、便于前处理自动化等特点。根据柱中填料大体可分为吸附型(如硅胶、大孔吸附树脂等)、分配型(c。，c 、苯基柱等)和离子交换型。1L．R_odriguez等人采用固相萃取法通过改变移动相中缓冲液的浓度、pH值、表面活性剂的浓度和类型对蔬菜中的木精、笨基苯酚、锑比灵和有机磷残留量进行分析，结果表明：pH9．2，缓冲液中含有4mmoUL硼酸和75mmol／L胆酸钠能够得到最好的结果。 1．2 固相微萃取 加拿大Waterloo大学Pawliszyn 1990年首创的一种无需溶剂的萃取技术，它是在固相萃取的基础上发展起来的一种新型的预处理技术。SPME技术由固相萃取技术(SPE)发展而来，对目标化合物有较好的选择性，并且有较高的灵敏度，
胆碱酯酶活力测定在有机磷中毒中的作用评价
胆碱酯酶活力测定在有机磷中毒中的作用评价关键词：有机磷中毒；胆碱酯酶活力；评价 胆碱酯酶是一类糖蛋白，以多种同功酶形式存在于体内。有机磷农药进入人体后与乙酰胆碱酯酶结合，形成稳定而无活性的磷酰化胆碱酯酶，从而失去水解乙酰胆碱的能力，导致乙酰胆碱积聚而引起的一系列临床综合症。故胆碱酯酶活力测定对于诊断、临床抢救和治疗有着重要意义。 1 诊断价值 血清胆碱酯酶活力检测是诊断有机磷农药中毒的特异性指标。有机磷农药进入人体后与胆碱酯酶结合形成较为稳定的磷化胆碱酶，使其失去分解乙酰胆碱的能力，引起乙酰胆碱在体内大量蓄积，导致神经功能过度兴奋，继而转入抑制，出现一系列毒蕈碱样、烟碱样及中枢神经系统中毒症状和体征［1］。因此，急性有机磷农药中毒可根据有机磷农药接触史，结合临床呼出气有蒜臭味、瞳孔针尖样缩小、大汗淋漓、腺体分泌增加、肌纤维颤动和意识障碍等中毒表现，一般可做出诊断，如有全血胆碱酯酶活力降低，更可确诊。但在早期轻度中毒患者其活力可不降低。 2 抢救价值 急性有机磷农药中毒的抢救过程中，快速阿托品化是决定抢救成败非常关键的环节之一，有的医院甚至采用宁多勿少的原则，极易出现阿托品中毒。轻度有机磷农药中毒时，阿托品化较易识别，而对于极重型中毒，由于各种原因造成脑细胞中毒和代谢障碍，皮层下中枢失去了对血管神经的调节，影响了阿托品化的正确判断［2］。长期以来，在急性有机磷中毒的抢救中，一直采用阿托品化指标作为抗胆碱药使用依据，由此引起的阿托品使用过量，中毒而致死者并不少见。由于阿托品化指标受多种因素的影响，如急性有机磷农药中毒（AOPP）合并脑水肿时，瞳孔散大，烦躁不安；合并心衰时，心率快，双肺啰音；合并感染时，体温升高等。阿托品化指标已不能作为指导抗胆碱药使用的依据。胆碱酯酶活力（ChE）是诊断AOPP的特异性实验室指标，对中毒程度、疗效判断及预后估计均极为重要，AOPP时活力变化与中毒症状平行，当ChE活力>50%时一般不再出现反跳症状［3］。故动态胆碱酯酶活力监测，可以为合理使用抗胆碱药提供了客观依据，便于及时调整抗胆碱药用量，避免抗胆碱药过量或不足，节省用药量，减少用药次数。在对有机磷农药重度中毒患者抢救过程中如足量应用阿托品症状改善不快，血清胆碱酯酶活力恢复缓慢要及时查找原因，必要时采用输血或换血疗法。 3 后续治疗价值 随着解毒药物的应用，多数患者的临床症状会明显缓解，通常于6h内达阿托品化，甚至出现阿托品中毒表现。个别患者治疗后24、48h血清胆碱酯酶活力
药典附录ⅨQ.农药残留量测定法
附录ⅨＱ.农药残留量测定法 本法系用气相色谱法（附录ⅥE）测定药材和饮片及制剂中部分有机氯、有机磷和拟除虫菊酯类农药，除另有规定外，按下列方法测定。 一、有机氯类农药残留量测定 色谱条件与系统适用性试验弹性石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm) SE-54，63Ni-ECD电子捕获检测器。进样口温度230℃；检测器温度300℃。不分流进样。程序升温：初始100℃，每分钟10℃升至220℃，每分钟8℃升至250℃，保持10分钟。理论板数按α-BHC峰计算应不低于1×106，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。 对照品储备液制备精密称取六六六(BHC)[α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC),滴滴涕(DDT)[ PP’-DDE，PP’-DDD，OP’-DDT，PP’-DDT]及五氯硝基苯(PCNB)农药对照品适量，用石油醚(60～90℃)分别制成每1ml约含4～5μg的溶液，即得。 混合对照品储备液的制备精密量取上述各对照品储备液0.5ml置10ml量瓶中,用石油醚(60～90℃)稀释至刻度，即得。 混合对照品溶液的制备精密量取上述混合对照品储备液，用石油醚(60～90℃)制成每1L含0μg、1μg、5μg、10μg、50μg、100μg、250μg的溶液，即得。 供试品溶液制备药材和饮片取供试品于60℃干燥4小时，粉碎成细粉，取约2g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，加水20ml浸泡过夜，精密加丙酮40ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用丙酮补足减失的重量，再加氯化钠约6g及二氯甲烷30ml，称定重量，超声处理15分钟,再称定重量，用二氯甲烷补足减失的重量，静置（使分层），将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠的100ml具塞锥形瓶中，放置4小时。精密量取35ml，于40℃水浴上减压浓缩至近干，加少量石油醚(60～90℃)如前反复操作至二氯甲烷及丙酮除净，用石油醚(60～90℃)溶解并转移至10ml具塞刻度离心管中,加石油醚(60～90℃)至5ml。小心加入硫酸1ml，振摇1分钟，离心(3000转／分)10分钟。精密量取上清液2ml置具刻度的浓缩瓶中，连接旋转蒸发器，40℃下(或用氮气)将溶液浓缩至适量、精密稀释至1ml，即得。 制剂取供试品，研成细粉(蜜丸切碎，液体制剂直接量取)，精密称取适量(相当于药材和饮片2g)，以下按上述供试品溶液制备，即得供试品溶液。 测定法分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各1μl，分别连续进样3次，取3次平均值，按外标法计算供试品中9种农药残留量。 二、有机磷类农药残留量测定
胆碱酯酶抑制剂
胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔茨海默病的系统评价 自1997年首次使用胆碱酯酶抑制剂(ChEI)治疗阿尔茨海默病以来,多数临床医师和绝大多数患者均把胆碱能药物,如多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明作为轻至重度阿尔茨海默病的一线药物治疗用药。这些药的药代动力学特征有轻度差异,但都是通过阻断乙酰胆碱酯酶,抑制乙酰胆碱这种与记忆相关的重要神经递质的失活。这类药物可以改善阿尔茨海默病的临床表现。为评估上述药物治疗因阿尔茨海默病引发的轻、中或重度痴呆的疗效,英国牛津大学的Birks检索了Cochrane痴呆与认知改善组登记库,从中提取相关数据进行分析,并于今年1月25日在线发表了分析结果。 多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明这3种ChEI对轻至重度阿尔茨海默病都是有效的。在治疗开始前,无法确定药物治疗对哪些患者更有效。无证据表明ChEI治疗是没有价值效益的。尽管上述3种药的作用模式略有不同,但没有证据表明其疗效存在差异。与利凡斯的明相比,多奈哌齐导致的不良反应更少。如果在给患者用药前逐步细致地进行超过3个月的常规剂量滴定,患者对加兰他敏和利凡斯的明的耐受性与多奈哌齐相当。多奈哌齐的滴定较简单,因考虑使用较低剂量。 阿尔茨海默预后和治疗 认知功能的衰退是不可避免的,但病情进展的速度是不可预料的.存活期自2年至20年不等,平均为7年. 对阿尔茨海默病的一般性治疗原则与所有痴呆的治疗相同(见上文痴呆的治疗). 某些能增强胆碱能神经传递的药物,例如Donepezil[即安理申(aricept)],至少在疾病的早期阶段能暂时改善记忆功能.不过,这些药物并不能改变基本病理变化的稳步恶化.他克林(tacrine)引起的不良反应较多.安理申开始试用的剂量是每天晚上1次5mg,过4~6周以后,可增加至10mg；须连续用药数月才能评估其疗效.有关抗氧化剂(如维生素E),雌激素和非类固醇抗炎药的治疗尚在研究之中. 许多药物都能引起中枢神经系统不良反应,包括精神错乱和倦怠.镇静剂如苯二氮类药物,应尽可能避免使用.抗胆碱能药物,例如某些三环类抗抑郁剂,抗组胺制剂,抗精神病药物以及苯甲托品,均应避免使用. 银杏叶浸出物能使阿尔茨海默病或血管性痴呆病例的记忆丧失与其他症状进展有所减慢或有中度的逆转.银杏叶制剂可能起着自由基清除剂的作用.不良反应很轻微；治疗应用尚需进一步研究. 老年痴呆症前兆是什么 导读：一般老年痴呆症前兆有什么呢?由于前期老年痴呆症患者的生活基本可以自理，所以很多时候人们往往忽视了老年痴呆症前兆，被发现时基本都是中晚期了。因此了解老年痴呆症前兆可以帮助患者及时发现病情，以及更好的治疗老年痴呆症。 老年痴呆症,指的是一种持续性高级神经功能活动障碍,简单点说就是在没有意识障碍的状态下,记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面发生了障碍。一般老年痴呆症常常发生在50岁以后,起病隐匿,发展缓慢,最早期往往是以逐渐加重的健忘开始,如果不注意,通常不容易发现,常听有些老年人说:“老了,记性不行了,不中用了。”这其实可能就是老年痴呆症的先兆。 一般老年痴呆症前兆有什么呢?下面请百济药师来为大家介绍老年痴呆症前兆。 老年痴呆症前兆 1、记忆力减退：尤其是近记忆力减退是老年痴呆症早期最常见的前兆。经常忘记近期得到的一些信息，如约会、人名或电话，忘记熟人的名字，不记得刚刚发生(甚至自己做过)的事，还有拿什么东西转手就忘。 2、不能完成熟悉的工作：难以胜任日常家务，而这些家务通常不需要思考。例如，经常做饭的人现在却不知如何做，以前是个精于计算的人，现在连买菜的小账和简单的加减法都算不清。
乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定试剂盒说明书
货号：MS2000 规格：100管/96样乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。 测定原理： AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。 试剂四：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 测定操作： 1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。 3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL试剂二、10μL试剂三和10μL 试剂四，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。 注意：空白管只需测定一次。 AchE活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1.组织AchE活性 （1）按照蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。 AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷（Cpr ×V样）÷T 第1页，共2页
农药残留量测定法
1．主题内容：建立有农药残留量测定法操作方法。 2．适用范围：本规程适用于检查药物在生产过程中的农药残留量测定法的操作。 3．引用标准：《中国药典2010版一部》 4．责任：化验员、QC主管。 5. 用途：化验室 6．检查内容及方法 本法系用气相色谱法（附录ⅥE）测定药材、饮片及制剂中部分有机氯、有机磷和拟除虫菊酯类农药，除另有规定外，按下列方法测定。 6.1有机氯类农药残留量测定 6.1.1色谱条件与系统适用性试验 弹性石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm）SE-54（或DB-1701），63Ni-ECD电子捕获检测器。进样口温度230℃，检测器温度300℃，不分流进样。程序升温：初始100℃，每分钟10℃升至220℃，每分钟8℃升至250℃，保持10分钟，理论板数按α-BHC峰计算应不低于1×106，两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5. 6.1.2对照品储备液的制备 精密称取六六六（BHC）（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC）、滴滴涕（DDT）（PP′-DDE，PP′-DDD，OP′-DDT，PP′-DDT）及五氯硝基苯（PCNB）农药对照品适量，用石油醚（60~90℃）分别制成每1ml约含4~5μg的溶液，即得。 6.1.3混合对照品储备液的制备 精密量取上述各对照品储备液0.5ml，置10ml量瓶中，用石油醚（60~90℃）稀释至刻度，摇匀，即得。 6.1.4混合对照品溶液的制备 精密量取上述各对照品储备液，用石油醚（60~90℃）制成每1L分别含0μg、1μg、5μ
g、10μg、50μg、100μg、250μg的溶液，即得。 6.1.5供试品溶液的制备 药材或饮片：取供试品于60℃干燥4小时，粉碎成细粉，取约2g，精密称定，置100ml 具塞锥形瓶中，加水20ml浸泡过夜，精密加丙酮40ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用丙酮不足减失的重量，再加氯化钠约6g，精密加二氯甲烷30ml，称定重量，超声处理15分钟，再称定重量，用二氯甲烷补足减失的重量，静置（使分层），将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠的100ml具塞锥形瓶中，放置4小时。精密量取35ml，于40℃水浴上减压浓缩至近干，加少量石油醚（69~90℃）如前反复操作至二氯甲烷及丙酮除净，再用石油醚（69~90℃）溶解并转移至10ml具塞刻度离心管中，加石油醚（69~90℃）精密稀释至5ml，小心加入硫酸1ml，振摇1分钟，离心（3000转/分）10分钟，精密量取上清液2ml，至具刻度的浓缩瓶（见图）中，连接旋转蒸发器，40℃下（或用氮气）将溶液浓缩至适量，精密稀释至1ml，即得。 6.1.6制剂 取供试品，研成细粉（蜜丸切碎，液体直接量取），精密称取适量（相当于药材2g），以下按上述供试品溶液制备法制备，即得供试品溶液。 6.1.7测定法 分别精密吸取供试品溶液和与之相对应浓度的混合对照品溶液各1μl，分别连续进样3次，取3次平均值，按外标法计算公式品中9中有机氯农药残留量。 6.2有机磷类农药残留量测定 6.2.1色谱条件与系统适用性试验 弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）DB-17MS（或HP-5），磷酸检测器（NPD）。进样口温度220℃，检测器温度300℃，不分流进样。程序升温：初始120℃，每分钟10℃升
不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选
· 27 · 刘佳莉1，2 ?苑玉和1?陈乃宏1 1. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京，100050，中国 2. 天津中医药大学，天津，300193，中国 【摘要】 目的：建立一种可靠、快速、便捷、经济的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase ，AChE ）抑制剂的筛选方法，为新药发现阶段AChE 抑制剂的筛选提供经济可靠的微量筛选方法，然后对植物提取物样品进行筛选。方法：分别采用电鳗AChE 、人源红细胞AChE 、大鼠海马区、纹状体匀浆液中的AChE 为酶源。以96孔板为载体，利用优化的Ellman 方法，在生理pH 值和温度的条件下，以他克林和石杉碱甲作为阳性对照，检测对不同酶源AChE 的抑制作用，确定最佳酶反应条件（最佳底物浓度、反应时间、显色剂浓度），并对植物提取物样品的AChE 抑制作用进行检测。结果：采用上述四种酶源的AChE 进行AChE 抑制剂微量筛选方法操作简便快速、可靠经济。其中应用电鳗AChE 进行筛选显示灵敏度较高，他克林和石杉碱甲对电鳗AChE 的抑制作用相当，而对人源红细胞AChE 、大鼠海马区、纹状体匀浆酶源的抑制作用，石杉碱甲明显优于他克林，所筛选植物提取物对AChE 均没有抑制作用。结论：本实验中所建立的筛选方法操作简便、快速、可靠经济，可用于纯化合物的筛选。【关键词】 乙酰胆碱酯酶；石杉碱甲；他克林；阿尔茨海默病 【中图分类号】 R965.1 【文献标识码】 A 文章编号：2095-1396（2011）03-0027-004 Comparative Study on Screening Acetylcholinesterase Inhibitors from Different Enzyme Sources LIU Jia -li 1，2 ，YUAN Yu -he 1，CHEN Nai -hong 1 1. S tate Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines ，Institute of Materia Medica ，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College ，Beijing ，100050，China 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine ，Tianjin ，300193，China 【ABSTRACT 】 Objective ：To establish a reliable ，fast ，convenient and economical method of screening acetylcholinesterase inhibitors ，and use it to screen acetylcholinesterase inhibitors from extracts of plants. Methods ：Using the optimized Ellman method ，we examined the inhibition effects of tacrine and huperzine on acetylcholinesterase enzyme from electric eel ，human erythro-cyte ，rat hippocampus ，striatum homogenate in 96-well plates under physiological pH value and temperature. The concentration of AChE ，substrate and DTNB ，and reaction time were optimized. We also detected the inhibition effect of plant extracts on AChE. Results ：Practical microassays for screening AChE inhibitors were successfully established by using AChEs mentioned above. 不同酶源乙酰胆碱酯酶的抑制剂筛选方法比较 基金项目： 国家自然科学基金项目（No.U832008，30973887，81073078，81102831，90713045，81072541），科技部项目（No.2010DFB32900）， 国家科技重大专项（No.2012ZX09301002-004） 作者简介：刘佳莉，女，硕士生；研究方向：神经药理学和神经生物学；Tel/Fax：+86-10-63165182，E -mail：liujialiyx@https://www.360docs.net/doc/df14854183.html, 通讯作者：?陈乃宏，男，研究员，博士生导师；研究方向：神经系统疾患创新药物开发及作用机制；Tel/Fax：+86-10-63165177，E -mail： chennh@https://www.360docs.net/doc/df14854183.html,
乙酰胆碱酯酶活性测定
乙酰胆碱酯酶酶活的测试 作者：陈志坚 1 准备工作 0.1mol/L pH=8.0的磷酸缓冲液：NaH2PO4 1.68g，Na2HPO4 12.21g溶于1L水。 2 酶液制备 SD大鼠，断头处理后，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入少量冰冻的磷酸盐缓冲液( 磷酸盐缓冲液漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液，称质量) ，用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冻磷酸盐缓冲液冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。然后再加入冰冻的磷酸盐缓冲液，按脑组织质量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。将制备好的10%脑匀浆以3000r/min离心15min，取上清液待测。 3 酶活性抑制测试 3.1 配药液 参照脲酶实验 3.2DTNB 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、ATCh碘化硫代乙酰胆碱 0.0314mol/L DNTB，0.0314mol/L ATCH 3.3 酶活测试 在3.00ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液,混匀后37℃保温20min后, 依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。酶活力定义为每克脑蛋白每分钟水解底物的umol数。这是未加药酶活力为E1。 在2.98ml磷酸盐缓冲液(0.lmol/L,pH=8.0)中加入20uL酶液，并加入不同浓度的药物（一个浓度测定一次），依次加入100ulDTNB溶液(终浓度1.0mmol/L)和20uLATCh溶液(终浓度1.0mmol/L),充分混合,反应体积为3.14mL。在412mn处用1cm比色皿，每隔0.5min读数,连续测定3min。计算出此时酶活，为E2。 抑制率计算公式为I（%）=(E1-E2)/E1*100% 得到一系列不同浓度的抑制率以后，利用SPSS计算出药物的IC50。