细菌简单染色和革兰染色
实验二细菌的简单染色和革兰染色
一、实验目的
1、学习无菌操作技术，掌握细菌涂片的制作方法。
2、掌握细菌简单染色法和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3、巩固显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理
细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。
革兰氏染色法（Gram Staining）由丹麦病理学家Christian Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别分类为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）这两种类型。
革兰氏染色法之所以能够将细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同。一般认为革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色，再经蕃红复染就染成了红色；革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色。
虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、待鉴定的未知菌S1和S3。
2、仪器及其他用品：显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、盖玻片、擦镜纸、
擦镜液、吸水纸、镜油、无菌牙签。
3、简单染液：草酸铵甲紫染液、番红染液。
4、革兰染液：草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液
四、实验步骤
（一）简单染色
1、载玻片的处理：从乙醇溶液中取出洗干净的载玻片，用吸水纸擦干，将要涂菌
的部位在酒精灯火焰上烤一下，去除油脂，冷却待用。
2、涂片:左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧待冷却后，用接种环从试
管枯草芽孢杆菌培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。注意在拔或塞试管塞时，应将试管口在火焰处略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
3、干燥：涂片后室温下自然干燥。
4、固定：手持载玻片一端使标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动2~3
次，要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。固定的目的是杀死微生物，固定其细胞结构，保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉。
5、染色：在固定好的涂片标记处滴加1滴草酸铵甲紫染液，染色1min。
6、水洗：缓慢冲洗染液，吸干。
7、实验搭档改用大肠杆菌培养液和番红染液，同时操作以上步骤。
8、镜检：观察两个标本，区分辨别染成的紫色和红色。
（二）革兰染色
1、制片：分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、未知菌S1和S3
的菌液制成涂片，干燥，固定。
2、初染：滴加1滴草酸铵甲紫染液，染色1min，水洗，吸干。
3、媒染：再加1滴碘液覆盖涂片1min，水洗。
4、脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动
玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
5、复染：滴加蕃红染液复染3min，水洗。
6、镜检：吸干水后，盖上盖玻片观察标本，观察时注意细菌形态、大小、排列和
颜色。
（三）选做实验
在干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片后，进行革兰氏染色后观察。
五、实验结果与讨论
1、革兰染色照片结果（见下一页）
（1）枯草杆菌
图1 枯草杆菌革兰氏染色结果，10×100
如上图所示，枯草杆菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。
注：图中红色箭头所指的特殊结构——芽孢。
（2）酵母菌
图2 酵母菌革兰氏染色结果,10×100
如上图所示，酵母菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。
注：图中红色箭头所示为出芽现象。
（3）金黄色葡萄球菌
图3 金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,10×100
如上图所示，金黄色葡萄球菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。
注：从图中可以清晰地观察到葡萄球状的细菌形态。
（4）大肠杆菌
图4 大肠杆菌革兰氏染色结果,10×100
如上图所示，大肠杆菌染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—）。（5）未知菌液S1
图5 未知菌液S1涂片革兰氏染色结果,10×100
如上图所示，菌液中有两种主要的细菌。
注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+），由细菌形态推测为一种杆菌；蓝色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—），由
细菌形态推测为一种球菌。
（6）未知菌液S3
图6 未知菌液S3涂片革兰氏染色结果,10×100
如上图所示，菌液中只有一种主要的细菌。
注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—），由细菌形态推测为一种球菌或葡萄球菌。
（7）牙垢
图6 牙垢涂片中微生物染色结果，10×100
牙垢中含有多种细菌，多数染色为紫色，是革兰氏阳性菌（G+），如红色箭头所示为革兰氏阳性杆菌。
3、思考题
（1）分析影响某一微生物革兰染色结果的因素。
答：①菌龄：染色所用的细菌最好是出于对数生长期的细菌。因为此时细菌生长旺盛，个体数目较多，便于观察。若菌龄过大，细菌大量死亡或部分菌自然溶解，造成细胞壁通透，阳性菌出现假阴性，使得染色结果受到干扰，不准确。
②载玻片清洁：载玻片应清洁无油脂，可以在酒精等火燃上烤一下以去除油脂。
③涂片厚度：涂片厚度太薄，会使细菌过于稀少，但也不宜太厚，因为过厚会使菌体堆
积，影响观察，同时染色时可能会残留结晶紫染料，易出现假阳性。
④干燥温度：最好让细菌涂片自然干燥。如果在火焰上略加灼烧令其干燥，温度不能超
过60度，若温度太高则菌体变形。
⑤热固定温度：将已干燥的涂片在火焰上通过3-4次，温度不超过60度，以手背接触
不烫为宜。温度低则菌体固定不牢，水洗时易被冲去；温度高菌体发生变形。
⑥染色：初染色时间应控制在30s~1min为宜。如果染色时间过短, 不利于初染液结晶
紫与细胞结合,造成阳性菌呈阴性结果。而染色时间过长, 不易脱色，易使阴性菌呈假阳性。
⑦乙醇脱色：脱色时间最好在10~20s，以恰好洗脱液物色为准，如果时间过长, 革兰
阳性菌也有可能被脱色, 结果呈假阴性。而若脱色时间不足, 革兰阴性菌细胞壁的部分类脂质未被乙醇溶解,使结晶紫-碘的复合物不能被洗脱出来,结果呈假阳性。
（2）思考一下，我们平常使用的甲紫药水杀菌机理。
答：龙胆紫为碱性阳离子染料,其阳离子能与细菌蛋白质的羧基结合，从而影响其代谢，对革兰氏阳性菌有选择性抑制作用，因而产生杀菌作用。一般医用的紫药水是龙胆紫的1％～2％水溶液或酒精溶液，是常用的外用药。对革兰氏阳性菌、绿脓杆菌、及真菌（如念珠菌以及皮肤癣菌等）有较强杀菌作用，对革兰氏阴性菌和抗酸菌作用不显著。对组织无刺激性。
六、实验小结
这堂课学习了革兰氏染色方法，由于陈老师对细节讲解得很到位，实验过程十分顺利。这堂课我还和周围的同学进行了讨论交流，彼此交换了经验，使得实验更加流畅、实验原理更加明了。最后还要感谢陈老师、麻老师和各位助教的耐心细心的讲解和指导。
七、参考文献
陈金春、陈国强主编，《微生物学实验指导》，清华大学出版社，2005年8月
3实验三细菌革兰氏染色
实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察 一、实验目的： 1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。 2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。 3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。 4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。 5、学习并掌握芽孢染色法。 6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。 二、主要仪器设备及材料： 1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面 2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿 3、仪器与材料： 生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉 三、原理： 微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用与细菌的单染色法基本原理一样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同
革兰氏染色的实验原理
革兰氏染色的实验原理 ●G＋细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。 涂片固定→结晶紫初染（碱性）→碘液媒染→乙醇（丙酮）脱色→番红复染（碱性）
◆◆◆原理： 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤： 1、制片 涂片——干燥——固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟； 4、脱色 滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗； 5、复染 用番红液复染约2分钟，水洗； 6、镜检 干燥后，用油镜观察。 细菌：细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。一般体积微小，通常需要借助光学显微镜才能看到，其测量单位用微米表示。
革兰染色液
革兰染色液 【产品名称】 革兰染色液 【包装规格】 货号：DM0016 单瓶包装规格分别为：20ml、100ml、250ml、500ml、5000ml； 每套/盒包装规格分别为：4×20ml/盒、4×100ml/盒、4×250ml/盒、4×500ml/盒。 【预期用途】 用于细菌或真菌的涂片染色。 【检验原理】 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是由肽聚糖层厚度和结构决定的，经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时显现红色，红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来；在革兰阳性细胞染色中乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁不易脱色，所以保持着紫色。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法(属复染法)，可用于标本涂片或菌落涂片，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以临床分类鉴定，染色结果将细菌分为革兰氏阳性菌(紫色)和革兰氏阴性菌(红色)两大类。 【主要组成成分】 试剂组成主要成分 1、结晶紫染色液结晶紫、乙醇 2、碘溶液碘、碘化钾 3、脱色液乙醇、水 4、沙黄染色液或复红染色液沙黄染色液：沙黄、乙醇 复红染色液：品红、乙醇 【储存条件及有效期】 5℃～35℃保存，原包装未开封染色液的有效期为24个月，在有效期内的已开封染色液应在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 涂片时必须注意细心操作，涂片薄而均匀；制备的涂片应自然干燥，采用加热固定时，固定温度不宜过高，以背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变影响观察结果。 【检验方法】 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与水混合均匀，涂成一薄层； 2、干燥、固定：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，也可以用甲醇或乙醇固定； 3、初染：滴加结晶紫染色液染色分钟，水洗，甩干； 4、媒染：滴加碘溶液覆盖载玻片分钟，水洗，甩干； 5、脱色：滴加脱色液摇动秒，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，甩干； 6、复染：滴加沙黄染色液或复红染色液染色，水洗； 7、滤纸吸干或在空气晾干，镜检。 【检验结果的解释】 革兰氏阳性菌呈蓝色至紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
试验四革兰氏染色法
实验四革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌； 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 1．涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
革兰染色
革兰染色 革兰染色原理 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。 革兰染色步骤及结果 1. 涂片：首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。 2.固定：将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，这样重复操作直到薄层干了为止。 3.染色：在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1 min后用水洗，注意水流不要直接对准薄层。 4.媒染：加碘液一滴，染1 min后用水冲洗，用过滤纸吸干。 5.脱色：用95%乙醇脱色，一般脱色时间大概为30 s。这一步是革兰氏染色的关键，必须严格掌握好，如果脱色时间过长则会把阳性菌误认为阴性菌；如果脱色不够则容易被误认为是阳性菌。水洗后用过滤纸吸干。 6.复染：滴加番红染色液一滴，染色10～30 s后，用自来水冲洗。
7.观察：干燥后，用油镜镜检观察，染成紫色的是革兰阳性菌，染成红色的是革兰阴性菌。 革兰染色的意义 1.鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类，便于初步识别细菌，缩小检查范围，并确定进一步的鉴定方法。 2.选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感性不同，如大多数革兰阳性菌对青霉素、红霉素、头孢菌素等敏感；而大多数革兰阴性菌对链霉素、氯霉素、庆大霉素等敏感。可供临床实践中选用抗菌药物的参考. 3.与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为内毒素. 革兰染色的影响因素 1. 涂片太厚在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能会使革兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰阳性菌。 2.脱色时间阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌。而脱色时间太短的话又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为革兰阳性菌。 3. 固定方法固定不仅能杀死细菌，改变细菌对染料的通透性，还能使细菌吸附在玻片上，保持原有的形态结构。固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。如果玻片在火焰上烤的太久、温度过高，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化。影响了染色的结果。 4. 细菌培养时间细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，
革兰染色试剂
革兰染色液说明书 【产品名称】 革兰染色液 【包装规格】 货号：DM0016 单瓶包装规格分别为：20ml、100ml、250ml、500ml、5000ml； 每套/盒包装规格分别为：4×20ml/盒、4×100ml/盒、4×250ml/盒、4×500ml/盒。 【预期用途】 用于细菌或真菌的涂片染色。 【检验原理】 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是由肽聚糖层厚度和结构决定的，经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时显现红色，红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来；在革兰阳性细胞染色中乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁不易脱色，所以保持着紫色。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法(属复染法)，可用于标本涂片或菌落涂片，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以临床分类鉴定，染色结果将细菌分为革兰氏阳性菌(紫色)和革兰氏阴性菌(红色)两大类。 【主要组成成分】 试剂组成主要成分 1、结晶紫染色液结晶紫、乙醇 2、碘溶液碘、碘化钾 3、脱色液乙醇、水 4、沙黄染色液或复红染色液沙黄染色液：沙黄、乙醇 复红染色液：品红、乙醇 【储存条件及有效期】 5℃～35℃保存，原包装未开封染色液的有效期为24个月，在有效期内的已开封染色液应在开封后6个月内使用完，每次用后应及时拧紧瓶盖，以免挥发或变质。 【样本要求】 涂片时必须注意细心操作，涂片薄而均匀；制备的涂片应自然干燥，采用加热固定时，固定温度不宜过高，以背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变影响观察结果。 【检验方法】 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与水混合均匀，涂成一薄层； 2、干燥、固定：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，也可以用甲醇或乙醇固定； 3、染色。 4、滤纸吸干或在空气晾干，镜检。 【检验方法的局限性】 采用陈旧标本涂片时有产生假阴性的可能。 【注意事项】 1、涂片之前，应事先在背面做好圆圈标记，以便判断后续试验的位置。 2、取细菌时，应注意自我防护，拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在
革兰氏染色原理
革兰氏染色的原理和方法 革兰氏染色主要用来区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。先来介绍一下这个实验原理：因为革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖网层较厚且交联致密，没有类脂存在，而革兰氏阴性菌的细胞壁薄，肽聚糖网层薄且交联较差，外膜上存在较多的类脂。两者的这些区别造成了在进行革兰氏染色后出现不同染色结果。革兰氏阳性菌：当结晶紫染液和碘液相遇后，形成不溶性的有色复合物，当用乙醇脱色时，因为胞体的失水，而使得肽聚糖交联更加紧密，网孔缩小，把紫色复合物截留在细胞内，从而使细胞呈现紫色；而革兰氏阴性菌与乙醇脱色时，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能截留形成的紫色复合物，所以呈现无色，再经沙黄复染后呈现红色。 方法：1、涂片：利用移液枪吸取10ul的菌液滴在载玻片，用烧红的涂菌棒涂抹均匀，面积适中。2、干燥与固定：将载玻片放置在酒精灯火焰上方一定距离处，涂菌面向上，将菌液烤干，温度不宜过高，炙烤不宜时间太长，固定就是将涂菌面向上，载玻片快速在火焰中过2-3次。3、初染：在菌液面上滴加1-2滴草酸铵结晶紫，染色1min&oq=革兰氏染色的原理和方法革兰氏染色主要用来区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。先来介绍一下这个实验原理：因为革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖网层较厚且交联致密，没有类脂存在，而革兰氏阴性菌的细胞壁薄，肽聚糖网层薄且交联较差，外膜上存在较多的类脂。两者的这些区别造成了在进行革兰氏染色后出现不同染色结果。
革兰氏阳性菌：当结晶紫染液和碘液相遇后，形成不溶性的有色复合物，当用乙醇脱色时，因为胞体的失水，而使得肽聚糖交联更加紧密，网孔缩小，把紫色复合物截留在细胞内，从而使细胞呈现紫色；而革兰氏阴性菌与乙醇脱色时，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能截留形成的紫色复合物，所以呈现无色，再经沙黄复染后呈现红色。 方法：1、涂片：利用移液枪吸取10ul的菌液滴在载玻片，用烧红的涂菌棒涂抹均匀，面积适中。2、干燥与固定：将载玻片放置在酒精灯火焰上方一定距离处，涂菌面向上，将菌液烤干，温度不宜过高，炙烤不宜时间太长，固定就是将涂菌面向上，载玻片快速在火焰中过2-3次。3、初染：在菌液面上滴加1-2滴草酸铵结晶紫，染色1min。 4、水洗：在小股水流下冲洗，直至无色为止。 5、媒染：吸取300ul 碘液滴在样本上，染色1min。 6、水洗：在小股水流下冲洗，直至无色为止。 7、脱色：倾斜玻片，滴加95%的乙醇，约30s，再水洗一次。 8、复染：在样本上滴加沙黄染液1-2滴，染色1min。9、水洗：在小股水流下冲洗，直至流过玻片的水无色为止。10、干燥与观察：用纸擦去水，干燥后在显微镜下观察，菌体呈现紫色的是革兰氏阳性菌，呈现红色的是革兰氏阴性菌。
PH1237 标准革兰氏染色液实验与操作方法
PH1237|标准革兰氏染色液 Standard Gramˊs Stain Catalog No：PH1237Size：?4×100mL|?4×250mL Store at RT 简介 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。 细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。 红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Standard Gramˊs Stain采用最经典的革兰染色配方,临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组份 名称4×100ml4×250ml Storage 试剂(A):结晶紫染色液100ml250ml RT避光 试剂(B):Gram碘液100ml250ml RT避光 试剂(C):脱色液100ml250ml RT 试剂(D):沙黄染色液100ml250ml RT避光 自备材料 1、接种环或挑取细菌的其他工具 2、酒精灯 3、载玻片 4、光学显微镜 操作步骤 (仅供参考)： 1、涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，混合均匀，涂成一薄层。 2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥。 3、固定：手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3~5次，每次1s，温度不宜过高，防止菌体蛋白变性，放置待凉后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。 4、初染：滴加结晶紫染色液染色1~2min，清水冲洗去染色液。 5、媒染：滴加Gram碘液，并覆盖载玻片，室温放置1~2min，水洗。 6、脱色：滴加脱色液，摇动10～30s，直至流下的脱色液不出现紫色时为止，立即用水冲去脱色液，终止反应。
革兰氏染色法的步骤
革兰氏染色法的步骤 详细阐叙革兰氏染色法的步骤 浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案 革兰氏染色 一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。
革兰氏染色法的过程及原理
革兰氏染色法的过程及原理 一，过程 1 ．涂片 将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 二，原理 革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏 多糖的碱性酶，只要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的 B-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分 解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物流 出而使细菌溶解，溶菌酶还可以和带负电荷 的病毒蛋白直接结合，与DNA，RNA，脱辅
标准革兰氏染色液
标准革兰氏染色液 简介： 革兰氏染色法是丹麦医生Christain Gram 于1884年所发明，是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，亦是一种复染法。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，用以分类鉴定。通过此法染色可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G +)和革兰阴性菌(G -)两大类。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它脱色。在革兰阴性细胞染色中，乙醇或丙酮破坏了胞壁外膜、损伤肽聚糖层和细胞质膜，结晶紫和碘复合物从细胞中渗漏出来，当再用其他染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，所以红色显示不出来。在革兰阳性细胞染色中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘复合物分子太大，不能通过细胞壁，不易脱色，所以保持着紫色。 Leagene Standard Gram ˊs Stain 采用最经典的革兰染色配方, 临床标本直接涂片，背景干净，胞核胞质对比强烈，胞内吞噬体清晰易辨认，细菌染色特征典型。 组成： 自备材料： 1、 接种环或挑取细菌的其他工具 2、 酒精灯 3、 载玻片 4、 光学显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 涂片：取待检细菌，于载玻片中央涂成薄层或者或在载玻片上滴加少许无菌水，取菌与 的水混合均匀，涂成一薄层。 编号 名称 DM0015 4×10ml DM0015 4×100ml DM0015 4×250ml DM0015 4×500ml Storage 试剂(A): 结晶紫染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(B): Gram 碘液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 试剂(C): 脱色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 试剂(D): 沙黄染色液 10ml 100ml 250ml 500ml RT 避光 使用说明书 1份
革兰氏染色镜检的操作规程
革兰氏染色镜检的操作规程 1.目的：鉴定G阳性菌.G阴性菌（球菌、杆菌、真菌）。指导临床用药。 2.原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gtam所创立的，此方法可将所有的细菌分G+和G-两大类，G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染性的颜色。 3.实验器材：载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。 4.试剂： 4.1试剂来源：购买，四川迈克。 4.2试剂合组成: R1结晶紫1χ10ml R2碳酸钠1χ10 ml R3碱性碘液 1χ10ml R4丙酮酒精1χ20ml R5碱性复红1χ10ml 5.标本采集与处理： 5.1阴道,子宫等分泌物应由医生采集,收集于无菌试管内送检。 5.2载玻片的预处理: 5.2.1载玻片用前以９５％乙醇擦拭脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片。 5.2.2在玻片背面一端的1/3处注明编号。 5.3涂片： 5.3.1用棉签可直接在玻片上均匀涂抹. 5.3.2菌液涂片时,用接种环沾取菌液,点在玻片上.
,在盐水中涂布。 6.染色方法: 6.1将标本均匀涂布于玻片上,自然干燥,火焰固定。 6.2冷却后加R1、R2各两滴初染30秒后水洗。 6.3用R3媒染30秒.水洗后用R4脱色至无兰色脱落为止(约有5-10秒),水洗。 5.4用R5复染5秒,水洗,待干,镜检。 7.镜检: 7.1取已干燥的涂片,用低倍镜览片,再用高倍,最后用油镜观察,并在已干燥的涂片滴1-2滴香柏油,仔细观察. 7.2判断菌体的革兰氏染色反应性,呈紫色为G+菌,呈红色为G-. 8.报告方式: 检出革兰氏阳性球菌,革兰氏阳性球菌. 检出革兰氏阴性球菌，革兰氏阴性球菌。 9.实验完后的处理: 9.1显微镜头的处理:用擦镜纸将油镜头的油擦去,再用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次,最后用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次.注意向一个方向擦拭. 9.2废弃标本和污物的处理: 9.2.1染色玻片放入5%84消毒液中浸泡30-60分钟,消毒液要每天更换. 9.2.2废弃标本及污物应弃于有盖的污物桶内,由专人收并送焚烧炉内彻底焚化. 10.注意事项: 10.1涂片应均匀,厚薄适度,自然干燥后再加热固定. 10.2脱色要至无兰色脱落为止.
革兰氏染色法的过程及原理
革兰氏染色法的过程及原理一，过程 1 ．涂片将培养的不同菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚)，干燥、固定。固定时通过火焰l 一 2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 )初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 )媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 )脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 )复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 )镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 ( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。二，原理 革兰氏染色法( Gram stain )不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示：染色反应呈红色(复染颜色) 的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液 (番红)的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏 多糖的碱性酶，只要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的B-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物流出而使细菌溶解，溶菌酶还可以和带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA RNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，因此该酶具有抗菌消炎，抗病毒等作用 判断细菌有无鞭毛的方法 电镜观察，鞭毛染色，半固体穿刺培养，菌落形态观察 描述细菌与古细菌在细胞膜上的主要化学区别 在革兰氏阴性菌的表层，有由肽葡聚糖形成的细胞壁，在壁的外面，又有由蛋白质、磷脂质、脂多糖形成的膜层，与里面的细胞质膜相对应，特称此层为细菌外膜。夕卜膜比细胞质膜的磷脂质含量低，但脂多糖的含量则比较高。夕卜膜的蛋白质与细胞质膜不同，主要部分为数种蛋白质所构成。其主要蛋白质的部分与特异的内面的肽葡聚糖以共价键结合。脂多糖存在于外膜的最外层。在
细菌的简单染色和革兰氏染色
实验细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的要求 1、学习制染色片技术，学习简单染色的原理和方法。 2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 二、实验原理 细菌的菌体很小，活细胞的含水量在80％～90％，因此对光的吸收和反射与水溶液相差不大，所有观察其细胞结构必须染色。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。本实验只学习前两种。 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三、实验器材 菌种：培养24小时的大肠杆菌 染色剂和试剂：石炭酸复红染色液，革兰氏染色液(草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)，香柏油、二甲苯 器材和器皿：显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，接种环，擦镜纸，吸水纸，火柴，小烧杯，玻片架、试管、小滴管等 四、操作方法 1、简单染色： （1）涂片：取干净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央，严格按无菌操作程序，挑取大肠杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多；涂片必须均匀；涂布面积直径约1.5cm为宜；挑取菌种时切勿将培养基挑破。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在搁架上，加复红染色1-2min。 （5）水洗：染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
革兰染色实验报告
实验原理： 1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。 2）G+菌等电点（PI2~3）比G-菌（PI4~5）低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 实验步骤： 一、标本的制备： 1、涂片： 取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。 2、干燥： 目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。 3、固定：
手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。 二、染色 1、初染： 将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。 2、媒染： 加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。 3、脱色： 在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。 4、复染： 用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。 5、镜检。 实验结果：G+葡萄球菌被染成紫色；G-大肠杆菌被染成红色。实验分析：实验中有些组的大肠杆菌被染成了紫色，而实际却应该为红色，这有可能与脱色的时间过少有关，因而将其染成紫色，
革兰氏染色
普通光学显微镜的使用及微生物形态观察与革兰氏染色法 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1.学习显微镜的结构、各部分功能和使用方法 2.学习细菌制片方法 3.学习细菌染色原理和方法 4.巩固无菌操作技术 5.学习图像结果的规范表示 【实验原理】 1.显微镜的结构和各部分功能 现代普通光学显微镜 利用目镜和物镜两组透 镜系统来放大成像，故又 常被称为复式显微镜。它 们由机械装置和光学系 统两大部分组成。在显微 镜的光学系统中，物镜的 性能最为关键，它直接影 响着显微镜的分辨率。而 在普通光学显微镜常配 置的几种物镜中，油镜的图1. 显微镜的构造放大倍数最大，对微生
物的研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要有如下两方面的原因：1.1增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100x，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照度却很大。而从显微镜的结构看，从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头）有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时，会因为射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率为1.52）。 1.2增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率和分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力。最小可分辨距离越小，分辨率越高。从物理学角度来看，光学显微镜的最小可分辨距离受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 最小可分辨距离= λ2NA 式中：λ为光源光波长，NA为物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4~0.7μm），而数值孔径值取决于物镜的镜口角和玻片与物镜间介质的折射率，可表示为： NA=n*sin? 式中：?为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距
细菌革兰氏染色实验报告
细菌革兰氏染色实验报告 细菌革兰氏染色实验报告一、实验目的 1.掌握革兰氏染色的方法 2.熟悉细菌涂片的制备 3.革兰氏染色法进行细菌鉴定 二、实验材料 1.实验仪器 显微镜、酒精灯、载玻片、擦镜纸、接种环,接种针,、试管架、镊子、载玻片夹子、滤纸、滴管 2.实验试剂 草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番红复染液、无菌水,蒸馏水,、香柏油、二甲苯 三、方法与步骤 1.操作方法示意图 ,干燥, ,水, ,水, ,水, ,晾干, 制片——初染———媒染———脱色———复染——镜检 2.操作步骤 ,步骤一, 涂片的制作 (1) 涂片载玻片一张,加一滴生理盐水,取菌研磨均匀 (2) 干燥温室干燥,或置酒精灯高处慢慢烘烤 (3) 固定干燥后的涂片,在酒精灯火焰中通过3次 步骤,二,
初染,滴加草氨酸结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色1—2min,后倾去染液,水洗至流出水无色 步骤,三, 媒染,先用碘液冲去残留水迹,在用碘液覆盖1min,倾去碘液,水洗至流出水无色步骤,四, 脱色,将玻片上残留水用吸水纸吸去,在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色,一般20——30s,,当流出液无色时立即用水洗去乙醇。步骤,五, 复染,将玻片上残留水用吸水纸吸去,用番红复染液染色2min ,水洗,吸去残水晾干。 步骤,六, 镜检,像涂片涂菌部位滴加适量香柏油,进行油镜观察【小结】 1. 选用活跃生长期长的菌种染色,老龄的革兰氏阳性菌会被染成红 色,造成假阴性。 2. 涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性 3. 脱色是革兰氏染色是否成功的关键,脱色不够,造成假阳性,脱 色过度造成假阴性。 4. 染色原理 C+菌,胞壁厚,肽聚糖网状分子形成一种透性障,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,故保留结晶紫—碘复合物在细胞膜上呈紫色 C-菌,肽聚糖层薄,交联松散,乙醇脱色不能使其结构收缩,其脂含量高,乙醇将脂溶解,缝隙加大,结晶紫—碘复合物溶出细胞壁,沙皇复染后呈红色。 【注意事项】 1. 加热时使用载玻片及试管夹,以免烫伤。 2. 使用染液时应避免沾在衣物上
革兰氏染色法
实验三细菌的革兰氏染色法 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌； 草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 1．涂片将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2．染色 （1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染用番红液染1～2分钟，水洗。 （5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 五、实验报告 1．结果 在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各染成何色？它们是革兰