改良纤维二糖多粘菌素B多粘菌素E(mCPC)琼脂基础
名称：025110 改良纤维二糖多粘菌素B多粘菌素E(mCPC)琼脂基础
俗称：纤维二糖多粘菌素E(CC)琼脂基础
应用：用于创伤弧菌的选择性分离培养。
创伤弧菌，或称为海洋弧菌，是一种栖息于海洋中的细菌。如果伤口暴露在含有这种细菌的海水中，创伤弧菌会在伤口上繁殖，可能引发溃烂，甚至导致组织坏死。若食用了遭污染的海鲜，也有罹患肠胃炎的可能。
原理：
蛋白胨、牛肉粉提供氮源、维生素和生长因子;氯化钠维持均衡的渗透压;纤维二糖为可发酵的糖类;多粘菌素B和多粘菌素E能抑制副溶血性弧菌和溶藻弧菌等非目标菌的生长;溴麝香草酚蓝和甲酚红为pH指示剂;琼脂是培养基的凝固剂。
微生物图鉴：
培养基基础配方(每升)：
蛋白胨10g
牛肉粉5g
氯化钠20g
溴麝香草酚蓝0.04g
甲酚红0.04g
琼脂15g
最终PH 7.6±0.2
使用方法：
1、称取本基础培养基50.08g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶121℃高压灭菌15min。
2、每支冻干配套试剂在无菌操作条件下加入1mL无菌水，45℃水浴加热完全溶解。
3、将灭菌培养基融化并冷却至45℃左右，每50mL基础培养基加入SR0260配套试剂1支(含纤维二糖0.5g、多粘菌素B50000IU和多粘菌素B20000IU)配成纤维二糖多粘菌素B多粘菌素E琼脂, 每50mL基础培养基加入SR0270配套试剂1支(含纤维二糖0.5g和多粘菌素E20000IU)配成纤维二糖多粘菌素E琼脂,混合均匀后倾注平板。
4、分离：用接种环取菌苔一环，划线接种于平板上，于40℃±1℃(或
36 ℃±1 ℃)培养18～24h。
5、观察结果：创伤弧菌为圆型，扁平，中心不透明边缘透明的黄色菌落。
质量控制：
质控菌株接种后于40±1℃培养18-24小时，结果如下：
菌名菌号生长率菌落特征
创伤弧菌ATCC27562 >1% 圆型，扁平，中心不透明，边缘透明的黄色菌落
霍乱弧菌Vbo ――紫色菌落
副溶血性弧菌ATCC17802 <0.1% 抑制
贮存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。贮存期三年。
规格：250g
实验3---悬浮细胞的培养
本科学生实验报告 姓名王冬梅学院＿生命科学学院＿＿＿专业＿应用生物教育＿班级＿＿08应生A班＿＿＿实验课程名称＿＿＿植物组培实验＿＿＿＿＿＿＿＿＿指导教师及职称＿龙维彪＿＿ 开课学期2010 至＿2011 学年＿下＿学期上课时间2011年3月~ 6月 云南师范大学教务处编印
实验三：胡萝卜细胞的悬浮培养 一、实验目的： 了解植物细胞悬浮培养的基本原理，通过实验掌握植物细胞悬浮培养的方法和技术。并通过实验练习和巩固无菌操作技术 二、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 三、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶等。 四、操作步骤： 胡萝卜细胞的悬浮培养培养基的配制 配方：MS+RT(0.5mg/l)+2,4-D(1)+LH(100)+C(30g/l) PH:5.8 胡萝卜细胞的悬浮培养 将前面培养好的胡萝卜愈伤组织。如下：
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理)
打印 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广，不 同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA (5-500bp) 效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖凝胶电泳原理： 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝 胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于 一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率 的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖在62 C时熔化，因此其中的样品(如DNA)，可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间，重新溶解到溶液中而回收。 由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂 直式电泳应用得相对较少。 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下:
琼脂糖凝胶的制备上课讲义
琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶的制备 一、琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。 琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 ① DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 ②琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 表琼脂糖浓度与DNA分离范围
琼脂糖凝胶电泳标准操作流程
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA 、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA 分子的迁移速度不同。如环形DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA ）、开环分子（ocDNA）、和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA > IDNA >ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA 分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA 构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB ）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA 复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker （分子量标准）（TaKaRa）；D2000（TianGen）；
琼脂糖凝胶的制备(知识资料)
琼脂糖凝胶的制备 一、琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug 蛋白质就可检出。 琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 ① DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 ②琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 表琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 /％
琼脂糖凝胶的配制和DNA回收
配1%的琼脂糖凝胶 称量琼脂糖0.3g，倒入锥形瓶中，再用量筒量取30ml TAE，混到一起，放入微 波炉中煮沸两次，直到看不到颗粒为止（每次大约三分钟），取出后冷却至60℃左右后加入Gold view（万分之一），同时将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。吸取少量琼脂糖溶液封固胶膜边缘，任其凝固，在 距离底板0.5～1.0mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加 样孔，将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个 有机玻璃板表面形成均匀的胶层。凝胶的厚度在3～5mm之间，检查一下梳子 的齿下或齿间是否有气泡。冷却好后拔梳子（30min左右），将板放入电泳槽里，倒入TAE溶液（1X），在冰箱中拿Loading buffer和两个maker（1kb和 D100），将Loading buffer吸到PE手套上（吸取量随意用枪点一下即可）和样 品混匀，向凝胶中加样，两侧的孔里加Maker，通电120V跑胶，红为正，黑为 负（DNA带负电，所以往红色正极处跑），放到紫外盒上看结果，同时将亮带 部分切下来放入1.5ml的已经称完重量的EP管中（若忘了称重量，按照0.9计算），再次称重计算胶的重量，接下来按照DNA回收试剂盒操作步骤回收DNA，测浓度。 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作步骤 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm(~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收 集管中。（请使用当天处理过的柱子） 2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净 的离心管中，称取重量。 3. 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 μl， 则加入100 μlPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以 确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶 胶液，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。 注意：对于回收<300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的 异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为 吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。 4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放 置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附 柱CA2放入收集管中。 注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。 5. 向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养 摘要： 悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。 关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化
1．细胞悬浮培养的定义 定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。 应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。 应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法 2.1 机械法 早期用机械法分离叶组织单细胞。Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。 2.2 酶解法 酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。 酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦、大麦和玉米的叶肉细胞[3]。 2.3 愈伤组织诱导法 以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散行，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。诱导符合这些要求的愈伤组织，首先，必须选择适宜的植物外植体材料。其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。
琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳 跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。 一、基本原理 当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。 由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。 带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*t d为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。 在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。 二、琼脂糖凝胶电泳 通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。具体见表格： 琼脂糖凝胶 /% m/V 分离线性DNA片段的范围 /kb 0.3 50---60 0.6 1----20 0.7 0.8---10 0.9 0.5---7.0 1.2 0.4----6.0 1.5 0.3---3.0
悬浮细胞的传代培养
悬浮细胞的传代培养 关键词：细胞菌株标准物质中心北京标准物网 1)训练目的 熟练掌握悬浮细胞的传代培养法。 2）买验原理 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，维持细胞种的延续。放平细胞瓶，当发现悬浮细胞长到瓶壁85％～90％时，从容器中取出细胞，以1：2或1：3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为悬浮细胞的传代培养。 3)实验材料 CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75％酒精棉球、酒精灯、悬浮细胞株、完全培养基(RPMLl640或DMEM)。 4)操作步骤 A.热培养用液：把已经配制好的培养液瓶子放人37℃水浴锅内预热。
B.用75％酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 C.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 D.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 E.超净工作台内拆除已消毒空培养瓶的外包装。 F.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后放人超净工作台内。 G.从培养箱内取出悬浮细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用75％酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 H.静置：超净工作台内将需传代的培养瓶直立静置半小时左右，待大部分细胞都沉降到细胞瓶底，轻轻吸出1／2～2／3的旧培养基。 I.分瓶：加入新鲜培养液，按1：2或1：3的比例分装到2或3个培养瓶中，再逐瓶加入新鲜培养基。 若想节约时间，并且离心对细胞影响也不大，可采用离心的方式取代静止分离。将培养瓶中的悬浮细胞从培养箱中取出，超净工作台内将所有含细胞的培养液转入离心管，1000r／min。离心5 min，弃上清。加入定量新鲜培养基重悬后以1：2或1：3的比例分装到2或3个培养瓶中培养。
(完整word版)DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。 2、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵
Q-琼脂糖凝胶说明书
Q-琼脂糖凝胶 FF 产品说明书 Q-琼脂糖凝胶 FF 是将三甲胺基烷基季铵基团键合在高流速琼脂糖微球上形成的一种强阴离子交换介质。广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。 1. 外观 本品呈白色，球状、无嗅、无味。 2. 理化指标 项 目 指 标 离子交换基团 -CH 2N +(CH 3)3 离子交换类型 强阴离子，可交换离子Cl -基 质 6% 交联琼脂糖** 蛋白质吸附容量 120mgHSA/ml 介质 总离子交换量 0.18-0.25mmol/ml 介质 形状 球形 粒径 45~165μm 流 速 400~700 cm/h* 最大流速750 cm/h 工作温度 4~40 ℃ 耐热 pH7水中120℃30min 耐压 0.3MPa pH 值稳定性 1~14 (短时间，在位清洗)；2~12(长时间) pH 工作范围 2~12 化学稳定性 在以下液体中稳定：所有常用的水相缓冲液；1mol/L 氢氧化钠；8mol/L 尿素；6mol/L 盐酸胍；70% 乙醇 *检测条件： 层析柱10mm×300mm *柱床高15cm,25℃, 流动相为0.1mol/LNaCl 3. pH 滴定曲线： 4． 包装 产品以聚胺酯瓶密封包装，外贴标签，注明“品名、体积、颗粒大小” 等内容。
5．运输 运输中应避免日晒、雨淋、重压，严禁与有毒、有害物品混运。 6．贮存 产品应密封贮存在4℃~25℃（保存溶液为20% 乙醇），通风、干燥、清洁的地方。不能冷冻。 用过的柱子贮存在4℃（20% 乙醇）。 7.注意事项 本产品避免与氧化剂接触；避免在pH值< 4时长时间暴露(一周,20℃)。 8.保质期：暂定5年。 9.应用 本产品具有高化学稳定性、高流速、高载量、好的机械性能、可在位清洗、多次重复使用等特点，非特异性吸附低，回收率高，适用于工业规模生产，适用于在pH工作范围内可形成负离子的生物大分子的分离纯化，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。 下面简要介绍介质的使用过程。 9.1 装柱 ⑴让所有的材料和试剂达到室温。配制初始缓冲液（平衡液）和洗脱缓冲液。 ⑵根据柱子大小取所需量的凝胶，清洗掉20%乙醇，抽干，用初始缓冲液（按凝胶：缓冲液=3：1的比例）配成匀浆。匀浆作脱气处理。 ⑶将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。 ⑷用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。 ⑸打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2~3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。 9.2平衡 让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。平衡液是低浓度的缓冲溶液，如Tris 、PBS等。 9.3上样 ⑴样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。盐浓度太大的样品处理后再配。 ⑵一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
琼脂糖凝胶电泳技术
电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。 原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。 琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。 琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢 常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 EB是强致癌剂。 电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套 1、胶槽准备 ①将凝胶托盘放入制胶盒中; ②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙; ③将制胶盒放在调整好的水平台上。 2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE; ②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。 3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。 4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。 6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。 8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右 9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数 一、细胞传代 实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。 实验原理： 培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。 实验用品： （一）仪器 净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱； （二）玻璃器皿 吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、 （三）塑料器皿 吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架 （四）其他物品 微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪 （五）试剂 1640培养液、PBS 操作步骤： 1.准备： 打开培养液，PBS； 取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸 头，插入离心管备用。 2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。 3.首先观察培养板孔中培养液量。用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液， 转入离心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，
吸出转入离心管。 4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。 5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML放入离心管， 轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。 6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。 7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。 8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。 9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。 二、细胞计数及生长曲线测定 培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期 潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。 (2) 指数增生期(logarithmic growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact
琼脂糖凝胶电泳 配方与步骤
?RNA琼脂糖凝胶电泳： 配制： 1.0.5M EDTA（pH=8.0）： 100ml：称取18.61g Na2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80ml ddH2O剧烈搅拌， 用NaOH调节PH值至8.0（约需2g NaOH）.高压灭菌，室温保存。 2.50×TAE loading buffer:（Tris acetate-EDTA buffer）电泳缓冲液 组分：2M Tris-乙酸；100mM EDTA（pH=8.0） 500mL:称121.1g Trisbase（分子量121.14），加800ml ddH2O溶解，加57.1ml 乙酸和50ml0.5M EDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。 3.1×TAE loading buffer: 取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。 4.100×Sybergreen： 500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ul Sybergreen原液混匀，4℃锡纸 避光保存。 注意：Sybergreen原液需稀释10000倍； 6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。 步骤： 1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml): 称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。 微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2.胶板制备: 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子. 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3.加样: 样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中 样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul 6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul 100×Sybergreen：0.1ul DEPC水：至10ul (注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面. 4.电泳: 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（trans UV）下观察拍照 保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。 28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊，可有可无
细胞悬浮培养
植物细胞悬浮培养 一、实验目的及意义 植物悬浮培养的细胞具有生长迅速、代谢均匀一致的特点，同时生长环境易于控制。由于培养的细胞对外界的各种反应比较灵敏，植物悬浮培养细胞已成为代谢、生理生化、分子生物学研究的理想材料，同时还可用于突变体筛选、次生代谢产物的生产等领域。通过学习，使学生了解和掌握植物细胞悬浮培养的原理和操作技术。烟草（Nicotiana tubacum Linn.）为茄科经济作物，同时也是植物分子生理生化研究一种重要的模式植物。丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科药用植物，建立悬浮体系，对构建分离纯化其药用物质体系具有重要意义。 二、实验原理 植物细胞悬浮培养（plant cell suspension culture）是将游离的单细胞和小细胞团在不断震荡的液体培养基中进行培养。用于悬浮培养的细胞和细胞团既可来自培养的愈伤组织，也可以通过物理或化学方法从植物的组织或器官中获得。本实验所用的悬浮培养细胞来自疏松的愈伤组织。 植物细胞悬浮培养系统要求：①细胞培养物分散性好，细胞团较小；②细胞形状和细胞团大小均匀一致；③细胞生长迅速。所采用的液体振荡培养具有以下重要作用：①振荡可以对培养液中的细胞团施加一种缓和的流变力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；②振荡有利于细胞在培养基中均匀分布，有利于培养基与细胞间的物质交换；③培养液的流动有利于培养基和容器内的空气通过气液界面之间进行气体交换，保证细胞呼吸所需的氧气，使细胞能迅速生长，同时也有利于二氧化碳的排除。 三、实验仪器与药品 超净工作台，恒温振荡器（摇床），高压灭菌锅，培养室（培养箱），封口膜，油性标记笔，无菌蒸馏水 四、实验材料 烟草愈伤组织 五、操作步骤与方法
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在 固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝 胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。 实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶