偏光显微镜

偏光显微镜
偏光显微镜

镜像鉴定

一、偏光显微镜

1.偏光显微镜的原理

偏光显微镜装有特制的偏光镜,主要是利用双折射与选择吸收产生偏光的原理制成的。

2.偏光显微镜的构造

(1)镜座(2)镜臂(3)反光镜(4)下偏光镜(5)锁光圈(6)聚光镜(7)载物台(8)镜筒(9)物镜(10)目镜(11)上偏光镜(12)勃氏镜(13)粗、微动螺旋

3.偏光显微镜的的调节

(1)装卸镜头

a)装卸目镜(十字丝在东西、南北方向上)

b)装卸物镜

(2)调节照明(对光)

装上中倍物镜与目镜以后,推出上偏光镜与勃氏镜,打开锁光圈;转动反光镜对准光源,直到视域最亮为止。

注意:不要把反光镜直接对准太阳光,这样容易使眼睛疲劳。

(3)调节焦距

a)将欲观察的薄片,置载物台中心,用夹子夹紧;

b)从侧面看着镜头,旋转粗动螺丝,将镜筒下降到最低位置(高倍镜要下降到几乎与薄片接触为止);

c)从目镜里观察,并旋转粗动螺丝使镜筒缓缓上升,直到视域中物象清楚为止。如果物象不够清楚,可转动微动螺丝使之清楚。

(4)校正中心

在显微镜的光学系统中,载物台的旋转轴、物镜中轴、镜筒中轴及目镜中轴应当严格在一条直线上。此时旋转物台,视域中心的物像不动,其余的物像则绕中心做圆周运动。如果它们不在一条直线上,将影响光学性质的鉴定。为此,必须进行校正中心,使它们在一条直线上。校正中心的步骤如下:

a)检查物镜是否安装在正确的位置上,因为校正有一定限度,如果物镜不在正确的位置上,则根本不能校好中心。

b)在薄片中选一小点,置视域中心(十字丝交点上)。旋转物台一周,找出物像旋转中心的位置O点;

c)再旋转物台180o,使小点至a′处;

d)转动校正螺丝,使小点从a′移至O点;

e)移动薄片,将小点移到十字丝中心,旋转物台若小点不动,则中心已校好;若离开十字丝中心,则说明中心还未完全校正,必须按上述步骤重复校正,直到完全校好。

f)若偏心很大,旋转物台小点由十字丝中心移到视域以外,则根据小点移动情况估计此偏心圆的中心O点方位。转动校正螺丝,使小点自十字丝交点a向偏心圆的中心O点反方向移动相当于圆半径长的距离。移动薄片使小点回到十字丝交点,旋转物台可能偏心不大,此时,可按上述偏心小的方法继续校正。

二、晶体光学基础

1.自然光与偏光

光波根据振动的特点,可分为自然光与偏光。

自然光是一切从实际光源发出的普通光波,如太阳光,灯光等。其振动的特点,是在垂直于光波传播方向的平面内作任何方向的振动,而且是均匀对称的。

自然光波经过反射、折射、双折射及吸收等作用,可以成为只在一个方向上振动的光波,这种光波一般称为偏光或偏振光。光波振动方向与传播方向所构成的平面称为振动面,平行传播方向而与振动面垂直的平面称为偏光面。

自然光通过偏光镜后,即成为振动方向固定的偏光。

2.光在均质体和非均质体中的传播方式

根据晶体的光学性质不同,可以把物质分为均质体和非均质体两大类。一切不结晶的物质与等轴晶系矿物的光学性质各方向相同,称为光性均质体,简称为均质体。其他各晶系矿物晶体的光学性质随方向而异,称为光性非均质体,简称为非均质体。

光射入均质体中,发生折射,一般不改变光波的振动性质。光在均质体中向任何方向振动时其折光率大小相同。

光射入非均质体中,发生双折射,产生振动互相垂直而折光率不等的两种偏光。非均质体的折光率大小随振动方向不同而有变化,每一种振动方向都有其相应的折光率值。

并不是光沿任何方向射入非均质体中,都能发生双折射。在非均质体中这种不发生双折射的特殊方向称为光轴。这种光轴在中级晶族晶体中只有一个,故称一轴晶。低级晶族晶体中有两个,故称二轴晶。

3.光率体

光率体是表示晶体中光波振动方向与折光率之间关系的一种光性指示体。在光波的振动方向上,按比例截取折光率值,再把各线段端点联结起来即成为光率体。

均质体的光率体是一个球体。

一轴晶光率体是一个旋转椭球体,而且有正负之分。

二轴晶光率体是一个三轴椭球体。

三、正交偏光镜间晶体光学性质

1.正交偏光镜的装备及特点

所谓正交偏光镜,就是除用下偏光镜以外,再推入上偏光镜,而且使上、下偏光镜的振动方向互相垂直。

在正交偏光镜间不放任何矿片,其视域是最暗的。

将矿物薄片置于正交偏光镜间,因矿物切片性质特点不同而发生消光和干涉现象,成为正交偏光镜间研究矿物的重要根据。

2.正交偏光镜间矿物的消光现象

均质矿物与非均质矿物垂直光轴切片,旋转载物台360°为全消光。非均质矿物其他方向切片,则为四次消光;所以全消光的切片可能是均质矿片,也可能是非均质矿物垂直光轴切片;而四次消光的是非均质矿片。

四、油浸法概述

1.油浸法的原理

油浸法测定折光率,是将欲测矿物碎屑浸于已知折光率的油中,比较二者的折光率,通过一系列浸油的更换,使之与被研究矿物的折光率相等,以这种浸油的折光率作为矿物的折光率。

比较矿物与浸油折光率大小的原理,和薄片中比较矿物折光率原理相同。如果浸油的折光率和矿物的折光率不等,在单偏光镜下矿物有明显的边缘和突起,折光率相差越大,突起越明显。利用贝克线移动规律,可以知道矿物与浸油折光率的相对高低。当矿物与浸油折光率相等或相近时,矿物的轮廓几乎看不见。

2. 贝克线

在两个折光率不同的物质接触处,可以看见一条比较明亮的细线,稍微升降镜筒即作平行移动,这条细的亮线称为贝克线。

贝克线的移动规律是:当提升镜筒时,贝克线向折光率大的方向移动;下降镜筒时,贝克线向折光率小的方向移动。

根据贝克线的移动规律可以比较相邻两矿物折光率的大小。

3.浸油的配制

由于不可能选择折光率均匀增加的浸油,所以常常是利用两种折光率不同的液体,按不同的比例人工混合,配制成一套完整的浸油。

选择折光率不同的浸油时应符合以下要求:

a)浸油不应与被研究的物质起反应。

b)配制浸油的液体应能互相混合。

c)保存时折光率不易发生变化。

d)浸油挥发性不强。

配制方法:

已知二种油液的折光率为N1,N2;欲配制浸油的折光率为N3,体积为V3,欲取二种油液的体积为V1,V2;用下列方程式联立,即可求得V1,V2:

N1V1+ N2V2= N3V3……………○1

V1+ V2 = V3 …………○2

配制后的浸油,应利用阿贝折光仪检验其折光率的大小。

测定浸油折光率时应说明测定时的温度。因为浸油的折光率随温度的升高而降低,其平均温度系数大约等于0.0004(温度每升高一度,浸油折光率降低的数值),一般工作时应加以校正。

此外,部分浸油能氧化。在日光下部分浸油会分解,所以应用暗色瓶装浸油,且需加盖封紧。

4.油浸法测定矿物折光率的方法

1)油浸薄片的制备

a)将欲测矿物破碎成均匀的细粒,直径一般为0.03~0.05毫米。注意

不要研磨,以保持矿物碎屑的原始状态,防止颗粒上沾有很多更细的粉末。

b)取少量矿物碎屑(约15~20颗)置于载玻片中央,用利物把碎屑均

匀地散开。

c)用盖玻片把碎屑盖上,取一滴浸油,从旁侧滴到盖玻片上,由于毛细

管作用,浸油即浸满盖玻片与载玻片之间,将矿物包围起来。浸油不要过多,否则矿物会浮动。盖玻片应保持清洁。

2)均质体矿物的测定:

均质体矿物仅有一个折光率,只要将矿物浸在浸油中连续比较,直到浸油与矿物折光率相等,或介于折光率相近的两个浸油之间为止。常见的均质体包括氯化钠和氯化钾、无水钾镁矾等。

3)非均质体矿物的测定:

一轴晶矿物需要测得两个主折光率,二轴晶矿物需要测得三个主折光率。这些主折光率须在定向切面上测量。

5. 矿物颗粒大小及含量的测定

1)颗粒大小的测量

测定薄片中矿物颗粒的大小,通常使用带有刻度尺的接目镜来进行。这种接目镜的十字丝上刻有100个小格(刻度尺),每一小格所代表的长度因放大倍数不同而不同。知道了目镜刻度尺上每一小格所代表的长度以后,将欲测矿物的一边与刻度尺一边重合,量其所占格数后,再乘上刻度尺每格所代表的长度即得欲测矿物的长度或宽度。

2)岩石中矿物含量的测定——比较法

比较法是以目测方式粗略估计岩石薄片中的矿物量比。估计矿物量比最好以标准图案(图108A)作为比较标准。

注意:一个百分含量的颗粒,由于颗粒大小不同,颗粒的数目有很大的差别,往往会造成估计中的重大误差(图108B)。

因此,最好制成不同粒度的(如粗、中、细等)颗粒百分含量的标准图案。

五. 偏光显微镜的保养规则:

1)搬动、放置及使用显微镜时,动作要轻,防止震动。从镜箱里取出显微镜时,必须手握镜臂,切勿提住微动螺丝以上的任何部位。

2)镜头必须保持清洁,若镜头上有灰尘,则需用擦镜头的软纸擦,切不可用手指或粗纸擦,以防损坏镜头。

3)显微镜的任何附件,应严防坠地或跌落。附件用毕放回原处,禁止随便放在桌上或夹在书中带走。

4)不得随便拆卸显微镜。

5)薄片置于载物台上,需以弹簧夹压紧,盖玻片必须朝上,不得使薄片反置于载物台上。

6)下降镜筒时,切勿使物镜与薄片相撞而损坏镜头和薄片。

7)当校正螺丝失效时,不应强力扭动,应找专业人员维修。

8)用完后,应将上偏光镜、勃氏镜推入镜筒内,以免落入灰尘。在镜筒上如有罩子则需罩上,若无,则需置一目镜,以免灰尘掉入镜筒内。

偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质,在偏光显微镜下就能分辨的清楚,当然这些物质也可用染色法来进行观察,但有些则不可能,而必须利用偏光显微镜。

(1)偏光显微镜的特点

将普通光改变为偏振光进行镜检的方法,以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。双折射性是晶体的基本特性。因此,偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域,在生物学和植物学也有应用。

(2)偏光显微镜的基本原理

偏光显微镜的原理比较复杂,在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件:起偏镜,检偏镜,补偿器或相位片,专用无应力物镜,旋转载物台。

(3)偏光镜检术的方式

a.正相镜检(Orthscope):又称无畸变镜检,其特点是使用低倍物镜,不用伯特兰透镜(BertrandLens),被研究对象可直接用偏振光研究。同时为使照明孔径变小,推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。

b.锥光镜检(Conoscope):又称干涉镜检,研究在偏振光干涉时产生的干涉

图样,这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。在该方法中,用强会聚偏振光束照明。

(4)偏光显微镜在装置上的要求

a.光源:最好采用单色光,因为光的速度,折射率,和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。

b.目镜:要带有十字线的目镜。

c.聚光镜:为了取得平行偏光,应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。

d.伯特兰透镜:聚光镜光路中的辅助部件,这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。它可保证用目镜来观察在物镜后焦平面中形成的平涉图样。

(5)偏光镜检术的要求

a.载物台的中心与光轴同轴。

b.起偏镜和检偏镜应处于正交位置。

c.制片不宜过薄。

XP-200 系列偏光显微镜是利用光的偏振特性对具有双折射性物质进行研究鉴定的必备仪器。偏光显微镜在医学上有广泛的用途,如观察齿、骨、头发及活细胞等的结晶内含物,神经纤维、动物肌肉、植物纤维等的结构细节,分析病变过程,偏光显微镜也可以观察无机化学中各种盐类的结晶状况。

仪器图解说明

◇ 先进的光学系统,提供了高质量的数码图像

装有CF偏光光学系统的 XP-200 偏光显微镜,不但可以向您提供高数值孔径、长工作距离,外加能够最大限度满足用户对使用上先进研究技法的升级要求的卓越性能,而且能够获得高质量的偏光图像。

◇人机工程学设计,使操作更方便

偏光显微镜使调焦旋钮、照明控制旋钮和载物台手柄都紧密相邻,使用者在工作时可以把双手都放在桌面上,只需最小的移动就可以操作。低位调焦装置,带有限位和调节松紧装置的粗、微动调焦系统,聚焦位置可以被锁定,从而使得更换样品后的重新聚焦变得更为容易。

◇任意调节的双目瞳距

倾斜45°角的双目观察筒可以让用户在观察时保持一个舒适的姿势。观察筒同时具备瞳距和屈光度的调节功能,可以方便地供多人使用。双瞳调节距离为55mm-75mm

◇防霉处理,提高零件耐用性

由于物镜、目镜和观察筒都进行了有效的防霉处理,所以能确保获得持续清晰的图像,并延长显微镜的使用寿命,即使在湿热的环境中工作也不受影响。

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)采用点光源照射样本,在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点,该点被照射后发出的荧光被物镜搜集,并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔,分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像,这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面,避免了非焦平面上杂散光线的干扰,克服了普通显微镜图像模糊的缺点,因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图 二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统,激光光源,扫描装置和检测系统构成,整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地

进行。显微镜是LSCM的主要组件,它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式,前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 (一)细胞的三维重建 普通荧光显微镜分辨率低,显示的图像结构为多层面的图像叠加,结构不够清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描,得到一组光学切片,经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法,可作单色或双色图像处理,组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态,也可从不同的断面观察细胞内部结构,测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法,可以产生在不同照明角度形成的阴影效果,突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。(二)静态结构检测 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡 检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白

激光扫描共聚焦显微镜

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围 激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化,成为形态学,分子生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代的研究工具。 1激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)的原理 从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进: 1.1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。1.2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 1.3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 1.4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图 在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说LSCM是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 2LSCM在生物医学研究中的应用 目前,一台配置完备的LSCM在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(PH)、微分干涉差显微镜(DIC)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用-17954讲解

激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用 Tina(2007-10-23 09:40:17 一、激光扫描共聚焦显微镜的原理 传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM采用点光源照射样本,在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点,该点被照射后发出的荧光被物镜搜集,并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔,分别称为照明针孔和探测针孔。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像,这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面,避免了非焦平面上杂散光线的干扰,克服了普通显微镜图像模糊的缺点,因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 原理图

二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点 LSCM由显微镜光学系统,激光光源,扫描装置和检测系统构成,整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。显微镜是LSCM的主要组件,它关系到系统的成像质量。通常有倒置和正置两种形式,前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。 三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 一)细胞的三维重建

普通荧光显微镜分辨率低,显示的图像结构为多层面的图像叠加,结构不够清晰。LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描,得到一组光学切片,经A/D转换后作为二维数组贮存。这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法,可作单色或双色图像处理,组合成细胞真实的三维结构。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态,也可从不同的断面观察细胞内部结构,测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。通过模拟荧光处理算法,可以产生在不同照明角度形成的阴影效果,突出立体感。通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。 二)静态结构检测:原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构 1.细胞原位检测核酸 用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。 2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子 原位检测蛋白质、抗体及其他分子 免疫荧光标记技术 检测荧光蛋白 3.检测细胞凋亡

显微镜操作步骤和注意事项

操作步骤和注意事项 (一)正置显微镜 1、安放 右手握住镜臂,左手托住镜座,使镜体保持直立.桌面要清洁、平稳,要选择临窗或光线充足的地方.单筒的一般放在左侧,距离桌边3~4厘米处. 2、清洁 检查显微镜是否有毛病,是否清洁,镜身机械部分可用干净软布擦拭.透镜要用擦镜纸擦拭,如有胶或粘污,可用少量二甲苯清洁之. 3、对光 镜筒升至距载物台1~2厘米处,低倍镜对准通光孔.调节光圈和反光镜,光线强时用平面镜,光线弱时用凹面镜,反光镜要用双手转动. 若使用的为带有光源的显微镜,可省去次步骤,但需要调节光亮度的旋钮. 4、安装标本 将玻片放在载物台上,注意有盖玻片的一面一定朝上.用弹簧夹将玻片固定,转动平台移动器的旋钮,使要观察的材料对准通光孔中央. 5、调焦 调焦时,先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒,并从侧面仔细观察,直到物镜贴近玻片标本,然后左眼自目镜观察,左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒,直到看清标本物像时停止,再用细调焦旋钮回调清晰. 操作注意:不应在高倍镜下直接调焦;镜筒下降时,应从侧面观察镜筒和标本间的间距;要了解物距的临界值. 若使用双筒显微镜,如观察者双眼视度有差异,可靠视度调节圈调节.另外双筒可相对平移以适应操作者两眼间距. 6、观察 若使用单筒显微镜,两眼自然张开,左眼观察标本,右眼观察记录及绘图,同时左手调节焦距,使物象清晰并移动标本视野.右手记录、绘图. 镜检时应将标本按一定方向移动视野,直至整个标本观察完毕,以便不漏检,不重复. 光强的调节:一般情况下,染色标本光线宜强,无色或未染色标本光线宜弱;低倍镜观察光线宜弱,高倍镜观察光线宜强.除调节反光镜或光源灯以外,虹彩光圈的调节也十分重要. (1)低倍镜观察 观察任何标本时,都必须先使用低倍镜,因为其视野大,易发现目标和确定要观察的部位. (2)高倍镜观察 从低倍镜转至高倍时,只需略微调动细调焦旋钮,即可使物像清晰. 使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮,否则易压碎盖玻片并损伤镜头. 转动物镜转换器时,不可用手指直接推转物镜,这样容易使物镜的光轴发生偏斜,转换器螺纹受力不均匀而破坏,最后导致转换器就会报废.

激光共聚焦显微镜技术1讲解

激光共聚焦显微镜技术 The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 1957年,Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理,获得了美国的专利。1978年,阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。 1985年,Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜 激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史 ?80年代末,各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列,德国Leica公司的TCS系列,Zeiss公司的LSM系列等。 ?近二十年来,从滤片型到光谱型,人们对共焦高分辨率,采集图像快速,技术的改进及应用开发不断进行,出现了很多新的技术。如双光子,FCS,FLIM ,STED等。 共焦显微镜的优点 人眼分辨率:0.2mm 光学显微镜分辨率:0.25μm 电子显微镜分辨率:0.2nm 共焦显微镜分辨率:μm 共焦显微镜的优点 ?电子显微镜的缺陷: 1.只能观察固定样品 2.样品制备过程(固定、包埋、切片)造成的假象 ?荧光显微镜的缺陷: 1.可以观察活细胞或组织,但细胞或组织内结构高度重叠。 2.荧光具有强散射性,造成图像实际清晰度的大大下降。 3.荧光漂白很快,使荧光图像的拍照有困难。 4.如果荧光滤片选配不当,多荧光标记样品图像的采集很困难,且很难抑制光谱交叉。 共焦显微镜的优点 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊,获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 ?共焦显微镜与传统显微镜的区别

显微镜的使用方法显微镜使用

显微镜的使用方法显微镜使用 引导语:初中的生物课我们就开始接触显微镜,怎么使用呢? 以下是收集的关于显微镜的使用方法相关内容,欢迎阅读参考! 一、显微镜的使用方法 1.观察前的准备 (1)置显微镜于平稳的实验台上,镜座距实验台边沿约为一寸左右。镜检者姿势要端正,一般用左眼观察,右眼便于绘图或记录,两眼必须同时睁开,以减少疲劳,亦可练习左右眼均能观察。显微镜构造见右图。 (2)显微镜是光学精密仪器,在使用时要特别小心,使用前要熟悉显微镜的结构和性能,检查各总零件是否完好无损。镜身有无灰尘,镜头是否清洁,做好必要的清洁和调整工作。 (3)调节光源对光时应避免直射光源,因直射光源影响物像的清晰,损坏光源装置和镜头,并刺激眼睛。晴天可直接用窗外的散射光,如明暗天气,可用8-30W日光灯或显微镜灯照明 调节光源及光照的一般步骤: 将低倍物镜旋至镜筒下方,旋转粗调节轮,使镜头和载物台距离约为0.5cm左右。 上升聚光器,使与载物台表面同样高。否则使用油镜时光线较暗。 左眼看目镜,调节反光镜镜面角度(反光镜有凹平两面,光线较强自然光源,宜用平面镜;光线较弱的天然光源或人工光源,宜用凹

面镜。)对光使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时,光线应强;检查未染色标本时,光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线. 2.低倍镜观察。 检查的标本须先用低信镜观察,因为低倍镜视野较大,易发现目标和确定检查的位置。 (1)先将标本玻片置于载物台上,并将标本部位处于物镜的正下方,转动粗调节轮,下降物镜或上升载物台使物镜至标本0.5cm处。 (2)左眼看目镜,同时反时针方向慢慢旋转粗调节轮,当在视野内出现物象后,改用细调节轮,上下微微转动,直至视野内获得清晰的物象。然后认真观察标本各部位,确定并将需进一步要观察的部位移视野中央,准备用高倍镜观察。 3.高倍镜观察; 将高倍镜转正至正下方,在转换接物镜时,需用眼睛在侧面观察,避免镜头与玻片相撞。然后由接目镜观察,再仔细调节光圈和聚光镜,使光线的明亮度适宜,同时再仔细正反两方向微转动细调节轮,直至获得清晰的物象后为止,找到最适宜于观察的部位。需进一步要观察的部位移视野中央,准备用油镜观察。 4.油镜观察: (1)上升聚光器,全开虹彩光圈 (2)用粗调节轮提起镜筒或下降载物台,转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方

激光共聚焦显微镜原理

激光共聚焦显微镜原理 激光共聚焦扫描显微技术(Confocal laser scanning microscopy)是一种高分辨率的显微成像技术。普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本(例如细胞)进行观察时,来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。共聚焦显微技术的关键点在于,每次只对空间上的一个点(焦点)进行成像,再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。在此过程中,来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰,从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。 图1. 共聚焦显微镜简化原理图 图1是一般共聚焦显微镜的工作原理示意图。用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射,通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起,被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长,直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)(通常是光电倍增管(PMT)或是雪崩光电二极管(APD)),变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用,残余的激光则被二向色镜反射,不会被探测到。

图2. 探测针孔的作用示意图 图2解释了出射小孔所起到的作用:只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔;焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的,绝大部分无法通过中心的小孔。因此,焦平面上的观察目标点呈现亮色,而非观察点则作为背景呈现黑色,反差增加,图像清晰。在成像过程中,出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系(共轭conjugate),因而被称为共聚焦(con-focal)显微技术。共聚焦显微技术是由美国科学家马文?闵斯基(Marvin Minsky)发明的;他于1957年就为该技术申请了专利。但是直到八十年代后期,由于激光研究的长足进步,才使得激光共聚焦扫描显微技术(CLSM)成为了一种成熟的技术。 图3. 激光共聚焦显微镜原理框图 当今的激光共聚焦显微镜已经发展为一种结合了激光技术,显微光学,自动控制和图像处理等多种尖端科研成果的高技术工具。是现代微观研究领域不可缺少的利器之一。Nikon秉承“信赖与创造”的一贯企业理念,正在为业界提供世界领先水平的共聚焦显微镜系统产品。

激光共聚焦显微镜与普通显微镜成像原理及区别

激光扫描共聚焦显微镜采用激光作为光源, 有效地除去了非聚焦平面的信息, 提高了微观形貌的清晰度和分辨率。其与计算机软件结合可以实现深度方向的光学切片观察, 再将这些扫描得到的信息通过软件算法以及叠加和重组, 可以获得材料的微观三维形貌, 因此激光共聚焦显微镜具有快速、无损、制样简单等优点。那么激光共聚焦显微镜的原理又是怎样的呢? 它采用激光点光源照射样品, 从发射器发出的光经过光路后在聚焦平面上形成一个大小分明的光点,它沿着原照射光路到达分光镜并且该点发出的光被物镜收集,分光镜将收集来的光直接反馈给探测器。光点通过前方探测器设有的探测针孔等一系列的透镜, 最终同时聚焦于探测针孔, 这样来自聚焦平面的光可以会聚在探测孔之内, 而来自聚焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像, 从而提高了焦平面的分辨率。激光共聚焦显微镜逐点扫描样品, 探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像, 转为数字信号传输到计算机上, 最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。转为数字信号传输到计算机上, 最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。此外激光共聚焦显微镜还可以对样品进行逐层光学切片扫描, 得到高度方向每一层的图像信息, 传回计算机软件叠加处理后可以得到三维形貌图。它成像清晰、精确、最大的优点在于能对材料进行深层形貌的观察。可以对样品进行断层扫描观察和成像, 进行无损观察和三维形貌分析。 激光共聚焦显微镜可用来观察样品表面亚微米级别的三维轮廓形貌, 也可以测量多种微几何尺寸, 像晶粒度、体积、膜深、膜厚、深度、长宽、线粗糙度、面粗糙度等。激光共

聚焦相比于其他测量手段有其独特的优势, 它提高了图片的清晰度, 有很好的景深, 提高了分辨率, 可以进行无接触的三维轮廓测试。在金属材料研发方面还经常用到光学显微镜和扫描电子显微镜。光学显微镜是一种二维的形态学工具, 有效分辨率较低, 分辨率的景深较小, 也不能观察纵向方向的三维形态。而扫描电镜在样品的制备方面比较复杂, 有时还会引起样品的破坏, 对于扫描的面积和材料的表面高度都有所限制, 同时它也不能测量面积、体积、深度等信息。在钢铁材料的生产和开发过程中, 众多的环节需要关注表面形貌, 采用激光共聚焦显微镜技术进行相应检测, 不仅可以获得媲美SEM的显微图像, 同时还能够进行快速、无损测量, 加之其较低的引入和维护成本,更符合目前行业成本控制的需求。本文将举例说明激光共聚焦显微镜在金属研究领域的典型应用。 激光共聚焦显微镜由于其优于光学显微镜的清晰度和分辨率, 使其在金相组织观察方面有独特的优势。试验样品为海洋平台用钢, 将样品进行磨制、抛光处理, 并用腐蚀溶液腐蚀, 要求观察并测量基体上粒状贝氏体的形态和尺寸。相比于普通光学显微镜, 激光共聚焦显微镜清晰度好, 分辨率高。激光作为光源, 它的单色性非常好, 光束的波长相同, 从根本上消除了色差。共聚焦显微镜中在物镜的焦平面上放置了一个带有针孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 从而消除了球差。同时激光共聚焦显微镜采取的点扫描技术和计算机采集和处理信号也进一步提高了图像的清晰度。

显微镜的使用方法

显微镜的使用方法: 1、实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置,镜座应距桌沿 6~7 cm左右。 2、打开光源开关,调节光强到合适大小。 3、转动物镜转换器,使低倍镜头正对载物台上的通光孔。先把镜头调节至距载物台1~2cm左右处,然后用左眼注视目镜内,接着调节聚光器的高度,把孔径光阑调至最大,使光线通过聚光器入射到镜筒内,这时视野内呈明亮的状态。 4、将所要观察的玻片放在载物台上,使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央,然后用标本夹夹好载玻片。 5、先用低倍镜观察(物镜10X、目镜10X)。观察之前,先转动粗动调焦手轮,使载物台上升,物镜逐渐接近玻片。需要注意,不能使物镜触及玻片,以防镜头将玻片压碎。然后,左眼注视目镜内,同时右眼不要闭合(要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯,以便在观察的同时能用右眼看着绘图),并转动粗动调焦手轮,使载物台慢慢下降,不久即可看到玻片中材料的放大物像。 6、如果在视野内看到的物像不符合实验要求(物像偏离视野),可慢慢调节载物台移动手柄。调节时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰,可以调节微动调焦手轮,直至物像清晰为止。 7、如果进一步使用高倍物镜观察,应在转换高倍物镜之前,把物像中需要放大观察的部分移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,视野中的物像范围缩小了很多)。一般具有正常功能的显微镜,低倍物镜和高倍物镜基本齐焦,在用低倍物镜观察清晰时,换高倍物镜应可以见到物像,但物像不一定很清晰,可以转动微动调焦手轮进行调节。 8、在转换高倍物镜并且看清物像之后,可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低,使光线符合要求(一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时,视野要稍变暗一些,所以需要调节光线强弱)。 9、观察完毕应先将物镜镜头从通光孔处移开,然后将孔径光阑调至最大,再将载物台缓缓落下,并检查零件有无损伤,特别要注意检查物镜是否沾水沾油,如沾了水或油要用镜头纸擦净,检查处理完毕后即可铺上防尘布。 购买显微镜之前,首先先了解自己所要做的实验目的,针对选择合适的显微镜,因显微镜种类多。 普通光学显微镜的使用方法 使用方法:(一)显微镜的主要构造 普通光学显微镜的构造主要分为三部分:机械部分、照明部分和光学部分。 1.机械部分 (1)镜座:是显微镜的底座,用以支持整个镜体。 (2)镜柱:是镜座上面直立的部分,用以连接镜座和镜臂。 (3)镜臂:一端连于镜柱,一端连于镜筒,是取放显微镜时手握部位。 (4)镜筒:连在镜臂的前上方,镜筒上端装有目镜,下端装有物镜转换器。 (5)物镜转换器(旋转器):接于棱镜壳的下方,可自由转动,盘上有3-4个圆孔,是安装物镜部位,转动转换器,可以调换不同倍数的物镜,当听到碰叩声时,方可进行观察,此时物镜光轴恰好对准通光孔中心,光路接通。 (6)镜台(载物台):在镜筒下方,形状有方、圆两种,用以放置玻片标本,中央有一通光孔,我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器),推进器左侧有弹簧夹,用以夹持玻片标本,

显微镜的使用方法显微镜使用

显微镜的使用方法显微镜使用引导语:初中的生物课我们就开始接触显微镜,怎么使用呢? 以下是收集的关于显微镜的使用方法相关内容,欢迎阅读参考! 一、显微镜的使用方法 1.观察前的准备 (1)置显微镜于平稳的实验台上,镜座距实验台边沿约为一寸左右。镜检者姿势要端正,一般用左眼观察,右眼便于绘图或记录,两眼必须同时睁开,以减少疲劳,亦可练习左右眼均能观察。显微镜构造见右图。 (2)显微镜是光学精密仪器,在使用时要特别小心,使用前要熟悉显微镜的结构和性能,检查各总零件是否完好无损。镜身有无灰尘,镜头是否清洁,做好必要的清洁和调整工作。 (3)调节光源对光时应避免直射光源,因直射光源影响物像的清晰,损坏光源装置和镜头,并刺激眼睛。晴天可直接用窗外的散射光,如明暗天气,可用8-30W日光灯或显微镜灯照明调节光源及光照的一般步骤:将低倍物镜旋至镜筒下方,旋转粗调节轮,使镜头和载物台距离约为0.5cm 左右。 上升聚光器,使与载物台表面同样高。否则使用油镜时光线较暗。 左眼看目镜,调节反光镜镜面角度( 反光镜有凹平两面,光线较强自然光源,宜用平面镜; 光线较弱的天然光源或人工光源,宜用凹面镜。) 对光使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时,光线应强; 检查未染色标本时,光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线. 2.低倍镜观察。检查的标本须先用低信镜观察,因为低倍镜视野较大,

易发现目标和确定检查的位置。 (1)先将标本玻片置于载物台上,并将标本部位处于物镜的正下方,转动粗调节轮,下降物镜或上升载物台使物镜至标本0.5cm 处。 (2)左眼看目镜,同时反时针方向慢慢旋转粗调节轮,当在视野内出现物象后,改用细调节轮,上下微微转动,直至视野内获得清晰的物象。然后认真观察标本各部位,确定并将需进一步要观察的部位移视野中央,准备用高倍镜观察。 3. 高倍镜观察; 将高倍镜转正至正下方,在转换接物镜时,需用眼睛在侧面观察,避免镜头与玻片相撞。然后由接目镜观察,再仔细调节光圈和聚光镜,使光线的明亮度适宜,同时再仔细正反两方向微转动细调节轮,直至获得清晰的物象后为止,找到最适宜于观察的部位。需进一步要观察的部位移视野中央,准备用油镜观察。 4. 油镜观察: (1)上升聚光器,全开虹彩光圈 (2)用粗调节轮提起镜筒或下降载物台,转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调节轮使镜筒下降或载物台上升,与此同时,从显微镜的侧面观察使油镜浸入油中,直到几乎与标本接触时为止。注意不要压到标本,以免压碎玻片,甚至损坏油镜头。 (3)从接目镜内观察,进一步调节光线,使光线明亮,再用粗调节轮将镜筒徐徐上升或将载物台徐徐下降,直到视野内出现物像为止,然后用细调节轮校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物象,必须再从侧面观察,将

显微镜使用的一般步骤

一.显微镜使用的一般步骤: 1、取镜与安放:右手握镜臂,左手托镜座放在前方稍偏左。 2、对光:(1)转动转换器,使低倍物镜对准通光孔。(2)选较大的光圈对准通光孔,左眼注视目镜,转动反光镜,使光线通过通光孔反射到镜筒内,通过目镜,可以看到白亮的视野。 3低倍镜观察:(1)标本放在载物台上,用压片夹压住,标本要正对通光孔的中心。 (2)转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,直到物镜接近玻片标本为止(此时实验者的眼睛应当看物镜头与标本之间,以免物镜与标本相撞)。(3)左眼看目镜内,同时反向转动粗准焦螺旋,使镜筒上升,直到看到物像为止,再稍稍转动细准焦螺旋,使看到的物像更加清晰。 4.高倍镜观察:(1)移动装片,在低倍镜下使需要放大观察的部分移动至视野中央。(2)转动转换器,移走低倍物镜,换上高倍物镜。(3)调节细准焦螺旋,使物像清晰。(4)调节光圈和反光镜,使视野亮度适宜。 5、使用完毕后,取下装片,转动转换器,逆时针旋出物镜,旋进镜头盒;取出目镜,插进镜头盒,盖上。把显微镜放正。 二、显微镜使用的一些注意问题: a、等于目镜的放大倍数和物镜的放大倍数的乘积,该放大倍数指的是长度或宽度,而不是面积和体积。

b、物镜镜头长度与放大倍数成正比;目镜镜头长度与放大倍数成反比。高倍镜镜面较小,低倍镜镜面较大 c、视野:视野是指一次所能观察到的被检标本的范围。视野的大小与放大倍数成反比,放大倍数越小,视野范围越大,看到的细胞数目越多,工作距离越长;放大倍数越大,视野范围越小,看到的细胞数目越少,工作距离越短。 d、镜像亮度:镜像亮度是指视野里所看到的像的亮暗程度。它与放大倍数成反比,即在光源一定的情况下,放大倍数越大,视野越暗。在用高倍镜或物镜观察标本时,根椐实际情况可使凹面反光镜、大光圈来增强光源,以改善视野亮度而使物像明亮清晰。 e、视野中物像移动与标本移动的关系:视野中某观察对象位于左前方如要移到中央,应将装片或切片向左前方移动。也就是同向移动。原因是视野中物像移动的方向与装片或切片移动的方向相反。 f、显微镜使用时的异常现象与原因 (1)有气泡:制作装片不规范;材料厚薄不均匀;水太少(2)同一视野一部分清晰另一部分不清晰:材料厚薄不均匀 (3)视野太亮:光线太强;调节光圈和反光镜(4)视野一半亮,一半不亮,反光镜没有转到位 h、显微镜使用时异物的判断:目镜、物镜或装片上,通常通过移动玻片(是否在玻片上),转动转换器(是否在物镜上)来判断,剩下在目镜上。

显微镜操作规程

金相显微镜操作规程 金相显微镜属于精密光学仪器,为了保证金相显微镜系统正常的发挥功能,特制定本规程。金相显微镜由专人使用,专人负责日常维护、保养。任何人未经许可,不得调试该设备。 金相显微镜系统的操作步骤及日常维护、保养注意事项如下: 一.试验前准备: 1. 检查电源,是否与设备额定的电压和频率一致,并接好接地电线。打开右侧的电源开关。 2. 在装上或卸下物镜时,必须把载物台升起,防止碰触透镜。 3. 试样放上载物台时,使被观察表面置于载物台当中,小试样用压片簧压紧。 4. 当使用低倍物镜观察时,旋转粗动调焦手轮,当使用高倍物镜观察时,旋转微动调焦手轮,使在目镜观察到试样的物象达到清晰为止。 5. 使用100×(油浸)物镜时,需在试样物镜上滴香柏油。 6. 调节双目头的间距至双眼能观察到左右两视场合成一个视场。 7. 擦试镜头可用沾酒精/乙醚混合液或二甲苯的镜头纸或脱脂棉花。每 次使用100×物镜后均需把镜头上的油擦干净。 8. 擦试涂漆表面,可用纱布除去灰尘,若有油渍污垢,用纱布沾少许 汽油去除,不能用有机溶剂(例如:酒精、乙醚和其它稀释剂)擦试涂漆表面和塑料部位。 9. 显微镜是精密光学仪器,各零部件切勿随便拆卸,以免损害其操作效 果和精度.

10. 仪器不使用时,应用罩罩好 二、显微镜部分 1、去掉防尘罩,打开电源。 2、将试样置于载物台垫片,调整粗/微调旋钮进行调焦,直到观察到的图像清晰为止。 3、调整载物台位置,找到关心的视场,进行金相分析。 三、计算机及图像分析系统 将金相显微镜上的观察/照相切换旋钮调至PHOT位置,金相显微镜里观察到的信息便转换到视频接口和摄像头,打开计算机,启动图象分析软件,即可观察到来自金相显微镜的实时的图像,找到关心的视场后将其采集、处理。 四、日常维护、保养及注意事项 为保证系统的使用寿命及可靠性,注意以下事项: 1.试验室应具备三防条件:防震(远离震源)、防潮(使用空调、干燥器)、防尘(地面铺上地板);电源:220V±10%,50HZ;温度:0°C—40°C。 2.调焦时注意不要使物镜碰到试样,以免划伤物镜。 3.当载物台垫片圆孔中心的位置远离物镜中心位置时不要切换物镜,以免划伤物镜。 4.亮度调整切忌忽大忽小,也不要过亮,影响灯泡的使用寿命,同时也有损视力。 5.所有(功能)切换,动作要轻,要到位。 6.关机时要将亮度调到最小。 7.非专业人员不要调整照明系统(灯丝位置灯),以免影响成像质量。 8.更换卤素灯时要注意高温,以免灼伤;注意不要用手直接接触卤素灯的玻璃体。 9.关机不使用时,将物镜通过调焦机构调整到最低状态。 10.关机不使用时,不要立即该盖防尘罩,待冷却后再盖,注意防火。 11.不经常使用的光学部件放置于干燥皿内。

共聚焦显微镜

共聚焦显微镜 从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上,如果物体恰在焦点上,那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源,这就是所谓的共聚焦,简称共焦。共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror),将已经通过透镜的反射光折向其它方向,在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板,小孔就位于焦点处,挡板后面是一个光电倍增管 (photomultipliertube,pmt)。可以想像,探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统,必不能聚焦到小孔上,会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是:通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有

划时代的高科技产品,它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,把光学成像的分辨率提高了 30%--40%,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值,膜电位等生理信号及细胞形态的变化,成为形态学,分子生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等,观察研究组织切片,细胞活体的生长发育特征,研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究(ratio),神经递质研究,微分干涉及荧光的断层扫描,多重荧光的断层扫描及重叠,荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件,荧光共振能量的转移的分析,荧光原位杂交研究(fish),细胞骨架研究,基因定位研究,原位实时pcr产物分析,荧光漂白恢复研究(frap),胞间通讯研究,蛋白质间研究,膜电位与膜流动性等研究,完成图像分

显微镜的使用方法与步骤

WORD格式 附:显微镜的使用方法与步骤 一、取镜和安放 1.右手握住镜臂,左手托住镜座。 2.把显微镜放在实验台上,略偏左(显微镜放在距实验台边缘 7 厘米左右处)。安装 好目镜和物镜。 二、对光 3.转动转换器,使低倍物镜对准通光孔( 物镜的前端与载物台要保持 2 厘米的距离 ) 。 4.把一个较大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜内( 右眼睁开,便于以后同时画图) 。转动反光镜,使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜,可以看到白亮的视野。 三、观察 5.把所要观察的玻片标本(也可以用印有“ 6”字的薄纸片制成)放在载物台上, 用压片夹压住,标本要正对通光孔的中心。 6.转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,直到物镜接近玻片标本为止(眼睛看着物镜,以 免物镜碰到玻片标本)。 7.左眼向目镜内看,同时反方向转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓上升,直到看清 物像为止。再略微转动细准焦螺旋,使看到的物像更加清晰。 8.高倍物镜的使用:使用高倍物镜之前,必须先用低倍物镜找到观察的物象, 并调到视野的正中央,然后转动转换器再换高倍镜。换用高倍镜后,视野内亮度变暗, 因此一般 选用较大的光圈并使用反光镜的凹面,然后调节细准焦螺旋。观看的物体数目变少, 但是体积变大。 四、整理 8.实验完毕,把显微镜的外表擦拭干净。转动转换器,把两个物镜偏到两旁, 并将镜筒缓缓下降到最低处,反光镜竖直放置。最后把显微镜放进镜箱里,送回原处。 《注意事项》: 1、严忌单手提取显微镜。 2、若须移动显微镜,务必将显微镜提起再放至适当位置,严忌推动显微镜(推动时造 成的震动可能会导致显微镜内部零件的松动,切记!! ),使用显微镜请务必小心轻放。 3、使用显微镜时坐椅的高度应适当,观察时更应习惯两眼同时观察,且光圈及 光源亮度皆应适当,否则长时间观察时极易感觉疲劳。 4、转动旋转盘时务必将载物台降至最低点,以免因操作不当而刮伤接目镜之镜头。 5、标本染色或其它任何操作皆应将玻片取下,操作完成后再放回载物台观察, 切勿在载物台上操作,以免染剂或其它液体流入显微镜内部或伤及镜头。 6、观察完一种材料,欲更换另一种材料时,务必将载物台下降至最低点,换好 玻片后再依标准程序重新对焦,切勿直接抽换标本,以免刮伤镜头或玻片标本。 7、用毕显微镜应将载物台下降至最低点,并将低倍镜对准载物台中央圆孔处, 将电源线卷好,盖上防尘罩,并收入存放柜中。 专业资料整理

共聚焦显微镜原理及其应用

共聚焦显微镜原理及其应用 传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光点倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图像模糊的缺点。它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,把光学成像的分辨率提高了30%--40%,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值,膜电位等生理信号及细胞形态的变化,成为形态学,分子生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等,观察研究组织切片,细胞活体的生长发育特征,研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究(RATIO),神经递质研究,微分干涉及荧光的断层扫描,多重荧光的断层扫描及重叠,荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件,荧光共振能量的转移的分析,荧光原位杂交研究(FISH),细胞骨架研究,基因定位研究,原位实时PCR产物分析,荧光漂白恢复研究(FRAP),胞间通讯研究,蛋白质间研究,膜电位与膜流动性等研究,完成图像分析和三维重建等分析。 共聚焦显微镜的应用。细胞形态学分析(观察细胞或组织内部微细结构,如:细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征;半定量免疫荧光分析);荧光原位杂交研究;基因定位研究及三维重建分析。 1.细胞生物学:细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化 2.生物化学:酶、核酸、FISH(荧光原位杂交)、受体分析 3.药理学:药物对细胞的作用及其动力学 4.生理学:膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态 5.神经生物学:神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布 6.微生物学和寄生虫学:细菌、寄生虫形态结构 7.病理学及临床应用:活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等 8.遗传学和组胚学:细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断 激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用: A.在细胞及分子生物学中的应用 1. 细胞、组织的三维观察和定量测量 2. 活细胞生理信号的动态监测 3. 粘附细胞的分选 4. 细胞激光显微外科和光陷阱功能 5. 光漂白后的荧光恢复 6. 在细胞凋亡研究中的应用 B.在神经科学中的应用 1. 定量荧光测定 2. 细胞内离子的测定

显微镜的构造与操作

显微镜的构造与操作 Company number:【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

显微镜的构造与操作 一、显微镜的主要构造 普通光学显微镜的构造主要分为三部分:机械部分、照明部分和光学部分。 图 1 (一)、机械部分 1、镜座:是显微镜的底座,用以支持整个镜体。 2、镜柱:是镜座上面直立的部分,用以连接镜座和镜臂。 3、镜臂:一端连于镜柱,一端连于镜筒,是取放显微镜时手握部位。 4、镜筒:连在镜臂的前上方,镜筒上端装有目镜,下端装有物镜转换器。“160”表示观察时,机械筒长为160mm。 5、物镜转换器(旋转器):接于棱镜壳的下方,可自由转动,盘上有3-4个圆孔,是安装物镜部位,转动转换器,可以调换不同倍数的物镜,当听到碰叩声时,方可进行观察,此时物镜光轴恰好对准通光孔中心,光路接通。 6、镜台(载物台):在镜筒下方,形状有方、圆两种,用以放置玻片标本,中央有一通光孔,我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器(推片器),推进器左侧有弹簧夹,用以夹持玻片标本,镜台下有推进器调节轮,可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 7、调节器:是装在镜柱上的大小两种螺旋,调节时使镜台作上下方向的移动。

(1)粗调节器(粗螺旋):大螺旋称粗调节器,移动时可使镜台作快速和较大辐度的升降,所以能迅速调节物镜和标本之间的距离使物象呈现于视野中,通常在使用低倍镜时,先用粗调节器迅速找到物象。 (2)细调节器(细螺旋):小螺旋称细调节器,移动时可使镜台缓慢地升降,多在运用高倍镜时使用,从而得到更清晰的物象,并借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。 (二)、照明部分 装在镜台下方,包括反光镜,集光器。 1、反光镜:装在镜座上面,可向任意方向转动,它有平、凹两面,其作用是将光源光线反射到聚光器上,再经通光孔照明标本,凹面镜聚光作用强,适于光线较弱的时候使用,平面镜聚光作用弱,适于光线较强时使用。 2、集光器(聚光器)位于镜台下方的集光器架上,由聚光镜和光圈组成,其作用是把光线集中到所要观察的标本上。 (1)聚光镜:由一片或数片透镜组成,起汇聚光线的作用,加强对标本的照明,并使光线射入物镜内,镜柱旁有一调节螺旋,转动它可升降聚光器,以调节视野中光亮度的强弱。 (2)光圈(虹彩光圈):在聚光镜下方,由十几张金属薄片组成,其外侧伸出一柄,推动它可调节其开孔的大小,以调节光量。 (三)、光学部分 1、目镜:装在镜筒的上端,通常备有2-3个,上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数,一般装的是10×的目镜。

显微镜的结构以及使用方法与步骤

显微镜的结构以及使用方法与步骤 一、取镜和安放1.右手握住镜臂,左手托住镜座。 轻拿轻放。2.把显微镜放在实验台上,略偏左(显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处)。安装好目镜和物镜。 二、对光3.转动转换器,使低倍物镜对准通光孔(物镜的前端与载物台要保持2厘米的距离)。 4.根据光线强弱,调节反光镜和遮光器(光圈)。把一个较大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜内(右眼睁开,便于以后同时画图)。转动反光镜,使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜,可以看到白亮的视野。 三、放置标本5.把所要观察的玻片标本(也可以用印有“6”字的薄纸片制成)放在载物台上,用压片夹压住,标本要正对通光孔的中心。 四、调焦观察6.转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,直到物镜接近玻片标本为止(眼睛看着物镜,以免物镜碰到玻片标本)。 7.左眼向目镜内看,同时反方向转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓上升,直到看清物像为止。再略微转动细准焦螺旋,使看到的物像更加清晰。8.高倍物镜的使用:使用高倍物镜之前,必须先用低倍物镜找到观察的物象,并调到视野的正中央,然后转动转换器再换高倍镜。换用高倍镜后,视野内亮度变暗,因此一般选

用较大的光圈并使用反光镜的凹面,然后调节细准焦螺旋。观看的物体数目变少,但是体积变大。 五、整理8.实验完毕,把显微镜的外表擦拭干净。转动转换器,把两个物镜偏到两旁,并将镜筒缓缓下降到最低处,反光镜竖直放置,最后把显微镜放进镜箱里,送回原处。《注意事项》: 1、严忌单手提取显微镜。 2、若须移动显微镜,务必将显微镜提起再放至适当位置,严忌推动显微镜(推动时造成的震动可能会导致显微镜内部零件的松动,切记!!),使用显微镜请务必小心轻放。 3、使用显微镜时坐椅的高度应适当,观察时更应习惯两眼同时观察,且光圈及光源亮度皆应适当,否则长时间观察时极易感觉疲劳。 4、转动旋转盘时务必将载物台降至最低点,以免因操作不当而刮伤接目镜之镜头。 5、标本染色或其它任何操作皆应将玻片取下,操作完成后再放回载物台观察,切勿在载物台上操作,以免染剂或其它液体流入显微镜内部或伤及镜头。 6、观察完一种材料,欲更换另一种材料时,务必将载物台下降至最低点,换好玻片后再依标准程序重新对焦,切勿直接抽换标本,以免刮伤镜头或玻片标本。

激光扫描共聚焦显微镜实验技术与应用_韩卓

科技信息2009年第19期 SCIENCE&TECHNOLOGY INFORMATION 随着科学技术的发展,实验技术已经成为实现实验目的的重要手段,对实验技术的了解和掌握是科技工作者应具备的技能。激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope)是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术[1],它是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段渗透,并与传统的光学显微镜结合产生的先进的细胞分子生物学分析仪器,在生物及医学等领域的应用越来越广泛,已经成为生物医学实验研究的必备工具[2]。 在传统光学显微镜基础上,激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源,采用共扼聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。其特点是可以对样品进行断层扫描和成像,进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构[3]。同时,利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针,该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+,pH值,膜电位等生理信号及细胞形态的变化,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具[4],极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识。 1.激光扫描共聚焦显微镜的原理 在普通宽视野光学显微镜中,整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明,图像可以用肉眼直接观察[5]。同时,来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大,尤其是标本的厚度在2um以上时,其影响更为明显。 图1激光扫描共聚焦显微镜光路图 激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中如果有可被激发的荧光物质,受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机,处理后在计算机显示器上显示图像[6]。在这个光路中,只有在焦平面的光才能穿过探测针孔,焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的,不能通过小孔。因此,非观察点的背景呈黑色,反差增加,成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,即共聚焦[7]。以激光作光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,故称为激光扫描共聚焦显微镜。 2.激光扫描共聚焦显微镜的主要功能 2.1组织和细胞中的定量荧光测定 激光扫描共聚焦显微镜可以从固定和荧光染色的标本以单波长、双波长或多波长模式,对单标记或多标记的细胞及组织标本的共聚焦荧光进行数据采集和定量分析,同时还可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加,形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像,以显示荧光在形态结构上的精确定位。常用于原位分子杂交、肿瘤细胞凋亡观察、单个活细胞水平的DNA损伤及修复等定量分析。 2.2细胞间通讯的研究 动物和植物细胞中缝隙连接介导的胞间通信在细胞增殖和分化中起着重要作用。激光扫描共聚焦显微镜可通过观察细胞缝隙连接分子的转移来测量传递细胞调控信息的一些离子、小分子物质。该技术可以用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用,也可用于鉴别对缝隙连接作用有潜在毒性的化学物质。 2.3细胞物理化学测定 激光扫描共聚焦显微镜可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数进行自动测定。能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。 2.4细胞内钙离子和pH值动态分析 激光扫描共聚焦显微镜技术是测量若干种离子浓度并显示其分布的有效工具,对焦点信息的有效辨别使在亚细胞水平显示离子分布成为可能。利用荧光探针,激光扫描共聚焦显微镜可以测量单个细胞内pH和多种离子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+)在活细胞内的浓度及变化。一般来说,电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快,但其图像本身的价值较低,而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像,这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。 2.5三维图像的重建 传统的显微镜只能形成二维图像,激光扫描共聚焦显微镜通过对 激光扫描共聚焦显微镜实验技术与应用 韩卓陈晓燕马道荣余顺火 (合肥工业大学生物与食品工程实验室安徽合肥230009) 【摘要】该文从激光扫描共聚焦显微镜的工作原理、主要功能、样品制备方法和仪器使用管理等方面阐述了激光扫描共聚焦显微镜技术及其应用,帮助实验工作者了解和掌握该技术,使他们能够熟练使用该仪器进行科学实践与研究。 【关键词】激光扫描共聚焦显微镜;光学切片;荧光染色 The Experimental Technology and Application of Laser Scanning Confocal Microscope HAN Zhuo CHEN Xiao-yan MA Dao-rong YU Shun-huo (Laboratory of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Heifei230009)【Abstract】The paper introduces the experimental technology and application of laser scanning confocal microscope(LSCM),including the principle,function,sample pretreatment and instrumental management,through which analysts can understand the theory and perform the technique in research. 【Key words】Laser scanning confocal microscope;Optical section; Fluorochromine ○科教前沿○ 27

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