超低温冷冻保存种质

超低温保存技术的相关机理综述

二甲基亚砜二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。同时，氯化铬，氯化锰等过渡金属卤化物与氯化钾，氯化钠等卤化物在DMSO中有一定溶解度，故可以应用在有机电化学中。二甲基亚砜广泛用作溶剂和反应试剂，特别是丙烯腈聚合反应中作加工溶剂和抽丝溶剂，作聚氨酯合成及抽丝溶剂，作聚酰胺，聚酰亚胺和聚砜树脂的合成溶剂，以及芳烃，丁二烯抽提溶剂和合成氯氟苯胺的溶剂等。除此之外，在医药工业中二甲基亚砜还有直接用作某些药物的原料及载体。二甲基亚砜本身有消炎止痛，利尿，镇静等作用，亦誉为“万灵药”，常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中。 DMSO是二甲基亚砜，用途广泛。用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透。也可作为农药的添加剂。也是一种十分重要的化学试剂。 DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。但研究表明，DMSO存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。 DMSO存在一定的毒性作用，用的时候要避免其挥发，要准备1%-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤. 在防冻剂中的应用纯DMSO 的冰点是18.45℃，含水40%的DMSO在-60℃不冻，而且DMSO与水、雪混合时放热。这种性质使DMSO可作为汽车防冻液、刹车油、液压液组分。乙二醇防冻液在超过-40℃低温时已不适用。而且比DMSO沸点低，有毒，易生产气阻。DMSO 防冻液在北部严寒地区用于除冰剂，涂料、各种乳胶的防冻剂，汽油、航煤的防冰剂，骨髓、血液、低温保存的防冻剂等。在细胞冻存中的应用二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温（零下200度）保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。二甲基亚砜（DMSO）是目前最好的细胞冻存保护剂，但也是一种以细胞毒性很大的化学试验剂。研究结果表明，培养液中DMSO 浓度为10%时，细胞生长抑制率近100%；1‰浓度时抑制率为35%，即使是0.04‰的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响。

作物种质资源保存现状及发展方向

作物种质资源保存现状及发展方向我国是世界上最古老的农业国之一，，有丰富的栽培和野生植物资源，被认为是栽培植物遗传多样性中心之一。据初步统计，我国重要栽培作物有600 多种，其中粮食作物30 多种，经济作物约90 种，蔬菜120 余种，花卉140 余种，果树约150 种，牧草约50 种，绿肥约20 种。在现有作物中起源于我国或在史前已栽培的有237 种。但由于人口迅速增长等原因，我国农业植物资源遭到严重的人为破坏和侵蚀，如野生稻、野生大豆及小麦近缘野生植物在原生长地已很难找到；外来种侵袭使土生土长的植物物种数减少，加上大量病虫天敌的减少，使作物病虫害加重；农业机械化和良种的大面积推广种植导致了大量地方品种被淘汰。在生产上种植的许多作物的骨干品种种质基础日趋狭窄，存在遗传脆弱性和突发毁灭性病害的隐患。为此，近20 年来，作为拓宽育种遗传基础的源头，种质资源的收集、保存及研究一直受到有关部门的高度重视，并取得令人瞩目的成就。种质资源保存过程中需要使用到的仪器有自动数粒仪。如今，作物种质资源保存利用体系已初步建立，根据作物繁殖方式等生物学特性，实行种质资源原生境保存与非原生境保存相结合的保存策略。原生境保存是指在植物原来的生态环境中建立保护区或保护地，使重要作物野生种及野

生近缘植物就地进行自我繁殖以保存种质。非原生境保存，即将种质保存于该植物原产地以外的地方，包括在低温种质库中进行的种子体保存、在种质圃中的植株保存、在试管苗种质库中的组织培养物保存等。种子保存技术有好多种，如低温储存技术。利用低温种质库保存种子，除贮藏温度较低外，作为种质保存的种子，还须经过生活力检测、干燥脱水、密封包装等一系列入库保存前处理。还有离体种质保存技术，许多植物种质资源无法通过种子贮藏达到资源保存的目的，如椰子、油棕、咖啡等是顽拗型种子，它们或不耐干燥脱水和低温贮藏，或作物不产生种子，这种植物不能采用低温库种子贮藏的方式，只能通过种质圃，以植株或块根、块茎等活体方式在田间保存。它包括试管苗组织培养技术和超低温保存技术。随着人们对种质资源保护的不断认识，国家对种质资源的研究也不断深入，从“七五”以来，作物种质资源收集保存一直被列入国家科技攻关项目，在1984 年建成我国自行设计建设的国家种质库1 号库（后改为国家种质分发交换库），又在在1986 年和1992 年建成了国家长期库和青海复份长期库。可见国家对种质资源保存的重视。通过国家的科技攻关，我国种质资保存技术研究已进入一个新的阶段，在国家库已建立一套先进的管理和种子入库前处理技术。通过系统地研究，解决了各种作物的安全有效干燥条件

斜面低温保藏法

斜面低温保藏法此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法．操作简单，使用方便，不得特殊设备，操作时，将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2-8℃冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有所不同，霉菌、放线菌及芽胞的菌保存2--4个月，移种一次；酵母菌两个月移种一次，细菌最好每月移种一次。此法的缺点是菌种容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，传代过多会使微生物的性状和代谢发生变异，在传代过程中，污染杂菌的机会也较多。因此，此法仅能用于工作用菌种的短期保藏，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，传代代数超过5代的菌种应灭菌处理后抛弃。 xxx食品检测中心作业指导书 1.目的规范实验室菌种的收集、使用、保管程序；确保实验室的安全。 2.范围本管理细则适用于实验室菌种的使用和管理。 3.职责 3.1菌种保管员：按照本指导书做好菌种的收集、转种、使用、保存和发放以及销毁工作。 3.2科室负责人：负责监督菌种的使用及管理。 4.管理细则本实验室保存的菌种仅包括一部分致病性较弱的三类细菌、一部分无致病能力的普通细菌和常见真菌。不包括病毒、螺旋体、衣原体、立克次体；保存的菌种主要用于各类培养基、检测试剂的性能测试和质量控制。 4.1在本实验室保管的菌种名 4.1.1保留工作菌种：大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌50013、福氏志贺氏菌2a ATCC12022、副溶血性弧菌200904-1、金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228溶血性链球菌23310、铜绿假单胞菌10211、普通变形杆菌，克雷伯氏杆菌，小肠结肠炎耶森氏菌A TCC 23715 、单核增生李斯特菌A TCC19111、枯草芽胞杆菌ATCC6633b 、蜡状芽胞杆菌A TCC11778、白色念珠菌A TCC10231、酿酒酵母ATCC9763、黑曲霉菌、展青霉菌、黄曲霉菌。 4.1.2常规检测,科研分离得到的有保留价值的三类/四类菌种根据需要可继续保留；如果在食品中分离到二类/一类菌种,及时送上级单位进一步鉴定,并按规定立即销毁。本实验室不保存一类、二类菌种。 4.2 菌种的保管 4.2.1实验室菌种保存于专用的菌种室。 4.2.2菌种保管员及科室负责人双人双锁负责保管菌种。 4.2.3使用菌种需提出申请、经科室负责人批准后，向菌种保管员领用。 4.2.4菌种应按规定的时间定期转种，一般每转种3代做一次鉴定，如发现污染或变异应及时处理。 4.2.5保管人员工作变动时应作好交接工作。 4.3 菌种的使用和保存

液氮超低温冻结保藏技术规范

液氮超低温冻结保藏技术规范 1. 目的规范液氮超低温冻结方法保存各类微生物菌种的操作，保证菌种长期保藏的质量和安全。 2. 范围本规程适用于各类微生物菌种的液氮超低温冻结保存。 3. 基本原则和要求针对接收的不同类群的微生物菌种资源，保藏中心应根据工作经验和微生物菌种提供人的建议，选择合适的冻结速度和保护剂系统，进行微生物菌种的液氮超低温冻结保存，以保证这些微生物菌种在长期保藏过程中的活性和稳定性。 4. 规程 4.1 准备冻存管 4.1.1 用蒸馏水浸泡、冲洗干净耐低温（聚丙烯）塑料冻存管，干燥后备用。 4.1.2 保藏中心应为保存菌种的每一支冻存管标注明确的标识，标签内容应至少包括菌种的保藏编号和制备批号（日期），可将保藏编号排在第一行，制备批号用连续的年月日（八位数字）表示，排在第二行，并根据冻存管的容积将标签裁成合适的大小。保藏中心应根据标签的放置位置选择符合要求的标签材质，以确保在长期的保藏过程中，标签不会发生自然或人为的脱落、污损。 4.1.2 将准备好的标签放置于冻存管规定的位置，加入或不加入合适体积的保护剂，拧上冻存管帽，装入塑料冻存盒中，1 公斤压力蒸汽灭菌30 分钟，备用。 4.2 准备保护剂根据需要保藏的微生物类别选择适宜的保护剂种类，按照配方配制、分装、灭菌备用。用于保存厌氧微生物的保护剂，应除去保护剂中的溶解氧。 4.3 菌种保藏 4.3.1 无菌操作将符合质量要求的、需要保藏的菌种接种在规定的培养基上，并尽量涂满整个斜面，置最适宜的条件下培养，单细胞微生物菌种培养至对数生长期后期（静止期初期），对于放线菌和产孢丝状真菌应培养至形成成熟的孢子。

超低温液氮冷冻技术在各行业中的应用

超低温液氮冷冻技术在各行业中的应用液氮液氮即液态氮气，分子量28.013，相对密度0.8081(-195.8 )，密度1.2507kg／m3(在0，l大气压时)，熔点-209.86，沸点-195.8，临界温度-147.05，临界压力3.39Mpa (33.5大气压)，临界密度0.31公斤／公斤，液态密度0.8l公斤／公斤(沸点)，蒸发潜热161.19千焦耳／公斤，定压比热1.034千焦耳／公斤·；热传导率2.28×10-4焦耳／厘米·秒·。为无色透明、无味、无毒之低粘度的透明液体，不导热导电，不自燃助燃，化学性质稳定，不与任何物质起化合作用。1单位体积的液氮可产生约650倍体积的氮气，氮气是空气的主要组成部分，在空气中的含量高达78％(体积)，液氮作为空气液化分离的最大宗产品、工业制氧的副产品，一般纯度达99．99％。液氮在常温下很容易气化，保存困难，运输携带也较麻烦，在无液氮生产的地区，应用受到限制。液氮是一个较为方便的冷源，因液氮特有的性质，已逐步受到人们的重视和认可，在畜牧业、医疗事业、食品工业、以及低温研究领域等方面得到越来越普遍的应用。在电子、冶金、航天、机械制造等方面应用不断拓宽和发展。一、在畜牧业方面的应用 1、广泛用于家畜冻配改良技术在多种家畜中，牛的精液冷冻制备、保存技术最为成功，自上个世纪五十年代已形成一套完整定型的工艺流程。牛精液冷冻的冷源普遍应用液氮。颗粒精液在经液氮冷却的氟板(聚四氟乙烯)、铜纱网、铝板上滴冻。要使承接精液的表面与液氮面保持——定的距离(1～2厘米)。在滴冻的过程中，要维持在-80～-120的温度。滴冻前将经过平衡的精液充分混匀，并检查精子的活率。滴要迅速，颗粒要均匀，每毫升经过稀释的精液滴10粒左右为宜。滴冻结束后，要停留2～3分钟，待所有颗粒已冻结立即投入液氮。经抽样检查(一般随机抽取2粒) ，解冻活率在0.3以上者，即可装于纱布袋中，经标记后在液氮中保存。每滴冻完一头公牛的精液后，必须更换氟板等用具。目前，细管的容量分0.25毫升和0.5毫升两种，由无毒塑料(聚氯乙烯)制成。管的一端填有棉塞和聚乙烯粉末，粉末遇水即固化自动封口，输精时又成为推送精液的活塞；另一端在注入精液后，可以聚乙烯粉或钢珠(或塑料珠)封口，要注意在封口处与精液间留有10～13毫米的空间，防止冷冻过程中因膨胀引起细管爆裂。超低温液氮冷冻技术在各行业中的应用精液的贮存牛的冷冻精液是以液氮做冷源进行贮存的，需要时可随时取出。为防止温度变化对精液品质的影响，取放动作要迅速，尽量减少在空气中停留的时间。从贮存容器中提取冷冻精液时，精液不应超过液氮容器的颈基部，避免因温度的回升造成精液解冻活率的下降。牛的冷冻精液已有40多年的历史。试验证明，保存至今的冷冻精液仍具有授精能力。但一般认为牛的冷冻精液随保存时间的延长，精子的活力和授精能力逐渐降低。牛冷冻精液长期保存的确切时限，尚需继续研究和观察。 2、家畜及多种动物的胚胎移植中，制备保存胚胎目前多采用胚胎冷冻仪，属智能型冷冻仪。该仪器采用微机控制技术，专用软件，能较准确地控制液氮的施放量，从而保证被冻存的生物制品以适宜的冷冻速率降温冷冻。 3、液氮超低温保藏微生物技术将菌种保藏在-196的液氮长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。大型真菌是菌物中的一个重要类群(菌物中形成大型子实体的一类真菌，泛指广义上的蘑菇或蕈菌)，很多种类具有较高的营养价值和药用价值，是目前菌物中最有开发应用前景的一类；此外，一些大型真菌能够分解枯死植物，对维持自然界物

菌种保藏的主要方法

菌种保藏（一）、菌种保藏的目的微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。（二）、菌种保藏的原理无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。（三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 2、石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。 3、砂土管保藏法

农作物种种质资源保护与利用

“农作物种种质资源保护与利用” 项目实施的主要经验、问题和建议一、项目实施的主要经验 1、对项目进行全面协调和跟踪管理是项目绩效目标全面完成的基本保证。本项目由农业部农业司主持，由中国农科院作科所牵头。项目参加单位包括国家长期库、复份库和10个中期库、32个国家种质资源圃，共38个科研、教学单位。项目涉及粮食作物、经济作物、蔬菜、果树、牧草绿肥等各类作物。项目内容包括资源收集（野外考察、国内征集、国外引种）、整理编目（形态及农艺性状观察、编目）、入库入圃（入中期库、长期库及资源圃）、鉴定评价（品质、抗病虫、抗逆境、精准鉴定或多项鉴定评价）、种质监测及繁殖更新（库圃保存种子或植株的活力监测及繁殖更新）、分发利用（数据库建立与完善、优异种质资源发布、田间展示、分发供种、信息反馈）等六个方面的若干内容，涵盖了种质资源保护和利用主要基础性工作。项目涉及资源、育种、植保、生物、生化、分类等多个学科，是一项重大的系统工程，搞好组织协调与合作，是项目目标完成的重要关键。作科所（原品资所）在以往多年种质资源研究中形成的资源保存和研究工作体系和网络，为本项目目标的完成提供了实施平台和基础，加上牵头单位在已有经验的基础上，加强了组织协调，不定期检查监督和年度会议检查，对项目顺利实施和绩效目标的完成发挥了重要作用。 2、相关技术规范的建立和完善为项目的实施和质量保证提供了技术依据。本项目实施前，各承担单位利用国家科技基础工作平台项目完成了《农作物种质资源技术规范》的制订和编写，出版了110多种作物资源描述规范和数据标准，一些作物还制定了鉴定评价行业标

准。这些规程和标准的制定，为本项目的顺利实施和质量提高提供了技术依据。由于鉴定评价标准统一，方法得当，结果准确，质量较高，获得了一批性状突出且可利用的优异种质；由于收集、保存、监测、更新均有规程和标准作依据，收集及更新入库种质质量大幅度提高。 3、项目重视公益性和服务性，强化了优异种质的示范展示，促进了资源的利用效率。项目强调了参加人员的服务意识，扩大优异资源的分发利用范围，增加了优异资源展示规模，通过展示和交流，吸引了更多利用者索取优异种质利用的积极性，同时也宣传了种质资源多样性保护的重要意义，争取到社会更多方面对种质资源事业的支持。二、项目存在问题与不足 1、项目经费力度太低，影响到资源保护与利用基础工作的正常开展。本项目涵盖了整个农作物资源保护基础性工作，项目的实施对21世纪我国农业的持续发展和生物多样性的保护具有长远战略意义，对这样一项关系国计民生的重要农业基础性工作，需要国家持续不断地给予强有力的支持，年度1500万的经费远难以维持现有库、圃种质资源保护基础工作的正常开展。由于经费太少，在项目计划时，一些库、圃放弃或减少了属本项目应做的工作内容，一些资源保护与利用上深层次的研究工作无法得到安排，影响到项目长期目标的实现，在作物种质资源领域也失去争取国际领先地位的可能。 2、科技队伍不稳，骨干人才贫乏，人员素质极待提高。稳定队伍，培养人才是当务之急。20世纪在种质资源工作实践中培养的技术骨干绝大部分已经退休，目前已有一批新生力量支撑着我国作物种质资源事业，但大部分未经专业系统培训，有的对种质资源工作还不

甘油冷冻保藏法

甘油冷冻保藏法本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。（1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。（2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。（3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。（4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。（5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。冷冻干燥保藏法（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6-7.5mm，长105mm，球部直径9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟，备用。（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7-10天。（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4-5分钟，即可使悬液结冰。（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa（0.7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持压力6-8小时即可。（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。滤纸保藏法（1）将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟。（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。（3）取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

作物种质资源保存技术

作物种质资源保存技术愁藻术.Technique Applicable 作物种质资源，又称作物品种资源、遗传资源和基因资源，它在作物各类品种、品系、类型、野生种或近缘植物中，是改良农作物的基因来源。种质资源保存主要通过原境保存、异境保存和离体保存3种途径。原境保存要建立自然保护区或天然公园，需大量土地，易受自然灾害侵袭;异境保存要建立各类基因库如种质保存栽培园等田间基因库、种子库和花粉库等;离体保存是将植物外植体在无菌环境中进行低温或超低温的组织培养。原境保存适合于珍稀的野生植物资源的保存，这里不再介绍。对于自然界中一般作物种质资源的保存，多应用异境保存和离体保存。目前，我国建有国家种质资源库，隶属农业部管理。现将种质保存的类型和方法介绍如下，以便根据种质资源不同类别、不同保存目的，采取相应的方法去操作、实施。作物种质资源保存技术悦祥营魏振杰李春娇毛英魁 (河南省滑丰种业滑县456450) 摘要种质资源保存有三种途径:原境保存、异境保存、离体保存。原境保存技术不再叙述，异境保存必须用当季新种子，入库前要登记作物种质相关资料，数量不少于1500粒，并在每个包装袋外加上标签;保存时，不同储藏库控住不同温、湿度，可储藏不同时间。

离体保存中低温保存时，可采用降低培养温度方法，也可用“饥饿法”，还可使用生长缓解剂方法;超低温保存，不适用于所有植物。关键词保存作物种质资源异境保存离体保存温度 1异境保存在异境保存中，应用最多最广泛的是建立低温种子库，即种质资源库。目前，低温储藏是种子体种质保存的最佳途径，其保存对象是农作物及其近缘野生植物，这些种质资源大多以种子作为载体。可以说，凡能通过种子繁殖维持物种遗传完整性的各类植物种质资源，都可存人种子库，但其种子必须是具有耐低温、耐干燥脱水性能的正常型种子。 1.1种子库的类型 1.1.1长期储藏库温度常年控制在一20一16-C, 相对湿度控制在50%以下，用于长期保存收集到的作物品种资源，包括农家种、野生种和淘汰的育成品种等。据理论推算，种子含水量5件、种植收获时间等。 %一8%，在此环境中寿命可延长二是种子数量最低不少于1500 至50年以上。发芽率监测结果，库粒，一般3000-5000粒或更多。存的大部分种子经过巧年储藏，发三是人库种子必须是当季新种芽率无明显下降。子，并对种子进行精选、生活力检 1.1.2中期贮藏库测、于燥脱水处理等，确保种子无温度长期控制在一6--20C，相明显病虫损害、无损伤，并去除破对湿度小于50%，其种子储藏寿命损粒、虫蚀粒、无胚粒、批粒、瘦在10-20年，所有种子可随时用于小粒和杂粒等，杂质不能超过2%, 科研、教学、育种研究及品种交换。不得用药剂处理或包衣处理。初始1.1.3临时储藏库发芽率一般要求高于90%，稀有种温度控制在4℃左右，主要用子芽率最低不低于85%，种子含水于人长期库前临时存放或科研育种量在原始水分不高于13%的基础单位储藏育种家种子、亲本种子或上，经干燥脱水处理，禾谷类5%- 育种材料的保存。其种子储藏寿命7%，大豆8%0 在3一5年。四是每份材料包装袋的内、外科研育种单位在申报国审品种都要有标签，标明品种名称、统一时，必须向国家种质资源库提供一编号、保存单位等，包装袋要结实定量的种子作为资源储备。同时国牢固，防漏、防潮、防混杂、防散

低温保藏在食品中的应用

低温保藏在食品中的应用随着科技的快速发展，人们对低温的研究越来越深入，应用也越来越广泛。低温加工中对肉制品的组织结构和性质破坏作用最小，低温贮藏时间长，效果好，认为是目前肉类贮藏的最优方法之一。不仅如此,低温保藏在乳制品中的应用也非常广泛。肉制品中含有丰富的营养物质，是微生物繁殖的优良场所，如果肉制品控制不当，外界微生物就会污染肉制品使其腐败变质，失去食用价值，严重的还会对人体产生有害的毒素，引起食物中毒。另外制品自身的酶在贮藏过程中也会产生一系列变化，若控制不当，肉制品就会变质。肉制品贮藏保鲜就是通过抑制或杀灭微生物，钝化酶的活性，延缓肉制品内部的变化，达到长期贮藏保鲜的目的。肉及肉制品贮藏保鲜的方法很多，如加热处理、干燥脱水．低温保藏、微波、辐照，高静压、高压脉冲，超声波等，在众多贮藏方法中低温保藏是应用最广泛，效果最好、最经济的方法之一，它是利用各种装置将食品的热量除去，使温度降到一定数值，以减轻食品受物理，化学变化及微生物繁殖的影响，在长时间内保持食品原有的色、香、味，形等品质的目的。低温贮藏时间长并且在低温加工中对肉制品的组织结构和性质破坏作用最小，低温保藏被认为是目前肉类贮藏的最优方法之一。 1.低温保藏的原理及方法分类引起肉制品腐败变质的主要原因是微生物的繁殖、酶的作用及氧化作用。从理论上讲，肉制品贮藏保鲜就是杜绝或延缓这些作用的发

生. 食品低温保藏是利用低温技术将食品温度降低并维持食品在低温状态以阻止食品腐败，延长食品保存期。低温保藏不仅可以用于新鲜食品物料的保藏，也适用于食品加工品，半成品的保藏。食品的腐败变质主要是由于微生物的生命活动和食品中的酶所进行的生物化学反应所造成的。低温导致微生物体内代谢酶的活力下降，使各种生化反应速率下降；低温使细胞内的原生质体浓度增加，黏度增加，影响细胞的新陈代谢，低温使细胞内的水分冻结形成冰结晶，冰结晶会对微生物产生机械损伤，而且由于部分水分的结晶也会导致生物细胞的原生质体浓度的增加，使得微生物细胞丧失活性。低温对食品物料的作用主要是抑制吸附在食品表面及周围微生物的活动，对其他生物也有类似的作用。低温可以降低活性食品的呼吸作用，延长贮藏期限；对于非活性食品，低温保藏条件下，食品中的水分生成的冰结晶会使微生物丧失活力而不能繁殖，酶的反应也会受到严重抑制，非活性食品体内的化学变化就会变慢。其他反应如氧化作用等亦会随着温度的降低而显著减慢。 2.食品冷藏的方法 (1)空气冷藏法是用空气作为冷却介质来维持冷藏库的低温，在食品冷藏过程中，冷空气以自然对流或强制对流的方式与食品换热，保持食品的低温水平。常用的方法有自然空气冷藏法和机械空气冷藏法。

种质资源

§3 种质资源重点：种质资源的概念，种质资源的重要性、保存、研究、创新与利用。难点：各类种质资源的特点。要求：了解作物起源学说的形成、发展和主要内容，明确种质资源的工作内容，掌握种质资源的概念、类别和利用。 §3.1 种质资源的重要性 §3.2 作物起源中心学说及其发展 §3.3 作物种质资源的类别及利用价值 §3.4 种质资源工作的内容 §3.1 种质资源的重要性 3.1.1 种质资源的概念用以培育新品种的原材料，过去称为育种的原始材料。在中国20 世纪60 年代初改称为品种资源。现代育种所利用的现有品种材料和近缘野生植物，主要是利用其内部的遗传物质或种质，所以现在国际上大都采用种质资源这一名词。在遗传育种领域内，把一切具有一定种质或基因的生物类型总称为资源(germplasm rmuce)。包括品种、类型、近缘种和野生种的植株、种子、无性繁殖器宫、花粉甚至单个细胞，只要具有种质并能繁殖的生物体，都能归入种质资源之内。又因为现代的遗传育种研究不但利用现有的种质资源,而且要进行染色体工程、基因工程，所以，遗传学上也常称种质资源为遗传资源(genetic remurees)。说到底，遗传、育种研究上主要利用的是生物体中的部分基因，甚至是个别基因，所以又称为基因资源(gene resources)。把蕴藏有形形色色基因资源等各种材料, 概称为基因库或基因银行。种质资源是在漫长的历史过程中, 由自然演化和人工创造而形成

的一种重要的自然资源, 它积累了由于自然和人工引起的极其丰富的遗传变异,即蕴藏着各种性状的遗传基因。是人类用以选育新品种和发展农业生产的物质基础, 也是进行生物学研究的重要材料, 是极其宝贵的自然财富。 3.1.2 品种资源在作物育种工作中的重要性 1. 品种资源是作物育种工作的物质基础作物育种成效的大小, 很大程度上决定于掌握种质资源的数量多少和对其性状表现及遗传规律的研究深度。品种资源是在长期自然选择和人工选择过程中形成的, 它们携带着各种各样的基因, 是品种选育和生物学理论研究不可缺少的基本材料来源。如果没有品种资源, 作物育种工作就成为“无米之炊”。筛选和确定作物育种的原始材料, 也是作物育种的基础工作。能否灵活地、恰当地选择育种的原始材料, 受作物品种资源工作的广度和深度的制约。 2. 作物育种工作的突破性进展取决于关键性基因资源的发现和利用国内外作物育种工作实践表明, 一个特殊种质资源的发现和利用, 往往能推动作物育种工作取得举世瞩目的成就，品种培育的突破性进展, 往往都是由于找到了具有关键性基因的种质资源。 20 世纪50 年代, 中国由于发现和利用了广东省的矮脚南特和广西省的矮仔占等水稻矮源, 从而育成了广场矮、珍珠矮等一批高产、抗倒的矮秆水稻良种，实现了品种矮秆化,使水稻亩产由200-250 公斤提高到300-350 公斤以至500 公斤。同时, 由于低脚乌尖这一水稻矮源的发现与利用, 进一步推动了世界范围的“绿色革命”浪潮。低脚乌尖原产于中国台湾及福建, 它现在几乎是世界所有国家矮秆水稻品种的祖先。台湾省以低脚乌尖为亲本,

关于病毒的液氮罐超低温保存法介绍

关于病毒的液氮罐超低温保存法介绍大多数微生物都可以用超低温来保存，超低温保存法是适用范围最广泛的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC1983；Halliday，Baker1985）。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC常用一种由甘油（10％）、二甲亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。 1材料病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（NuncCryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。 2方法（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm的热收缩塑料管。（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。

微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏

国家自然科技资源平台微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组二〇〇四年十二月十日

目次前言 (2) 引言 (3) 1范围 (4) 2规范性引用文件 (4) 3术语和定义 (4) 4内容 (5) 参考文献 (10)

前言本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。本规程主要起草人：张月琴、刘红宇、黄明玉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、陈敏、程池等。

引言微生物菌种资源的长期有效保藏是微生物菌种资源有效实施共享的前提，采用操作性简便、保藏周期长、遗传变异率低是菌种资源保藏方法的首要选择。

微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程 1 范围本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。 2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》 GB 19489 实验室生物安全通用要求科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件自然科技资源共性描述规范（试行） 3 术语和定义下列术语和定义适用于本规范。 3.1 冷冻干燥 freeze-drying 将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。 3.2 液氮超低温保藏 preservation in liquid nitrogen 液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。 3.3 -80℃低温冷冻保藏 preservation in -80℃

种质资源库建设方案

***国家级中草药种质资源库配套设施建设工作方案 ***国家级中草药种质资源保护和研究基地建设项目，于2014年开工建设，2016年建成。项目总共投资约8655万元。"***国家级中草药种质资源库"主要包括种子库、植物离体种质库、信息中心。位于***，正式启用后将使*** 乃至西北的药用植物种质资源得以保存。 ***中草药种质资源库从概念形成到竣工历时3年，建筑面积约560㎡。如运行后具体目标是在第一个5年内达到300种3000份（株），15年内达到1600种1.6万份（株）野生中草药种质资源。种质资源库因资金等原因缺少配套设备并未投入运行，只在田间进行中草药种质资源的繁殖工作，为保存现有的种质资源特制定此工作方案。 1、总体科学目标其总体科学目标是：建成一个依托***、立足西北、面向全国一流的野生中草药种质资源保护设施和科学体系，实现自动化管理的中药材种质资源库。使中国的药用植物种质资源安全得到可靠的保障，将对抢救、保存珍稀濒危药用植物种质资源，促进中药材新品种选育和中药材规范化栽培，填补生物资源种质保存系统的缺陷等具有重要意义。可有效保存中药材遗传资源，为中药产业可持续发展提供有力保障。

二、建立背景 ***是全国中草药主要产区之一，中药材产业在全国具有发展潜力和比较优势。全省14个市州的70多个县区均有中药材生产，中草药种类多，产量大，品质好，有特色，全省中草药品种9500多种，位居全国第二，是名副其实的中药材资源宝库。主要的中草药资源有1600多种，野生植物类1270种，其中动物类214种，矿物类43种，目前人工种植中草药350余种，分布较大的野生药用植物资源200余种。随着物种消失的速度不断加快，人们越来越意识到植物种子保护的重要性，而中药材种质资源是其中重要的一类。种质资源库作为***中草药种质资源保护领域的一个重点建设工程。将进一步促进校地科技合作，对***乃至西北的生物多样性保护和生物资源的可持续利用、对***的中医药产业科学发展和教育等都有非常重要的意义。种质资源库是具有重要影响的野生药用植物种质资源保藏设施，保藏能力将达到西北领先水平，并具有不可替代性。目前在临时仓库已收集保存约100种300份野生植物种子。 ***的自然、气候条件和生态环境,非常适宜多种中药材生长,中药材野生资源丰富,种植历史悠久。黄芪、党参、当归等道地药材的栽培已有上千年的历史,素有“千年药乡” 和“西北药都”之美称；早在南北朝时期,陶弘景所著《本草经集注》中就有“黄芪第一出***,色黄白,甜美,今亦难得”的记载；北宋《太平御览》所引的南北朝《秦州记》

病毒的超低温保存法

中华试剂网试剂·原料·仪器 https://www.360docs.net/doc/eb9407342.html, TEL: +86-21-34053660 Add: old humin Road, Shanghai 200237, P.R.C 病毒的超低温保存法大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10％）、二甲基亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。 2.2 材料病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。 2.3 方法（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。（8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。

市场上-86°C超低温保存箱型号

-86°C超低温保存箱DW-86W150型号介绍超低温保存箱，又称超低温冷藏箱、超低温冷柜、超低温冰箱等，温度范围从-60度到-180度不等，超低温保存箱可适用金枪鱼的保存、电子器件、特殊材料的低温试验，也是保存血浆、生物材料、疫苗、试剂、生物制品、化学试剂、生物样本等不可或缺的冷冻设备，我国超低温产品覆盖率极低，市场潜力巨大。 -86℃超低温保存箱采用微电脑控制，数码显示温度，箱内温度-40℃~-86℃可调，高低温报警控制，可根据需要设定报警温度点；采用多种故障报警，三种报警方式，确保使用安全，设置开机延时、停机间隔等保护功能，键盘锁定与密码保护功能，防止随意调整参数。在制冷系统上，-86℃超低温保存箱采用优化复叠制冷技术，独特的蒸发冷凝换热系统设计，制冷能力更强；采用进口国际名牌压缩机和国际名牌EBM风扇电机，制冷快，噪音低；采用无氟发泡、无氟制冷剂，绿色环保，呵护环境；超厚保温层，内外双层门，四层密封结构设计，锁住冷气，保温效果好，节省电能；在人性化设计方面，采用安全门锁设计，防止随意开启；高低电压自动补偿功能，安装压力平衡阀，开门更省力；专利设计抽屉式除尘过滤网，维护简单方便。测温孔设计，便于进行温度检测；可选配温度记录仪，冻存盒、冻存架，重型脚轮与止动调节螺钉设计，移动轻松，固定更方便，目前，该产品已经被科研院所、疾病防控、大专院校、生物工程、医院、血站、远洋渔业和电子化工等领域所使用，用来保存红细胞、白细胞、皮肤、骨骼、细菌、病毒、精液、生物制品、远洋制品等，电子器件

及特殊材料的低温试验等，由于质量过硬、性能优越、节能环保、制冷能力强，深受用户欢迎。 -86℃超低温保存箱DW-86W150 深冷技术设备属于高度定制化的非标设备，在工艺流程、产品性能参数等方面需具备跨学科的技术研发能力，对生产企业的技术能力要求较高。进军医用冷链设备领域以来，依托国家级企业技术中心的坚强后盾和旗下的专家智囊团，在深冷技术、恒温技术、智能技术、数控技术、节能环保技术等方面不断取得新的突破，尤其是-180℃、-150℃、-86℃超低温保存箱无论是深冷技术、制作工艺还是性能、质量均达到国际领先水平，使得深冷核心技术和竞争力不断得到提升，成为名副其实的深冷技术专家。